利用双重PCR技术快速检测水稻细菌性谷枯病菌

根据水稻细菌性谷枯病ITS和gyrB基因,设计两对特异性PCR检测引物,建立了水稻细菌性谷枯病菌的双重PCR检测方法。用该方法对水稻细菌性谷枯病菌和其它植物源性细菌进行双重PCR扩增及灵敏度测试,并对采自不同地区的水稻样本进行水稻细菌性谷枯病菌的检测。结果显示,双重PCR方法能特异性地检测出8株水稻细菌性谷枯病菌,可从含水稻细菌性谷枯病菌浓度为102cfu/mL的菌液中检测出该病菌;采用该方法对我国不同地区的水稻材料进行检测,并未发现水稻细菌性谷枯病菌。     

利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌

 设计水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,并建立相应的PCR检测体系,分别对31株水稻细菌性条斑病菌和15株水稻白叶枯病菌及其它相关菌株进行了测试。结果表明,建立的PCR检测体系可专化性检测水稻细菌性条斑病菌,而水稻白叶枯病菌和其它菌株均没有扩增信号。检测灵敏度可以达到20个细菌菌体,从自然发病和人工接种发病的水稻种子成功地检测出条斑病菌。实现了对水稻细菌性条斑病菌的快速和专化性检测。     

利用双重PCR-DHPLC技术检测水稻细菌性谷枯病菌的研究

本研究建立了一种应用双重PCR结合变性高效液相色谱技术(polymerase chain reaction-denatured high performanceliquid chromatography,PCR-DHPLC)检测水稻细菌性谷枯病菌的方法。根据水稻细菌性谷枯病菌ITS序列(internal tran-scribed spacer)和gyrB基因序列,设计两对特异性PCR检测引物,对水稻细菌性谷枯病菌株和非水稻细菌性谷枯病菌株分别进行PCR-DHPLC及双重PCR-DHPLC检测,同时进行检测灵敏度及阳性菌株的同源性分析。结果显示,PCR-DHPLC检测的特异性强,灵敏度为菌浓度4×102cfu/mL,7株水稻细菌性谷枯病菌PCR产物同源性一致。该方法能简便、灵敏、高特异性地对水稻细菌性谷枯病菌进行高通量的自动化检测。     

利用多重PCR诊断水稻白叶枯病和细菌性条斑病的复合发生

为准确检测水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌及这两种病菌的复合发生,利用软件DNAStar分析比较这两种菌的部分核酸序列,设计了检测这两种病菌的特异性引物。引物Xoo F-Xoo R能特异性扩增出水稻白叶枯病菌中一条大小162 bp的条带;引物Xooc F1-Xooc R1和Xooc F2-Xooc R2能够分别特异性扩增出水稻细菌性条斑病菌中690 bp和945 bp的条带。通过优化PCR反应条件,成功建立了多重PCR技术,可以对不同国家的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌进行准确检测,对由这两种病菌引起的复合侵染实现了准确诊断。     

水稻细菌性谷枯病菌和水稻白叶枯病菌荧光RPA快速检测方法的建立

本研究分别针对我国进境植物检疫性有害生物水稻细菌性谷枯病菌及水稻白叶枯病菌建立了光RPA检测方法，并对其灵敏度、特异性以及对实际种子样本的检测能力进行了测试评价。结果表明，本研究建立的两种方法均能够在20 min内特异性检测到目标菌株，对水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)菌液的检测下限达到了11.4 CFU/反应，DNA检测下限达到了4.83×10^-5ng/反应；对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)菌液的检测下限达到了4.42 CFU/反应，DNA检测下限达到了3.83×10^-4ng/反应。两种方法均能够成功应用于带菌种子样品的快速检测。     

利用TaqMan探针检测水稻细菌性谷枯病菌

利用TaqMan探针建立了水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)实时荧光PCR检测方法。根据水稻细菌性谷枯病菌gyrB基因,设计并合成特异性引物和探针,对8株不同来源水稻细菌性谷枯病菌和其他同属或同寄主的参试菌株进行了检测。结果显示,该方法检测的特异性强,灵敏度可达菌悬液浓度102cfu/mL,该方法快速、简便、准确,适用于出入境检验检疫及种子健康检测领域。利用该方法对国内采集的83份水稻材料进行了检查,未发现阳性结果。     

