小麦矮腥黑粉菌及其近缘种的RPB2基因片段序列分析

以小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn）及其近缘种小麦网腥黑粉菌［T. caries （DC.）Tul.］、小麦光腥黑粉菌(T. laevis Kühn)和其他6种黑粉菌的DNA为模板,用RNA聚合酶II的第2亚基RPB2基因的通用引物RPB2-740F/RPB2-1365R进行PCR扩增。结果表明,3种小麦腥黑粉菌均能扩增出617 bp大小的DNA片段,供试的其他6种黑粉菌没有任何扩增产物。利用DNAMAN软件进行序列分析结果表明,3种小麦腥黑粉菌的RPB2蛋白基因序列的相似性为99.08%,存在17个碱基的差异。利用RPB2基因的通用引物作为小麦腥黑粉菌的内置对照引物,与小麦矮腥黑粉菌的特异引物CQUTCK2/CQUTCK3相结合可提高小麦矮腥黑粉菌检测的准确性。     

小麦矮腥黑粉菌侵染小麦子房的激光共聚焦显微观察方法

本试验利用碘化丙啶(propidium iodide)和Alexa Flour 488(AF 488)标记的麦胚凝集素(WGA)分别对小麦子房细胞和小麦矮腥黑粉菌进行染色,结合激光共聚焦显微镜成像系统获取小麦子房的三维立体图像。该技术可获得清晰的小麦子房细胞图像,并观察小麦矮腥黑粉菌在小麦子房中的侵染状况。该方法将为研究病原菌在寄主体内的分布提供可参考依据。     

小麦条锈菌细胞质效应子Hasp8抑制植物基础免疫

为明确小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici效应子Hasp8的功能,以小麦条锈菌CYR31侵染水源11小麦叶片的cDNA为模板,通过PCR技术扩增获得Hasp8基因的完整编码区序列,采用qRTPCR技术测定Hasp8基因的表达情况,利用农杆菌介导马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)瞬时表达体系在烟草上验证Hasp8基因是否能够抑制由Bax蛋白诱导的细胞坏死,将Hasp8基因构建到pCAMBIA1302载体用于在烟草上瞬时表达Hasp8进行亚细胞定位以明确该效应蛋白的作用空间;并将Hasp8基因构建到p EDV6载体上用于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens介导的瞬时表达系统以明确该效应蛋白是否能够抑制病原相关分子模式引发的免疫反应和效应蛋白诱导的免疫反应。结果表明,Hasp8基因编码117个氨基酸,N端含22 aa的信号肽;qRT-PCR结果显示,Hasp8基因在小麦条锈菌CYR31侵染小麦水源11的早期上调表达。烟草瞬时表达Hasp8基因能够抑制由Bax诱导的细胞坏死;烟草上亚细胞定位发现效应子Hasp8定位于细胞质和细胞核;荧光假单胞菌介导的抑制植物免疫试验结果显示效应子Hasp8能够抑制由荧光假单胞菌诱导的胼胝质积累,并且抑制由小麦条锈菌无毒性生理小种CYR23引起的过敏性坏死和活性氧积累,促进病菌的侵染,菌丝面积和菌丝长度增加。     

钴60—γ射线辐照灭活小麦矮腥黑穗病菌

小麦矮腥黑穗菌为我国进口植物检疫对象,进口的小麦原粮常带有病菌冬孢子,需进行检疫处理。试验探索钴60-γ射线辐照灭活小麦矮腥冬孢子的有效剂量,绘制致死曲线,并与小麦网腥、光腥病菌进行比较。     

小麦矮星检疫40年——中国植物检疫案例之一(续)

2 检疫科技合作 从1966年至今40年来，为了保证实施小麦矮腥病菌的检疫立足于生物学基础，促使中国在不同时期的检疫实践中实现了对小麦矮腥病菌的系统性研究，从比较形态学及近似种界定、病菌萌发生理寻求准确有效的检验鉴定技术开始，进行了小麦矮腥病菌的生物学和寄主病理学的研究。根据中国冬麦区不同的农业气候条件，运用生物气候相似距进行小麦矮腥病菌在中国冬麦区的潜在地理适存性研究。在病菌生态学和地理植病学的研究基础上，开展了小麦矮腥病菌在中国冬麦区的定殖风险区划研究、小麦矮腥病菌侵染能力的研究，相应地研究了小麦矮腥病菌的检疫处理，形成结合中国农业生产特点的具有创造性、系统性的小麦矮腥病菌检疫研究工作，为检疫治理提供了科学基础。以下将重点摘述中国进行小麦矮腥黑穗病菌检疫科研的几个主要方面。     

