江苏朱槿上分离到的木尔坦棉花曲叶病毒基因组结构特征分析

 2012年5月,江苏南京朱槿上出现一种新的病毒病害,病株表现明显的叶片上卷、叶脉肿大、叶背伴有耳突、植株矮缩等症状。根据其症状及介体发生状况,对其伴随的病毒种类进行研究,结果发现采集的46份典型症状样品体内均可以检测到粉虱传双生病毒,对其基因组DNA-A组分克隆测序后发现其全长2 736 bp,编码6个ORF,BLAST分析显示该病毒与木尔坦棉花曲叶病毒同源性最高(99.9%),是木尔坦棉花曲叶病毒的一个分离物。病样中同时还检测到伴随DNAβ卫星分子,测序结果显示该卫星全长1 346 bp,编码1个ORF,BLAST及聚类分析结果显示该β卫星与木尔坦棉花曲叶病毒β卫星同源性最高(99.7%),为木尔坦棉花曲叶病毒β卫星的一个分离物。这是木尔坦棉花曲叶病毒首次在长江流域的报道。     

侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定

从广东广州扶桑和广西南宁棉花中分离得到木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)的2个分离物GD37和GX01,序列分析表明两分离物的基因组全序列同源性为99.4%,卫星分子序列同源性为99.2%。构建了GD37和GX01的侵染性克隆,农杆菌接种表明CLCuMV GD37能侵染本氏烟、心叶烟、三生烟、普通烟,GD37和GD37β共同接种产生叶片下卷、植株矮化等症状,但不能侵染棉花、番茄、矮牵牛;而分离自棉花的CLCuMV GX01能够侵染本氏烟,GX01和GX01β共同接种在本氏烟上产生叶片下卷皱缩等症状,但不能侵染棉花。Southern-blot结果表明在GD37单独侵染或与GD37β共同侵染的植株中均能检测到相应DNA分子的积累。     

侵染垂花悬铃花的木尔坦棉花曲叶病毒分子特征研究

 垂花悬铃花曲叶病是近期在广东发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲,叶脉肿大,叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示, 该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物（GD11）DNA-A全长为2 737 nt,具有菜豆金色花叶病毒属病毒基因组典型特征,为闭合环状单链DNA,编码6个ORFs;该序列与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)各分离物序列的相似性均大于89.0%,其中与G6、Okra06及GX1等分离物序列的相似性大于99.0%。该病毒分离物也伴有卫星DNA β分子,其全长为1 348 nt,与CLCuMV各分离物的DNA β序列相似性大于85.0%,其中与G6、Okra06及GX1等DNA β的序列相似性均大于99.0%。因此,侵染广东垂花悬铃花的病毒分离物属于CLCuMV,且与入侵我国的朱槿分离物G6、黄秋葵分离物Okra06及棉花分离物GX1亲缘关系很近。本文首次报道了CLCuMV及其卫星β复合侵染垂花悬铃花。     

福州市发生由木尔坦棉花曲叶病毒引起的朱槿曲叶病

棉花曲叶病是世界棉花生产上最具毁灭性的病毒病害,其主要病原木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curlMultan virus,CLCuMV)已经入侵我国广东、广西、海南等省多个地理区域,扩散危害范围日益加大.2011-2012年调查发现福建省厦门、福州和宁德等多个城市绿化植物朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)发生朱槿曲叶病的流行.应用双生病毒通用引物以及烟粉虱生物型鉴定的通用引物,通过PCR扩增、序列分析等方法,分别检测或鉴定了福州市朱槿曲叶病的病原、介体烟粉虱的生物型以及朱槿病株上烟粉虱的带毒率.结果显示:福州市朱槿曲叶病的病原是木尔坦棉花曲叶病毒,与CLCuMV广东分离物和广西分离物的相似性高达99.6％以上;介体烟粉虱生物型为B型,病株上烟粉虱的带毒率为100％.试验结果说明CLCuMV已经扩散至福建省,应警惕和控制木尔坦棉花曲叶病毒的进一步扩散和危害.     

