甜瓜黄斑病毒在海南黄瓜上的发生分布及序列分析

 应用特异性引物MYSV-L-F和MYSV-L-R对海南5个市县采集的150份疑似感染病毒病的黄瓜样品进行RT-PCR检测,在三亚、乐东和东方等3个市县的18份样品中检测到甜瓜黄斑病毒(Melon yellow spot virus, MYSV)。选取采自三亚的分离物C29(MYSV-Hainan)进行MYSV全基因组克隆及序列分析,结果表明:该分离物的L RNA、M RNA和S RNA基因组全长分别为8 918 nt、4 815 nt和3 257 nt,与已知MYSV分离物的核苷酸相似性分别为97.4%~97.7%、96.2%~97.9%和94.8%~99.8%,系统进化关系分析与相似性分析一致,序列相似值越高,系统进化关系越近。     

猕猴桃褪绿环斑相关病毒在陕西省的分布、分子变异及其2个分离物的基因组序列

为明确我国陕西省猕猴桃主产区的徐香、海沃德、华优和秦美4个猕猴桃品种上的猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus,AcCRaV)的分布情况,对采集自该省4个地区的493份样品进行AcCRaV检测,基于cp基因序列对获得的AcCRaV分离物进行分子变异分析,并采用高通量测序技术对其中2份样品进行转录组测序。结果显示:AcCRaV在陕西省猕猴桃上分布广泛,且检出率较高,其中周至县秦美猕猴桃上AcCRaV的检出率最高,为45.0%,在杨凌区秦美猕猴桃上AcCRaV的检出率最低,为10.0%。测定的23个AcCRaV分离物cp基因序列全长均为945 nt。系统发育树显示AcCRaV分离物共分成2个组,存在较大的分子变异。AcCRaV的cp基因分子变异与猕猴桃品种有一定关系,而与地理位置相关性不明显。获得了2个AcCRaV分离物ZZ1和ZZ2的基因组序列,RNA1长度分别为7 049 nt和7 274 nt,RNA2长度均为2 266 nt,RNA3长度分别为1 691 nt和1 696 nt,RNA4长度分别为1 736 nt和1 683 nt,RNA5长度分别为1 460 nt和1 497 nt。分离物ZZ1和ZZ2的基因组序列与GenBank中唯一报道的我国湖北省AcCRaV分离物HN-6基因组序列比对中,分离物ZZ2与HN-6的RNA4同源率最高,为96.0%,分离物ZZ2与HN-6的RNA1同源率最低,为87.8%。表明AcCRaV在我国陕西省猕猴桃主产区分布较广泛,且其分子变异与猕猴桃品种有一定关系。     

侵染梨的苹果茎痘病毒基因组序列及小RNA分析

苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)是危害梨(Pyrus spp.)和苹果(Malus spp.)的重要病毒。本研究采用小RNA深度测序技术获得了ASPV基因组的部分序列,在此基础上设计引物对该病毒基因组进行RT-PCR扩增,通过序列拼接得到1个来源于玉露香(Yuluxiang)梨的ASPV分离物(YLX)长度为9 291个核苷酸(nt)(不包括基因组5'末端约30个核苷酸)的基因组序列,该序列与已报道的13个ASPV分离物的基因组核苷酸序列相似性为71.6%~80.7%,与多个来自苹果的ASPV分离物系统进化关系较近。首次分析了来源于ASPV基因组的干扰性小RNA(siRNA),发现来源于ASPV基因组链和互补链的siRNA长度均以21 nt和22 nt为主,siRNA的5'端具有一定的碱基偏好性。本研究结果为深入了解ASPV的分子特性提供了重要信息。     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。     

甘薯病毒C中国分离物全基因组序列测定及比较分析

利用RT-PCR结合RACE方法,从采自河南南阳的甘薯样品上获得甘薯病毒C中国分离物(SPVC-Ch1)的全长基因组序列。序列分析结果表明,SPVC-Ch1基因组由1 0846个核苷酸组成,3'末端包含poly(A)尾序。基因组含有1个由10 446个核苷酸构成的开放阅读框,编码一个由3 481个氨基酸残基构成的393 k Da多聚蛋白。将SPVC-Ch1与Gen Bank中登录的其他SPVC分离物序列进行比较分析发现,SPVC不同分离物间全基因组核苷酸序列相似性为92.7%~98.9%,多聚蛋白的氨基酸序列相似性为95.1%~99.2%,SPVC-Ch1与Bungo分离物的相似性最高,与C1分离物的相似性最低。系统进化树分析结果表明,SPVC-Ch1与日本的Bungo、以色列的IL、韩国的CW135和UN202等分离物形成一个分支,亲缘关系较近。这是SPVC中国分离物全基因组序列的首次报道,研究结果丰富了SPVC全基因组序列信息,有助于全面了解SPVC种群的遗传进化关系。     