小麦矮腥厚垣孢子及其不孕细胞鉴别的一种方法

小麦矮腥黑穗病 Tilletia controverla Kuhn 是我国重要的对外检疫对象。每年我国在进口粮中经常截获小麦矮腥病瘿以及通过种子的洗涤检验的方法来检出小麦矮腥厚垣孢子。本方法是通过对被测的矮腥厚垣孢子的染色处理后进行的。     

小菜蛾Gadd45g基因的克隆、表达谱及RNA干扰对小菜蛾羽化过程的影响

为探讨生长阻滞和DNA损伤诱导基因Gadd45g对小菜蛾Plutella xylostella生长发育的影响及其对蜕皮激素类似物的响应,利用全长cDNA末端的快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆小菜蛾Gadd45g的全长序列并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术分析不同龄期及不同浓度虫酰肼处理后Gadd45g基因的表达水平;同时利用dsRNA注射法干扰蛹期小菜蛾Gadd45g基因,分析该基因对蛹期特异基因Br-Z2/3表达量及小菜蛾羽化进程的影响。结果显示,小菜蛾Gadd45g基因序列全长为1 479 bp,其中编码区序列长度为495 bp,可编码164个氨基酸,GenBank登录号为MW160738。小菜蛾GADD45γ蛋白与鳞翅目昆虫的GADD45同源性最高,与脊椎动物的同源性较低。Gadd45g基因在小菜蛾全龄期均有表达,其中在蛹期的相对表达量最高,显著高于其他龄期,并在蛹期和成虫期具有明显的性别表达差异;低剂量虫酰肼处理后小菜蛾Gadd45g基因相对表达量显著上升。干扰Gadd45g基因表达后小菜蛾蛹期特异基因...     

小麦矮腥黑穗病菌和普通腥黑穗病菌在几种灭活处理中的相关性分析

对小麦矮腥黑穗病菌和小麦普通腥黑穗菌(光腥和网腥)进行了60Co辐照、环氧乙烷熏蒸、直线加速器电子辐射等方法的灭活处理实验并进行了相关性分析.结果表明各处理对几种菌灭活效果基本一致.预示实验中的两种普通腥黑穗菌可做为矮腥黑穗菌的指示菌.     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。     

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S7片段的克隆及其S7-1基因编码蛋白的原核表达

为探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的种群变异并获得S7-1原核表达蛋白,采用RT-PCR技术扩增SRBSDV安徽分离物S7片段,并进行克隆、测序及序列分析,再利用特异性引物扩增该分离物S7-1基因并克隆到原核表达载体p ET-GST上,重组质粒p ET-S7-1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导及Ni~(2+)-NTA亲和柱纯化融合蛋白,再进行Western blot检测。结果显示,SRBSDV安徽分离物S7片段与其它SRBSDV各个分离物S7片段的序列相似性极高,达99.3%~99.9%,而与斐济病毒属Fijivirus其它种之间的序列相似性较低,为35.5%~73.3%。SRBSDV安徽分离物与其它SRBSDV各个分离物聚成1个单独的分支,彼此间亲缘关系较近。试验获得了分子质量约为68 k D的S7-1融合蛋白,且GST单抗能够与S7-1融合蛋白发生特异性反应,表明本研究得到的融合蛋白确为靶标蛋白。     

烟蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

为探讨UV-B胁迫对烟蚜Myzus persicae热激蛋白Hsp90基因表达量的影响,采用RT-PCR与RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白Hsp90基因的全长,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究了烟蚜Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下的表达量变化。结果表明,烟蚜Hsp90基因的cDNA全长为2 670 bp,编码728个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为82.6 kD,等电点为4.95,获得的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的1个签名序列及C末端MEEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。系统进化树结果显示,烟蚜Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同时长UV-B胁迫下烟蚜Hsp90均有表达,随着照射时间延长,Hsp90表达量表现为先上升后下降的趋势;与对照相比,照射时间为15、30、60、90和120 min时,Hsp90表达量均显著升高,且在60 min时Hsp90表达量达最大,是对照组的2.05倍。表明Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下差异表达,在烟蚜适应紫外胁迫的分子机制中具有重要作用。     