海南红麻曲叶病的病原检测与鉴定

 红麻曲叶病是2012年在海南省海口市发现的一种新病害,病株表现为叶片向上卷曲、叶脉肿大、叶脉变深绿色等症状。PCR检测结果显示,该病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。基因克隆及序列分析结果表明,该病毒分离物(HN08)基因组仅含A组分(DNA-A),其全长为2 738 nt,与木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMuV)各分离物的相似性均大于89.0 %,其中与中国各分离物的相似性均大于99.0 %。该病毒分离物也伴随有β卫星分子,其全长为1 346 nt,与CLCuMuV各分离物伴随的β卫星分子(CLCuMuB)序列相似性大于83.0 %,其中与分离物Fz1的序列相似性最高,为99.7 %。构建了HN08 DNA-A及其β卫星分子侵染性克隆,通过农杆菌注射接种红麻,接种后30 d,HN08 DNA-A及其β卫星分子混合接种的红麻植株新出叶片开始产生曲叶症状;接种后60 d,二者混合接种的植株大部分叶片表现为严重的曲叶症状,且与田间自然病株症状相同,而二者各自单独接种的红麻植株没有产生明显的症状。PCR及Southern blot检测进一步证实这些症状是由HN08 DNA-A及其β卫星分子的共同侵染引起的。因此,海南红麻曲叶病是由CLCuMuV及其伴随的β卫星分子(CLCuMuB)共同侵染引起的。本文首次报道了红麻是CLCuMuV自然新寄主。     

南宁市朱槿曲叶病毒病病原分子鉴定和寄主范围研究

［目的］ 明确南宁市朱槿曲叶病毒病的病原及其寄主范围,初步了解各朱槿品种的抗病性。［方法］ 对采自南宁市区的朱槿病株分离物进行分子鉴定及寄主范围测定;进行朱槿曲叶病毒病发生情况调查,根据发病率高低和症状轻重对南宁市常见的朱槿品种抗病性进行初步评价。［结果］ 基因克隆与序列比较结果表明,该病的病原为木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus, CLCuMV）,其DNA A全长含2 737个核苷酸,伴随有卫星DNAβ分子,分子大小为1 346个核苷酸;研究发现该病毒可以通过B型烟粉虱传播,烟粉虱接种和PCR检测试验〖JP2〗结果表明,该病毒可侵染朱槿、红麻、棉花、西菲葵、黄蜀葵等5种供试的锦葵科植物,表现典型曲叶症状;初步调查评价结果,‘朱砂红朱槿’、‘泰国黄朱槿’、‘重粉朱槿’、‘锦球朱槿’和‘马旦朱槿’属于高度感病品种;‘阿美丽坚朱槿’、‘乳斑朱槿’属于感病品种;‘大红朱槿’、‘大红花’和‘粉喇叭’属于中抗品种;‘红龙朱槿’、‘红喇叭’、‘青杆吊钟’和‘七彩朱槿’属于高抗品种。［结论］ 上述结果可为有效控制朱槿曲叶病毒病提供依据。     

传播木尔坦棉花曲叶病毒的烟粉虱隐种鉴定

为明确广东地区传播木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCu Mu V)的烟粉虱隐种,采用分子鉴定、烟粉虱传毒试验与分子检测的方法,对传播CLCu Mu V的烟粉虱隐种进行了鉴定。结果表明:在广东棉花、红麻和黄秋葵曲叶病发生的田间,2014年采集的30头烟粉虱mt COI与Asia II 7隐种序列同源性为98.3%~99.6%,2015年采集的10头烟粉虱中,8头烟粉虱mt COI与MEAM1隐种序列同源性为99.2%~99.5%,2头烟粉虱mt COI与Asia II 7隐种序列同源性为99.8%~99.9%,说明烟粉虱种群包括入侵隐种MEAM1和土著隐种Asia II 7。在利用烟粉虱人工传毒试验中,MEAM1、Asia II 7和Asia II 1这3个隐种均可在棉花曲叶病株上饲毒获得CLCu Mu V及β卫星分子;除MEAM1隐种外,Asia II 7、Asia II 1隐种可传播CLCu Mu V,侵染红麻及黄秋葵植株引起曲叶病,前者传毒效率分别为50%和100%;而后者为33%和100%。以上3个烟粉虱隐种传毒接种棉花未见成功。     

