苦瓜枯萎病菌Ⅱ型卤酸脱卤酶基因FoHAD-type Ⅱ功能分析

苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.momordicae Sun&Huang)侵染引起的一种严重制约苦瓜安全生产的土传病害。明确苦瓜枯萎病菌的致病机理对苦瓜枯萎病的防治具有重要的指导意义,但目前苦瓜枯萎病菌的致病机理尚不明确。前期分析苦瓜枯萎病菌强致病力菌株SD-1和弱致病力菌株SD-V(携带真菌病毒)转录组差异表达基因时,发现Ⅱ型卤酸脱卤酶(FoHAD-typeⅡ)基因在SD-V菌株中表达量显著下调,推测该基因与苦瓜枯萎病菌的致病性相关。本研究根据同源重组的原理,利用分割标记法(Split-Marker PCR)获得了FoHAD-typeⅡ基因的融合片段,分别通过PEG介导的原生质体转化和农杆菌介导的遗传转化获得该基因的敲除突变体和回补突变体,并对敲除和回补突变体的生物学特性和致病力进行了分析。结果表明,敲除突变体的生长速率和产孢量与野生型菌株相比没有显著差异,菌丝尖端形态和孢子形态也无明显差异,但气生菌丝减少,对渗透胁迫耐受性降低,致病力显著下降;回补突变体的生物学性状和致病力与野生型菌株一致。表明FoHAD-typeⅡ基因...     

金属蛋白酶FocM352在香蕉枯萎病菌热带4号生理小种侵染过程中的功能

香蕉枯萎病菌热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)严重威胁世界香蕉产业的可持续发展，一些特殊功能的蛋白在其侵染过程中起重要作用。我们分析Foc TR4接种巴西蕉后的转录组数据发现M35金属蛋白酶(metalloprotease 35)同源基因FocM35＿2在病原菌侵染初期受诱导显著上调表达，经同源重组法敲除该基因，突变体致病力显著下降，菌丝生长速率降低，产孢量略微减少，回补突变体则可以恢复其致病力和生长发育；与野生型菌株相比较，突变体对外源氧胁迫、渗透压和细胞膜压力更敏感；在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中的瞬时表达结果显示该蛋白定位于质外体，并引起叶片产生超敏反应(HR,hypersensitive response);该蛋白的缺失还能够诱导寄主更高水平几丁质酶的活性。因此，FocM35＿2是促进Foc TR4侵染寄主的的重要致病因子。     

MfMel1基因参与调控桃褐腐病菌对桃果实的致病力

为明确MfMel1基因在桃褐腐病菌Monilinia fructicola中的功能,利用生物信息学软件对该基因的结构、所编码蛋白的保守结构域以及进化关系进行分析;通过遗传转化方法对该基因进行敲除,并进行表型分析。结果显示,敲除转化子△MfMel1菌株的菌丝生长速率、孢子萌发率与野生型菌株Bmpc7均无显著差异,但产孢量显著降低。△MfMel1菌株在0.01%SDS、600μg/mL刚果红、150 g/L甘油、200 g/L蔗糖、6 mmol/L H2O2、4%NaCl和1.2 mmol/L山梨醇培养基上的生长速率、菌丝形态均无显著变化,但对200 g/L葡萄糖的渗透胁迫敏感性增强。敲除转化子△MfMel1菌株的α-半乳糖苷酶活性明显降低,对桃果实的致病力显著下降。表明MfMel1基因在桃褐腐病菌中可能通过参与调控α-半乳糖苷酶酶活,从而参与病原菌的致病。     

小RNA生物合成途径主要元件调控稻瘟病菌生长发育和致病性

为探究小RNA生物合成途径主要蛋白在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae生长发育、胁迫响应和致病过程中的作用,在野生型菌株Guy11背景下,分别构建其单基因敲除突变体ΔMoago3、ΔModcl2、ΔMordrp2和双基因敲除突变体ΔMoago3ΔModcl2、ΔMoago3ΔMordrp2、ΔModcl2ΔMordrp2,并测定不同突变体的营养生长、产孢过程、对不同胁迫的响应、致病性及侵染菌丝类型。结果显示,仅双基因敲除突变体ΔMoago3ΔModcl2和ΔMoago3ΔMordrp2的菌落直径较野生型菌株Guy11显著减少;突变体ΔModcl2和ΔModcl2ΔMordrp2的产孢量分别显著下降至野生型菌株Guy11和突变体ΔMordrp2的66.67%;十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate,SDS）、NaCl、山梨醇和H2O2胁迫对各突变体的抑制率影响不显著,但在刚果红胁迫下,突变体ΔMoago3、ΔMordrp2和ΔMoago3ΔModcl2的抑制率均显著高于野生型菌株Guy11的抑制率;与野生型菌株Guy11相比,突变体ΔMoago3、ΔModc...     