舞毒蛾DnaJ1基因克隆分析及对甲萘威胁迫响应

Dna J蛋白是Dna K/Hsp70的辅助分子伴侣,通过调节Hsp70的ATPase活性来影响蛋白复合体的合成与组装。为明确舞毒蛾Lymantria dispar的LdDnaJ1基因特性及对杀虫剂甲萘威的胁迫响应,通过克隆LdDnaJ1全长基因并运用实时荧光定量RT-PCR技术测定了甲萘威对其LdDnaJ1基因表达量的影响。结果表明,舞毒蛾Ld Dna J1全长基因开放阅读框为1 062 bp,编码353个氨基酸,分子质量为39.91 kD,理论等电点为5.65;舞毒蛾Dna J与柑橘凤蝶Papilio xuthus Dna J亲缘关系较近。甲萘威对舞毒蛾2龄幼虫24 h和48 h的致死中浓度LC50分别为74.04 mg/L和31.48mg/L。低剂量(LC_5、LC_(10)和LC_(30))甲萘威胁迫下,舞毒蛾2龄幼虫Ld Dna J1基因表达量均下调,LC_(30)甲萘威处理后72 h时LdDnaJ1基因表达量最低,仅为对照的15.70%。表明甲萘威可抑制舞毒蛾LdDnaJ1基因的表达,且呈现明显的时间和剂量效应。     

南方根结线虫MiV901基因在拟南芥中的异源表达及其表型分析

为明确南方根结线虫Meloidogyne incognita效应蛋白MiV901在其寄生过程中的生物学功能,通过构建MiV901基因的植物表达载体,利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的花序浸染法将其转化拟南芥Arabidopsis thaliana,并采用室内人工接种法测定转基因植株对灰葡萄孢 Botrytis cinerea侵染及南方根结线虫寄生的影响。结果显示：经Southern blot检测,MiV901基因以不同的拷贝数插入到转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12的基因组中,且qPCR检测结果证实 MiV901基因能够正常表达。3个转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12叶部接种灰葡萄孢3 d后,叶片上形成的病斑平均直径分别为1.00、1.06、1.05 cm,比野生型对照扩大了9.9%~16.5%。相比野生型对照,转基因拟南芥株系901-12、901-6和901-8接种南方根结线虫2龄幼虫后根系上产生了更多的雌虫和卵块,雌虫数分别显著增加了45.4%、34.4%和23.7%,卵块数分别显著增加了51.2%、 46.3%和31.7%。表明异源表达MiV901基因能够抑制植物免疫,增加拟南芥对灰葡萄孢和南方根结线虫侵染的敏感性。     

大丽轮枝菌效应蛋白VdSRP2的功能分析

为明确效应蛋白VdSRP2在大丽轮枝菌Verticillium dahliae中的生物学功能,从大丽轮枝菌落叶型菌株V592中克隆VdSRP2基因并进行生物信息学分析,利用酵母转化酶分泌系统对其信号肽活性进行测定,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术分析VdSRP2基因在大丽轮枝菌中的表达模式,并以V592菌株为材料获得VdSRP2基因的敲除突变体和过表达体菌株,通过表型分析和致病性测定确定VdSRP2基因的生物学功能。结果显示,VdSRP2基因编码232个氨基酸,含有5个半胱氨酸残基,N-端信号肽具有分泌活性,为真菌的典型效应蛋白;VdSRP2基因主要在大丽轮枝菌菌丝和微菌核中表达,其中经棉花根系诱导培养24 h时表达量最高;与野生型菌株V592相比,VdSRP2基因敲除导致大丽轮枝菌的产孢量和孢子萌发率显著下降,不能形成微菌核,对棉花的致病力明显减弱;但VdSRP2基因敲除不影响大丽轮枝菌的穿透能力;VdSRP2基因在本氏烟和棉花叶片瞬时表达不会诱导细胞死亡。表明VdSRP2是大丽轮枝菌微菌核形成必需...     

花鼠乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆、分析及原核表达

为研究花鼠乳酸脱氢酶C(lactate dehydrogenase C,LDH-C)对花鼠免疫不育控制的影响,以花鼠睾丸c DNA为模板,通过RT-PCR技术得到花鼠LDH-C基因c DNA编码区,并进行序列分析,构建花鼠LDH-C的原核表达载体,导入到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果显示:扩增出的c DNA片段为999 bp,编码332个氨基酸,含有完整的开放阅读框;负电荷残基与正电荷残基均为36个;预测蛋白质分子量为37k D,理论等电点为7.04,无信号肽和跨膜区,推测其是一种非分泌、疏水性蛋白。α螺旋、无规则卷曲以及延伸链是s LDH-C蛋白二级结构的主要成分。重组菌在IPTG诱导下获得了约37 k D带有His-Tag的目的蛋白。     