MALDI-TOF-MS鉴定水稻细菌性叶鞘褐腐病菌的方法研究

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对3株水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（Pseudomonas fuscovaginae）标准菌株进行蛋白质指纹图谱分析,将不同培养基、不同培养时间和不同样品处理方法等条件下所收集到的质谱峰进行比较,筛选出最佳实验方法,收集20张参考图谱与水稻常见病原细菌质谱峰进行比较,建立该病菌的蛋白质指纹图谱。结果显示用金氏 B 培养基分离纯化后经提取处理法进行 MALDI-TOF-MS 分析为最佳的实验方法。该方法对检测与鉴定水稻细菌性叶鞘褐腐病菌具有较高的灵敏度和重复性,且分析过程简单快速,有一定的应用价值。     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌数字PCR检测方法的建立

基于水稻细菌性条斑病菌的假定膜蛋白基因和水稻白叶枯病菌的rhs家族基因分别设计引物和探针,建立了这两种病菌的数字PCR检测技术。特异性测试结果显示,两种检测方法均可特异性检测到目标病菌的供试菌株,而其他对照菌和空白对照均为阴性。两种检测方法对目标菌的检测下限分别达到了9个和16个拷贝/反应,且成功检测到人工模拟带菌及自然带菌种子样品中的病菌。     

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

Development of a variable number of tandem repeats typing scheme for the bacterial rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzicola

Xanthomonas oryzae pv. oryzicola is an important bacterial pathogen responsible for outbreaks of bacterial leaf streak (BLS) on rice, mostly occurring in Asia and parts of Africa. To better monitor epidemics and assess population structures, efficient tools that allow the precise identification and diagnosis of pathogenic populations are needed. In this study, we explored variable numbers of tandem repeats (VNTR) as a fast, reliable, and cost-effective molecular typing tool. Screening of three X. oryzae pv. oryzicola genome sequences (Philippine strain BLS256, Chinese strain GX01, and Malian strain MAI10) predicted 28 candidate VNTR loci. Primer pairs for polymerase chain reaction (PCR) amplification of all 28 loci were designed and applied to a panel of 20 X. oryzae pv. oryzicola strains originating from Asia and Africa. Sequencing of PCR amplicons revealed 25 robust and polymorphic VNTR loci that are shared among Asian and African X. oryzae pv. oryzicola strains. A dendrogram constructed from 25 VNTR loci indicated that most Asian strains are clearly discriminated from African strains. However, in agreement with previous reports, one strain from Mali is related to Asian strains, pointing to a possible introduction of Asian strains to the African continent. The new VNTR-based tool described here is useful for studies of population structures and epidemiological monitoring of X. oryzae pv. oryzicola.     

浙江水稻稻种病原细菌多样性研究

 1997~2000年间对以浙江平原、丘陵及山区为主的稻种病原细菌开展了种类、频率及传病率的研究。从303份稻种样本中分离出3906个菌株,经菌落形态、细菌学、致病性测定后获得201个致病或弱致病菌(占总数的5.15%)。选出致病及非致病代表菌株299个连同23个对照菌株用Biolog进行证实。结果表明种子上所带的病原细菌涉及到6个致病细菌种和5个弱致病种。平原稻区存在较多致病细菌种,山区较少,但两地均以弱致病细菌种占优势;丘陵的强致病细菌种的分离频率显著高于平原与山区。在稻种上携带的11个细菌种中,人工接种和自然感染的病稻种均能引起传病的有Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Pseudomonas fuscovaginae及Acidovorax avenae subsp.avenae.     