基于原生质体转化的甘蔗梢腐病菌YN41基因敲除体系的构建

基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段,为了深入研究甘蔗梢腐病菌致病基因的功能,构建了梢腐病菌YN41菌株的基因敲除体系。本研究构建了基于线性DNA的同源重组基因敲除技术,融合PCR构建敲除盒即带有潮霉素基因标记的线性DNA融合片段,配置0.05 g·mL^-1溶壁酶+0.01 g·mL^-1崩溃酶的复合酶液28℃酶解3 h获得了高产量的原生质体,利用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体的转化,PCR鉴定技术和酶切鉴定技术对转化子进行鉴定,荧光定量PCR分析和Southern Blot方法进一步对基因缺失突变体进行验证,生物学表型(菌落形态、生长速率、产孢量、生物量和致病力)验证了PK基因敲除体系的成功构建。28℃酶解3 h获得了2×10⁷个·mL^-1原生质体;对编码丙酮酸激酶的PK基因进行了基因敲除验证,获得了纯合敲除突变体;荧光定量PCR检测转录水平无表达;Southern Blot结果显示使用PK基因探针杂交,基因缺失突变体无条带,野生型杂交到目的条带;生物学表型验证了PK基因敲除突变体对比野生型...     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统hrcN基因的功能分析

hrcN是植物病原菌Ⅲ型分泌系统基因（T3SS）的结构基因之一,对病原菌的致病力有重要影响。本研究克隆青枯雷尔氏菌CBM613的hrcN基因并作生物信息学分析,结果显示该基因长度为1320 bp,共编码439个氨基酸,预测HrcN蛋白无信号肽,无跨膜区域,整体呈弱亲水性,该蛋白为ATP酶,定位于细胞内膜和细胞质。基因敲除结果显示,菌株CBM613的hrcN突变体与野生型菌株在富营养培养基上的生长速率差异不明显,而在贫营养培养基上前者的生长速率显著快于后者。敲除hrcN基因后,青枯雷尔氏菌的运动能力无明显变化,生物被膜形成能力显著降低。以敲除突变型和野生型青枯雷尔氏菌株接种番茄,与后者相比,前者的致病力下降,病情指数降低,病程延长,但并未完全丧失致病力,表明hrcN基因是青枯雷尔氏菌致病性相关的重要基因。本研究为进一步探索青枯雷尔氏菌致病机制及防治具有重要意义。     

利用环介导等温扩增方法快速检测瓜类细菌性果斑病菌和番茄细菌性溃疡病菌

为建立简单、快速和灵敏地检测瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax avenae subsp. citrulli(Aac)和番茄细菌性溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis(Cmm)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,以Aac的ugpB基因和Cmm的micA基因为靶标,分别设计、合成和筛选特异性引物,摸索和优化各项反应条件和反应体系,成功建立了以钙黄绿素颜色为指示且只需要金属浴恒温反应30～60 min的LAMP扩增体系。特异性分析表明该LAMP方法可以快速检出5株不同的Aac菌株和2株不同的Cmm菌株,其它对照菌株如燕麦嗜酸菌燕麦亚种A. avenae subsp. avenae、丁香假单胞菌Pseudomonas syringae、水稻黄单胞菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae和茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum则呈现阴性反应;引物比目前报道的LAMP引物有更高的DNA样品检测灵敏度,Aac和Cmm的灵敏度分别为1.72×10~2fg/μL和1.26×10~2fg/μL。研究结果表明,所设计的Aac和Cmm引物特异性好、灵敏度高,更有利于从源头上控制这2种检疫性细菌病害的流行和传播。     

Pythium rot of chingensai ( Brassica campestris L. chinensis group) caused by Pythium ultimum var. ultimum and Pythium aphanidermatum

Severe rot was found at the base of leaves and stems of chingensai (Brassica campestris L. chinensis group) in Okayama Prefecture in 2000. The causal fungi were morphologically identified as Pythium ultimum Trow var. ultimum and P. aphanidermatum (Edson) Fitzpatrick. This is the first report of rot caused by Pythium species on chingensai. We named this disease Pythium rot of chingensai.     