FKBP46对飞蝗卵滞育具有促进作用

为验证FK506结合蛋白46(FK506 binding protein 46,FKBP46)在调节飞蝗Locusta migratoria滞育中的作用,首先从飞蝗中克隆FKBP46,然后合成双链RNA,将其注入到飞蝗雌成虫体内进行干扰,观察干扰后钙调磷酸酶（calcineurin,Ca N）的活性和卵滞育率的变化。结果显示,短日照条件下,RNA干扰FKBP46后飞蝗卵滞育率显著降低,由97.44%降至78.59%;在长日照条件下,RNA干扰FKBP46后,所有飞蝗卵均成功孵化,与对照组无显著差异;FKBP46基因沉默后,飞蝗后足中Ca N活性分别从0.24 U/g上调至0.29 U/g,脂肪体中Ca N活性从0.21 U/g上调至0.30 U/g。表明在短日照条件下FKBP46负调控Ca N影响飞蝗滞育,FKBP46的沉默效应表明该调控基因可能是基于RNA干扰的飞蝗滞育控制的理想靶点。     

糖基转移酶基因TaUGT7分子表达特征及抗赤霉病作用分析

为研究小麦UDP-葡萄糖基转移酶7(UDP-glycosyltransferase 7,TaUGT7)的抗赤霉病功能,利用DNAMAN 6.0软件对Ta UGT7及其同源蛋白进行序列比对,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析经赤霉菌Fusarium graminearum和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）处理后的苏麦3号小穗中TaUGT7基因的表达特征,利用基因枪在洋葱表皮细胞瞬时表达TaUGT7-eGFP进行亚细胞定位,采用农杆菌介导法在小麦品种Fielder中过量表达TaUGT7基因并进行赤霉病抗性鉴定。结果表明,TaUGT7在氨基酸序列上与已知赤霉病抗性相关UGT相似性较低;TaUGT7在赤霉菌接种24 h后开始被诱导表达,在DON处理2 h后逐步被诱导表达;Ta UGT7蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中;qRT-PCR检测发现,TaUGT7在8株独立的过表达转基因株系中均有不同程度的上调表达;与野生型对照相比,过表达株系TaUGT7-395和TaUGT7-457中的平均病小穗率显著下降。...     

转cry2Ah-vp基因玉米的抗虫性鉴定

为获得新型抗虫转基因玉米,将通过群体筛选获得的具有抗虫性的转cry2Ah-vp基因玉米VP1-5采用PCR、Southern blot、实时荧光定量PCR(qPCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法进行阳性植株鉴定、拷贝数分析、转录水平和翻译水平分析,同时通过室内和田间生物活性测定鉴定转基因玉米VP1-5对东方黏虫Mythimna separata和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的抗性。结果表明,在转基因玉米VP1-5中cry2Ah-vp基因已整合到玉米基因组,以单拷贝的形式插入;cry2Ah-vp基因在转基因玉米VP1-5不同部位组织中均可以正常转录,在灌浆期叶片中的mRNA表达量最高,相对表达量为32.67,在灌浆期穗轴中的mRNA表达量最低,相对表达量为3.74;Cry2Ah-vp蛋白在转基因玉米VP1-5的6叶期各组织中表达量均较高,其中在叶片中的表达量达到2 155.18 ng/g FW,在抽雄期花丝中的表达量最高,达到2 165.86 ng/g FW;且转基因玉米VP1-5对东方黏虫有很高的杀虫活性,接虫3 d后幼虫死亡率达到100.00%;对亚洲玉米螟幼虫也有明显的生长抑制作用。表明转基因玉米VP1-5可作为玉米抗虫育种和害虫防治的种质资源。     

钙粘蛋白氨基酸点突变介导红铃虫对Cry1Ac的抗性

为明确室内筛选的红铃虫Pectinophora gossypiella抗性品系AQ-R对Cry1Ac的抗性机制,采用室内生物测定法明确该品系对Cry1Ac和Cry2Ab的敏感性,通过遗传杂交和基因克隆分析抗性基因的显隐性及突变位点,并进行细胞学试验分析突变蛋白的亚细胞定位。结果显示：红铃虫AQ-R抗性品系对Cry1Ac的抗性倍数为181.67倍,对Cry2Ab没有交互抗性;该品系携带了一种新型的隐性钙粘蛋白抗性等位基因PgCad1,其编码蛋白的钙粘蛋白重复区、前蛋白区和近膜区共发生了17个氨基酸替换。表达野生型PgCad1-s基因的Hi5细胞对Cry1Ac敏感,且钙粘蛋白定位于细胞膜;而表达抗性PgCad1-r基因的Hi5细胞则对Cry1Ac不敏感,且钙粘蛋白错误定位到内质网。表明钙粘蛋白氨基酸点突变能导致其定位错误,从而促成红铃虫AQ-R品系对Cry1Ac产生抗性。