番茄斑驳花叶病毒在广东省的首次报道

番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus, ToMMV)是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种,目前在多国(地区)有发生。本文采用小RNA深度测序及RT-PCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV,命名为番茄斑驳花叶病毒广东分离物(ToMMV-GD-2020)。采用RT-PCR分段扩增获得了ToMMV-GD-2020的基因组全序列,该分离物基因组全长6 399 nt,包含4个开放阅读框,分别编码4个蛋白。序列相似性分析表明,ToMMV-GD-2020与已登录GenBank的14个ToMMV分离物基因组序列相似性分别为99.0%～99.7%,其中与中国辽宁分离物ToMMV-LN(GenBank登录号：MN853592)的相似性最高(99.7%),与危害我国番茄、同属烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒(tomato mosaic virus, ToMV)、番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)代表分离物的相似性分别为84.6%和81.0%。系统进化分析表明,ToMMV-GD-2020...     

蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

利用酶联免疫和RT-PCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2)。为明确BBWV2安徽分离物(BBWV2-AH)的分类地位,克隆了该分离物的全基因组序列,分析了其基因组特征。结果表明,BBWV2-AH RNA1全长为5 944 bp(GenBank登录号:KY606992),含有1个ORF;BBWV2-AH RNA2全长3 587bp(GenBank登录号:KY606993),含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示,BBWV2-AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%~96%和87.1%~99%;BBWV2-AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%~95.5%和88.2%~98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示,BBWV2-AH RNA1与中国的BBWV2-Hunan RNA1的亲缘关系最近,而BBWV2-AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起,再与中国的分离物BBWV2-B935形成一个分支。     

辣椒轻斑驳病毒湖南分离物的全基因序列测定及结构分析

采自湖南地区的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)样品经单斑分离后,根据已经报道的PMMoV序列基因保守区设计6对简并引物,采用片段重叠法和RACE方法扩增、克隆获得一个全长为6 356bp的湖南分离物(PMMoV-HN1,登录号:KP345899)全基因组序列,编码4个蛋白,分别为126kD蛋白(70~3 423nt)、183kD蛋白(70~4 908nt)、28kD蛋白(4 909~5 682nt)和17.5kD蛋白(5 685~6 158nt),5′-非编码区(5′-UTR)和3′-非编码区(3′-UTR)分别含有69和198个碱基,其中5′-UTR存在一个序列为m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子结构。一致性分析发现PMMoV-HN1与PMMoV其他分离物的核酸一致性为94%~99%,编码的氨基酸一致性为94%~99%。全基因组序列系统进化分析表明PMMoV-HN1分离物与中国首次报道的PMMoV-CN分离物亲缘关系最近。本研究是国内报道的第二例PMMoV全基因组序列。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列分析及病害的田间调查

为明确近年来在浙江省葫芦科作物上发生的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)基因组特征及其发生分布情况,从浙江省及上海地区的甜瓜、西瓜和瓠瓜上采集疑似样品进行RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得基因组全序列并进行系统进化分析,利用特异性引物扩增获得CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,制备CGMMV CP抗血清进行Western-blot和Dot-ELISA检测。结果显示,来自甜瓜、西瓜和瓠瓜的3个CGMMV分离物基因组全序列均具有烟草花叶病毒属典型基因组结构特征,全部由6 423 nt构成;3个全序列间的核苷酸同源性高达99.11%~99.67%,编码的CP氨基酸同源性为100%。系统进化分析发现,CGMMV不同分离物形成2个进化相关群体,3个浙江的CGMMV分离物均位于第I组内,与已报道的中国CGMMV分离物和韩国CGMMV分离物亲缘性较高。Western-blot检测表明CGMMV CP抗血清可以与感病植株中的病毒发生特异性反应,可用于CGMMV鉴定;Dot-ELISA检测发现CGMMV在浙江省和上海市的葫芦科作物上普遍存在。     