2种单组份双生病毒与异源卫星DNA的互作

 烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV) Y35分离物(Y35)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV) Y10分离物(Y10)是从云南烟草上分离的2种单组份双生病毒,分别伴随卫星DNAβ(Y35β及Y10β)分子。将Y35和Y10分别伴随其同源或异源卫星(Y35β或Y10β)接种本氏烟和心叶烟,症状观察表明,无论Y10还是Y35伴随异源卫星DNAβ时引起的症状均与其伴随同源DNAβ引起的症状明显不同,且Y10β伴随Y35致病性最强。Southern印迹结果表明,Y10β及Y35β均可被异源辅助病毒稳定复制,但其复制水平明显低于伴随同源病毒时的水平,且植株中病毒和卫星的积累量并不完全与症状严重程度直接相关。     

侵染曼陀罗的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNAβ全基因组结构特征

 从云南大理曼陀罗上采集到病毒分离物YN72,症状表现为叶脉增厚、叶片褪绿、植株矮化。全序列测定表明,YN72DNA-A全长2739个核苷酸。基因组比较发现,YN72DNA-A与中国番茄黄化曲叶病毒分离物(TYLCCNV-[Y43])同源性最高(93.4%),与中国番茄黄化曲叶病毒烟草分离物(TYLCCNV-[Y5])的同源性次之(92.9%),而与亚洲地区的其它双生病毒的同源性均在90%以下,表明曼陀罗中的分离物YN72是TYLCCNV的1个分离物。利用WTGs卫星分子DNAβ的特异性引物beta01和beta02,在YN72中PCR扩增到DNAβ分子。序列分析表明,YN7213全长1335个核苷酸,在其互补链上编码1个有功能的ORF(C1)。YN72β的全序列与TYLCCNV分离物卫星分子Beanβ和Y297β的同源性最高,分别为99.8%和99.3%;与其它所比较的DNAβ的同源性均低于80.6%。系统进化树研究表明,YN72卫星分子DNAβ与其辅助病毒是共同进化的。     

广东黄秋葵黄脉曲叶病样中检测到烟粉虱传双生病毒

黄秋葵是近几年来从日本和我国台湾引进的一种蔬菜作物。近期,广东的黄秋葵上发生了黄脉曲叶病。病株的典型症状表现为叶脉黄化,在叶片正面形成网络状,在叶背面叶脉肿大突起明显,病株幼叶小且向下卷曲,甚至整片幼叶黄化。植株早期被感染表现矮化。在发生黄脉曲叶病的黄秋葵田间,其病株率高达60%以上。用烟粉虱传双生病毒简并引物对随机采集的病样进行PCR检测,从这些病样中均能扩增出1条预期大小为570 bp的特异片段;基因克隆及测序分析结果表明,与该特异片段同源的均属双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒DNA,其中与木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus, CLCuMV）分离物G6相似性最高,为99%。这些研究结果表明,广东黄秋葵黄脉曲叶病中存在烟粉虱传双生病毒,该病害可能也是由CLCuMV侵染引起的。     

First natural co-occurrence of tomato leaf curl New Delhi virus DNA-A and chili leaf curl betasatellite on tomato plants (<Emphasis Type="Italic">Solanum lycopersicum</Emphasis> L.) in India

Tomato leaf curl disease (ToLCD) affected 25% of the tomato crop in Chitrakoot, India and symptomatic leaves were collected for molecular assay. The complete sequences of bipartite begomovirus DNA-A and a betasatellite DNA were amplified. In a sequence analysis, begomovirus DNA-A and betasatellite shared highest sequence identity (91–99%) with Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) DNA-A and chili leaf curl betasatellite (ChLCB), respectively. The virus was transmitted by whitefly to tomato plants and caused ToLCD symptoms with 70% transmission rate. To our knowledge, this is the first report of the natural occurrence of ToLCNDV and ChLCB in India.     