大蓟总黄酮对尖孢镰刀菌甜瓜专化型生长、生理的影响及其田间防治效果

为探究大蓟总黄酮对尖孢镰刀菌甜瓜专化型Fusarium oxysporum f. sp. melonis的抑制效果,采用微波超声法提取大蓟种子中的总黄酮,并测定其对其尖孢镰刀菌甜瓜专化型生长、生理指标的影响及其田间防治效果。结果显示,大蓟总黄酮浓度为10 mg/mL时,对尖孢镰刀菌甜瓜专化型的菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率达到100.0%,菌丝畸变、断裂;尖孢镰刀菌甜瓜专化型OD650 nm和pH最小,分别为0.3和5.5;其电导率是对照组1.2倍。不同浓度大蓟总黄酮处理下尖孢镰刀菌甜瓜专化型呼吸强度、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性均呈现先上升后下降的趋势,羧甲基纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性降低,浓度为10 mg/mL大蓟总黄酮处理尖孢镰刀菌甜瓜专化型60 h后,呼吸强度、SOD和CAT活性均降至最低,分别为7.8 mgCO2·cm-2·h-1、22.9 U/mL和20.8 U/mL。田间防治结果表明,浓度为10 mg/mL大蓟总黄酮处理下,甜瓜枯萎株数最少,防治效果最佳,为93.5%。表明大蓟总黄酮能够有效地抑制尖孢镰刀菌甜瓜专化型生长,具有进一步发展为绿色新型植物源尖孢镰刀菌甜瓜专化型防治剂的能力。     

Effect of surface wettability on germination and gene expression in Cronartium quercuum f. sp. fusiforme basidiospores

Cronartium quercuum f. sp. fusiforme is an obligate pathogen of pine and oak. Its basidiospores are specifically adapted to recognize and establish infections on the pine host. Depending on environmental cues, the basidiospores can germinate directly, which typically leads to infection of pine, or indirectly, which usually results in formation of secondary basidiospores. We investigated how changes in surface wettability, or hydrophilicity, affect basidiospore germination. When we decreased surface wettability, the direct germination and total germination (direct+indirect) frequencies increased. Additionally, there was a critical threshold between 42% and 54% wettability, at which the basidiospores switched from direct to indirect germination. We conclude that the germination type of C. q. fusiforme basidiospores is influenced by the hydrophilicity of the surface upon which they land. To gain insight into gene expression during basidiospore germination, we made two suppression subtraction hybridization (SSH) libraries enriched for genes expressed during each type of germination. A total of 172 unique gene sequences were recovered from the two expression libraries. Annotation of these libraries indicates that they include several clones that may encode rust-specific or basidiomycete-specific functions.     

Functional analysis of the 3′ end of avrBs3/pthA genes from two Xanthomonas species

The phytopathogens Xanthomonas oryzae pathovar (pv.) oryzae and Xanthomonas axonopodis pv. citri each contain several avrBs3/pthA family genes. Structural features of these genes important for avirulence and/or virulence functions include a central region of multiple direct repeats and three nuclear localization signals (NLSs) and an acidic activation domain (AAD) at the 3′ end. To identify other regions critical to function in the 3′ ends of these genes, we constructed several chimeras using apl1 and apl2 from X. axonopodis pv. citri and avrXa10 and avrXa7 from X. oryzae pv. oryzae and evaluated their functions by inoculation to citrus and rice. The apl1 and avrXa7 genes are major virulence determinants in citrus and rice, respectively, while the contributions of apl2 and avrXa10 to virulence are negligible or not measurable. Constructs that contained a 417 bp HincII-SphI fragment from the 3′ end of apl1 in combination with the repeats from avrXa7, avrXa10, and apl1 caused a canker phenotype on citrus. Interchange of the HincII-SphI fragment between avrXa7 and avrXa10 abolishes avrXa7 avirulence function and reduces its virulence but it does not affect avrXa10 avirulence function in rice. avrXa7 caused a hypersensitive response (HR) in citrus and replacement of it's 3′ end with that of apl1 resulted in loss of canker and induction of HR. Thus, the HincII-SphI fragment of the avrBs3/pthA gene family is important for avirulence and virulence functions in two different plant species, Oryza sativa and Citrus natsudaidai HAYATA.     

基于毒性表型与微卫星标记的云南省条锈病菌群体遗传分析

为明确云南省条锈菌群体结构和遗传多样性水平,利用19个中国鉴别寄主和11对微卫星(simple sequence repeat,SSR)标记引物对采自云南省大理、曲靖、文山、昭通4个市的88个菌系进行了毒性表型分析和分子基因型分析。毒性表型分析结果表明,云南省条锈菌群体Nei’s基因多样性指数为0.17,Kosman指数为0.22,云南省条锈菌群体毒性结构复杂;菌系以Hybrid 46类群(77.3%)和贵农22类群(17.0%)为主,并且均不能侵染鉴别寄主中四和Triticum spelta album。分子基因型分析结果表明,云南省条锈菌整体上香农信息指数为0.63,分子遗传多样性比较丰富;大理市菌系香农信息指数为0.64,分子遗传多样性最丰富;文山市菌系香农信息指数为0.35,分子遗传多样性最低。聚类分析结果表明,云南省西部大理市菌系明显不同于云南省东部曲靖市、昭通市、文山市的菌系,昭通市菌系和曲靖市菌系毒性结构和基因型结构基本相同,表明云南省东、西部条锈菌群体遗传分化程度较高,是2个相对独立的流行区域。     