烟台市富士苹果上苹果锈果类病毒分子变异分析

为明确苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)在烟台市富士苹果上的变异情况,通过特异性引物对携带苹果锈果类病毒的富士嫩叶进行ASSVd全长扩增,利用生物学软件DNAMAN对所得变异序列进行分析并构建系统进化树。结果表明,从130个样品中筛选到36个阳性样品,36个阳性样品中共克隆获得52条329~333 nt的ASSVd变异序列,其中30个阳性样品含2条或2条以上的ASSVd序列。对所得变异序列进行序列比对发现,同一样品不同克隆间核苷酸序列相似性为94.0%~100.0%,所有变异序列核苷酸序列相似性为94.0%~99.7%,与Gen Bank中来自不同国家或地区的10条ASSVd分离物核苷酸序列相似性为88.3%~99.7%。将序列相似性低于97.0%的12条变异序列进行系统进化分析,结果显示除了333 nt变异序列ZS2-6与伊朗苹果分离物在同一分支外,其余11条变异序列位于同一分支。52条变异序列多序列比对发现,变异位点主要集中在TL区、P区和C区。研究表明烟台市富士苹果上ASSVd存在一定的分子变异。     

甜瓜黄斑病毒三亚分离物S RNA的分子特征

 甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot virus, MYSV）首次发生于日本,造成甜瓜和黄瓜的严重损失,Kato等系统地研究了病毒的传播方式、寄主范围、超微结构和基因组特征,认为MYSV应为番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的1个新种［1,2］。2006年以来,台湾的西瓜［3］和黄瓜［4］上相继发现MYSV。2009年春季,古勤生在海南三亚的保护地甜瓜上发现一种新发生的病毒病,发病率30%~100%,病株出现系统性黄化坏死斑点,为MYSV侵染的典型症状,结合分子检测结果判定病原为MYSV。     

苹果茎痘病毒在山楂中的首次鉴定与序列分析

 山楂是我国重要的果树,但山楂病毒的相关研究较少。本研究通过高通量测序及生物信息学分析首次在山楂样品中发现苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus,ASPV)。利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术对ASPV山楂分离物全长序列进行扩增,结果表明,ASPV山楂分离物基因组全长由9 290个核苷酸组成,包含5个开放阅读框(open reading frames,ORFs)。ORF1编码与病毒复制相关的蛋白-RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp),其在氨基酸水平上与ASPV苹果和梨分离物的RdRp序列相似性分别为72.8%~80.9%和81.7%~92.8%;ORFs 2~4表达与病毒移动相关的三基因块(triple gene block 1~3,TGB 1~3),其与印度苹果N分离物(LM999967)的氨基酸序列相似性最高,为92.9%~98.2%;ORF5编码外壳蛋白(coat protein,CP),与苹果和梨分离物CP的序列相似性较低,分别为64.8%~88.4%和69. 8%~92.2%,高于目前凹陷病毒属病毒新种的划分界限。将ASPV山楂分离物的全长核苷酸序列与其他ASPV分离物的全长序列进行比对,构建系统发育树,结果表明,ASPV山楂分离物与巴西苹果分离物BR-Brae2的亲缘关系最近,但两者核苷酸序列相似性较低(81.5%),说明与其他分离物相比该分离物具有较大的变异性。综上,本研究初步验证了山楂是ASPV的重要自然寄主,并首次获得了ASPV山楂分离物的全长基因组序列,为山楂病毒病诊断和防控策略的制定提供参考。     