Rep-PCR技术对中国水稻条斑病菌的遗传多样性初析

 采用Rep-PCR技术,对30个水稻细菌性条斑病菌株(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)进行遗传多样性分析,同时对李氏禾条斑病菌等其它10个参试菌株也进行了比较。Rep-PCR是利用一些基于细菌的短的重复序列引物(ERIC和BOX)的DNA扩增特性,2种引物组合的电泳图谱结合并分析,以水稻细菌性条斑病菌各自的指纹谱型在相似率80%时可分为6簇,初步表明我国水稻细菌性条斑病菌群体的遗传分化明显;发现自然界存在的弱或无毒性菌株与毒性菌株的Rep-PCR指纹图谱差异很大;毒性菌株的遗传分簇与其致病性具有一定的相关性。用ERIC扩增水稻条斑病菌基因组DNA的指纹比BOX更为多样,两者对菌株的分辨率不同。因此,Rep-PCR技术可有效地用于监测水稻细菌性条斑病菌的遗传变异,还可应用于菌株的鉴定和分类学研究。     

水稻品种与水稻细菌性条斑病菌的互作机制

水稻叶片接种3d后，水稻细菌性条斑病菌开始在叶片上大量增殖；接种10d后，病菌数量开始保持相对的稳定，但感病品种上的菌量比抗病品种上的菌量在10倍左右，病斑在接种后第3d开始出现，接种10d以后，病斑在感病品种上能继续快速发展，而在抗病品种上开始受到抑制，通过对抗病和感病品种叶片上的气孔观测发现，感病品种的气孔密度和气孔长度一般都较抗病品种大，相关分析表明，气孔长度理发师品种抗性相关。接种后对PAL酶的活性测定结果表明，PAL酶的活性与品种抗性呈负相关关系。     

我国水稻白叶枯病和条斑病发生与防控研究进展

培育和种植抗病品种和研发新型绿色杀菌剂是防治水稻白叶枯病和条斑病的有效措施。最近几年有关稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae致病效应蛋白调控水稻抗(感)病性研究取得了突破性进展, 为水稻抗性品种培育提供了新思路、新策略。本文对稻黄单胞菌-水稻互作系统中已知的TALE效应蛋白与水稻抗(感)病基因(R 或 S)的对应关系进行了归纳, 就tal基因与水稻R或S基因的协同进化进行了分析, 结合生物农药和高效低毒杀菌剂的应用现状, 提出了我国水稻白叶枯病和水稻条斑病绿色防控关键策略。     

水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究

从江苏省南京、泰州、扬州和宿迁等地区水稻田采集水稻病叶、健叶、根围土等样品90份,分离纯化得到1173个细菌分离物,对其进行水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzaepv．oryzicola皿内抑制试验,共获得12株拮抗能力较强的细菌,其中4株拮抗细菌抑菌圈直径大于27mm。盆栽试验结果表明,12株拮抗能力较强的细菌中有4株对水稻细菌性条斑病菌防效大于50％,其中菌株Lx-1l盆栽防效达62．5％。大面积示范试验结果表明菌株Lx．11田间防效达60．2％,显著高于化学药剂20％叶枯唑的防效（51．2％和45．8％）。形态特征、理化特性和分子鉴定分析确定菌株Lx．11为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。     

水稻黄单胞菌致病相关基因插入突变体系的建立

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）和条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）是水稻上的模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病（bacterial blight, BB）和细菌性条斑病（bacterial leaf streak, BLS）。为了精确和高效地实现目的基因的突变,本研究利用pK18mobGⅡ载体,建立了一套适于Xoo和Xoc目的基因定点插入的突变体系。通过同源片段与目的基因间的同源重组,成功获得了Xoo和Xoc的hrcV和hrpF突变体。PCR和Southern杂交证实：pK18mobGⅡ携带不同大小的同源片段,能够整合于hrcV和hrpF的特定位点;200～400 bp的同源片段能够获得最佳的突变效率;两亲接合的转化效率是电转化的5～100倍。毒性测定结果显示,hrcV基因决定着Xoo在水稻上的致病性。致病相关基因插入突变体系的建立为研究水稻黄单胞菌与水稻互作中致病相关基因的功能奠定了遗传学研究基础。