侵染假酸浆的泰国番茄黄化曲叶病毒全基因组结构特征

为明确假酸浆Nicandra physalodes叶片黄化、皱缩症状是否由菜豆金色花叶病毒属病毒侵染引起,本研究利用分子检测方法和生物信息学技术鉴定了假酸浆样品中的病毒种类。从采集的病样中克隆并获得了2条菜豆金色花叶病毒属病毒DNA-A全序列和1条beta卫星全序列,经全序列分析发现,该双生病毒的两条DNA-A全序列与泰国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl Thailand virus, TYLCTHV)云南分离物TYLCTHV-YN1732一致性最高,达99.3%,亲缘关系较近;beta卫星的全序列与云南番茄曲叶beta卫星(tomato leaf curl Yunnan betasatellite, TLCYnB)的分离物YN5230一致性最高,达99.3%,亲缘关系较近。重组分析显示,假酸浆上分离的TYLCTHV-YN5735-12是一个重组病毒,有两个重组事件,一个主要发生在AV1的编码区,由中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)和广西大戟曲叶病毒(euphorbia lea...     

Association of Tomato leaf curl Joydebpur virus and a betasatellite with leaf curl disease of eggplant

Leaf samples (five) from brinjal/eggplant fields showing upward leaf curling symptoms were collected from Varanasi, Uttar Pradesh state, India. The full length genome of begomovirus and associated betasatellite were amplified by PCR, cloned and sequenced. Sequences of homologous DNA-A and its betasatellite in all samples were the same. The samples failed to amplify DNA-B, suggesting that the begomovirus associated with leaf curl disease of eggplant was monopartite. The complete genome (homologous of DNA-A) consists of 2758 nts, whereas the betasatellite has 1352 nts and the genome organization is typical of Old World begomoviruses. The sequence analysis showed high levels of nucleotide sequence identity (79.8–91.7%) of virus with Tomato leaf curl Joydebpur virus (ToLCJoV) infecting chilli in India, suggesting it as a strain of ToLCJoV based on the current ICTV taxonomic criteria for begomovirus strain demarcation. However, the betasatellite associated was identified as a variant of Tomato leaf curl Bangladesh betasatellite (ToLCBDB), with which it shared highest sequence identity of 84.7–94.8%. Phylogenetic analyses of the genome further supported the above results. The recombination analyses of both genome and betasatellite showed that a major part of genome sequences are derived from begomoviruses (ToLCJoV, ChiLCuV, AEV) infecting chilli, tomato, ageratum and betasatellite from PaLCuB as the foremost parents in evolution, suggesting this as a new recombinant virus strain. This is the first report of a monopartite begomovirus and a betasatellite molecule associated with the leaf curl disease of eggplant.     

云南凹头苋上分离到的2种菜豆金色花叶病毒属病毒基因组结构特征

菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒是热带亚热带地区多种作物的重要病原,杂草作为该属病毒的中间寄主在病害发生流行中具有重要作用。本研究通过克隆、测序和生物信息学分析,对3株具有曲叶症状的凹头苋(Amaranthus lividus)进行菜豆金色花叶病毒属病毒的分离分析。从这些凹头苋中共分离到2种菜豆金色花叶病毒属病毒和3种beta卫星。序列分析显示,其中一种病毒与云南番茄黄化曲叶病毒相似性最高(96%),另一种与中国胜红蓟黄脉病毒相似性最高(96.5%或91%)。Beta卫星的分析显示,其中一种与云南番茄黄化曲叶beta卫星相似性最高(94.3%),另一种与赛葵曲叶beta卫星相似性最高(92%),最后一种与中国番茄曲叶beta卫星相似性最高(91%)。重组分析表明,分离物YN4331-69是一个重组病毒,是由中国胜红蓟黄脉病毒YN4326-60和一个尚未发现的菜豆金色花叶病毒属病毒重组形成。这是首次报道凹头苋被不同的菜豆金色花叶病毒属病毒及其伴随的beta卫星侵染,表明凹头苋是一个适宜该属病毒的中间寄主。     

木尔坦棉花曲叶病毒已对我国棉花生产构成严重威胁

木尔坦棉花曲叶病毒是引起巴基斯坦和印度棉花曲叶病流行的主要病原之一,是由烟粉虱以持久方式传播。近年来,在广东和广西分别发现了严重侵染朱槿和黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒。虽然广东和广西不种植棉花,但该病毒传播介体烟粉虱在广东、广西及我国棉花产区都有分布。因此该病毒的入侵,对我国棉花生产构成严重威胁。