在小檗碱作用下水稻细菌性条斑病菌生理及转录反应分析

为探究小檗碱对水稻细菌性条斑病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzicola的抑菌机制，测定小檗碱对水稻细菌性条斑病菌GX13菌株的毒力、致病因子、细胞结构和能量代谢的影响，并利用Illumina-HiSeq高通量测序技术分析小檗碱对水稻细菌性条斑病菌菌体基因表达的影响。结果表明：经15 μg/mL小檗碱处理后，GX13菌株侵染水稻品种玉丝占后引起水稻细菌性条斑病的病情指数为6.70，低于对照组；每1×10⁸ CFU菌体胞外多糖产量为1.58 μg，显著低于对照的2.42 μg；纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等胞外酶活性均低于对照组；与能量代谢相关的苹果酸脱氢酶（MDH）活性为1.42 U/g prot，低于对照组，而丙酮酸和三磷酸腺苷含量升高，分别为1.71 μmol/mL和379.49 μmol/g prot，均高于对照组。同时，细菌的生物膜形成受到抑制，细胞结构受到破坏。转录反应分析发现，与II型分泌系统相关的xpsD、xpsF和xpsM等基因、与III型分泌系统相关的hrcC、hrcJ、hrcN和hrcQ等基因、与胞外多糖分泌相关的gumF和gumI基因，以及与细胞结构与功能相关的murD、lpxA、lpxH、lpxL、fabG和fabZ等基因均下调表达。此外，与丙酮酸代谢途径相关的ppc、aceF和lpdA等基因也下调表达，但与氧化磷酸化途径相关的NADH脱氢酶和ATP合成酶编码基因以及与趋化性相关的编码基因均显著上调表达。表明小檗碱对GX13菌株的抑菌作用与其影响病菌的细胞结构和能量代谢相关，小檗碱通过影响病菌II型分泌系统和III型分泌系统的功能、生物膜的形成以及胞外多糖的合成，从而影响病菌的致病力。与此同时，水稻细菌性条斑病菌借助强化氧化磷酸化功能，启动与趋化性相关的基因上调表达来抵御小檗碱对自身的损害。     

向日葵黄萎病病原菌轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法

为建立可同时快速检测引起向日葵黄萎病害的2种检疫性病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.和黑白轮枝菌V.albo-atrum Reinke et Berthold的方法,根据2种病原菌的β-tubulin基因分别设计特异性DPO引物,建立多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅大丽轮枝菌和黑白轮枝菌可分别扩增出225 bp与151 bp的特异性条带,其它向日葵病害的7种病原菌及阴性对照均无目的条带;反应体系中引物终浓度为0.2μmol/L、退火温度为60℃时,30个扩增循环的检测灵敏度均可达0.05 ng菌丝DNA量;在45~65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段,表明该方法退火温度范围宽。所建立的检测方法能够准确、高效地检测引起向日葵黄萎病的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌,可用于向日葵种子带菌筛查及田间病害诊断检测。     

狭叶菖蒲乙醇提取物对棉铃虫卵和幼虫的生物活性

为筛选安全高效的棉铃虫防治药剂,选用狭叶菖蒲Acorus calamus var.angustatus乙醇提取物对棉铃虫Helicoverpa armigera卵和幼虫的触杀活性、胃毒作用、拒食效果和生长抑制作用进行了测定,同时以0.5%藜芦碱为药剂对照,对比分析狭叶菖蒲提取物的杀虫效果。结果表明,狭叶菖蒲乙醇提取物对棉铃虫3龄幼虫有显著的触杀、胃毒、拒食和生长抑制活性以及杀卵效果,且生物活性随浓度升高和处理时间延长而增加;狭叶菖蒲提取物对棉铃虫触杀活性、胃毒活性、杀卵活性的致死中浓度LC_(50)分别为20.50、19.26和31.39 mg/m L,对棉铃虫生长抑制中浓度EC_(50)和拒食中浓度AFC_(50)分别为7.15、10.43 mg/m L;0.5%藜芦碱药剂对棉铃虫触杀活性、胃毒活性和杀卵活性LC_(50)分别为12.19、16.90和29.87 mg/m L,对棉铃虫EC_(50)和AFC_(50)分别为3.99、8.32 mg/m L,均低于菖蒲根茎提取物。气相色谱-质谱分析结果显示,狭叶菖蒲乙醇提取物主要成分为α-细辛醚、β-细辛醚、菖蒲酮和白千层醇。表明狭叶菖蒲乙醇提取物有开发为新型植物源农药的潜力。