侵染红肉火龙果的蟹爪兰X病毒贵州分离物基因组分析

 通过高通量测序和RT-PCR扩增,克隆并分析蟹爪兰X病毒(Zygocactus virus X,ZyVX)贵州分离物ZyVX-GZ基因组序列。对表现病毒病症状的红肉火龙果植株进行高通量测序,获得4条ZyVX相关contig。RT-PCR扩增并拼接获得ZyVX-GZ基因组,全长为 6 567 nt,5′-UTR和 3′-UTR分别为60 nt和70 nt。含有5个ORF,分别编码复制酶蛋白、TGB1、TGB2、TGB3蛋白和外壳蛋白。ZyVX-GZ与P39和B1分离物基因组序列一致性均为91%。TGB1-3、外壳蛋白基因与大多数分离物核苷酸和推导的氨基酸序列一致性分别为95%～99%和96%～100%;复制酶基因的核苷酸和推导的氨基酸序列一致性分别为80%～89%和92%～97%。系统进化分析表明,ZyVX群体的遗传分化与寄主种类、地理分布不存在相关性。本研究结果丰富了ZyVX群体的基因组序列信息,为ZyVX的监测和防控提供了基础。     

海南岛西瓜病毒病种类鉴定及发生分布

正病毒病是西瓜生产上的重要病害,目前侵染我国西瓜的病毒主要有西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV) 、甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)、小西葫芦黄花叶病毒     

海南岛西瓜病毒病种类鉴定及发生分布

From October 2017 to April 2019, a total of 290 suspected virus-infected watermelon leaf samples were collected in 7 urban areas (Wenchang, Wanning, Lingshui, Sanya, Ledong, Dongfang, Changjiang) in Hainan island. Nine viruses were detected including MYSV, WSMoV, CCYV, CMV, TMV, CGMMV, ZYMV, WMV and PRSV by small RNA deep sequencing and RT-PCR. The detection rates of MYSV, CCYV, CGMMV, ZYMV, CMV, WSMoV, PRSV, TMV and WMV were 66.90%, 25.86%, 22.07%, 17.59%, 10.00%, 7.59%, 5.52%, 2.76% and 1.03% respectively. The co-infection rate of virus was 56.56% and 14 types of mixed infections were detected. The results of this study clarify the identification and distribution of waterme-lon-infecting viruses in Hainan.     

油桃茎痘相关病毒中国分离物基因组的分子特征分析

为明确我国油桃茎痘相关病毒(nectarine stem-pitting-associated virus,NSPaV)基因组的分子特征,利用RT-PCR和RACE技术对NSPaV中国分离物NSPaV-T04基因组进行克隆,采用最大似然法对得到的NSPaV基因组序列和GenBank中的5条NSPaV基因组序列构建系统发育树,应用RDP软件对NSPaV基因组序列进行重组分析。结果表明:中国分离物NSPaV-T04基因组序列全长为4 991 nt,包括4个开放阅读框(open reading frame,ORF),其中ORF1与ORF2共同编码1个RdRp P1-P2融合蛋白,ORF3编码1个CP,ORF5与ORF3共同编码CP通读蛋白。系统发育树和序列比较分析结果显示,中国分离物NSPaV-T04(MN095353)与美国分离物NSPaV/12P42(KT273410)的亲缘关系最近,核苷酸序列同源性最高,为96.4%;NSPaV-T04的RdRp P1变异较大,与GenBank中5条NSPaV基因组核苷酸序列的同源性为90.5%~96.1%,CP较为保守,核苷酸序列的同源性为96.6%~98.7%。重组分析结果显示,中国分离物NSPaV-T04为鉴定的一个重组体(韩国分离物SK)的亲本序列,表明中国分离物NSPaV-T04可能是一个实际的重组体。     

新疆辣椒中BPEV和PCV2的鉴定与分析

 为明确新疆石河子辣椒感染病毒的种类,对表现明显皱缩、褪绿和卷叶等症状的辣椒样本进行长链非编码RNA(Long noncoding RNA, LncRNA)测序。根据LncRNA测序和RT-PCR检测,发现甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus, BPEV)、辣椒隐症病毒2(Pepper cryptic virus 2, PCV2)和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)3种病毒。RT-PCR检测数据显示,新疆石河子的辣椒普遍感染BPEV和PMMoV。将BPEV的RdRp基因序列和PCV2-RNA1包含RdRp基因的序列分别进行核苷酸序列相似性和系统进化分析。结果表明本研究中BPEV-XJ和PCV2-XJ与其它分离物的相似性分别为89.1%~97.3%和96.9%~99.7%。BPEV-XJ与BPEV-TW分离物亲缘关系最近;PCV2-XJ与PCV2-DR分离物亲缘关系最近。辣椒中检测到BPEV和PCV2为新疆首次报道。