杂草对AHAS抑制剂的抗药性分子机理研究进展

除草剂在田间的重复及不合理使用,导致了杂草抗药性的发生和发展。其中AHAS抑制剂由于靶标单一,抗性发展十分迅速。截至2009年,已有103种杂草对AHAS抑制剂产生了抗药性,占19类化学除草剂总抗药性杂草生物型的近1/3。从AHAS基因突变位点及种类与杂草抗药性水平的关系、AHAS基因突变与AHAS酶活性的关系、AHAS基因拷贝数与杂草抗药性的关系以及AHAS酶与除草剂结合前后的三维结构等方面,综述了杂草对AHAS抑制剂产生抗药性的机理,旨在为AHAS抑制剂抗性研究提供参考。并对自然种群目标基因的等位基因检测技术(ECOTILLING)和衍生型酶切扩增多态性序列(dCAPS)两种通过检测等位基因多态性的手段快速诊断抗药性杂草的新技术进行了介绍,讨论了延缓杂草抗药性发生和发展的策略。     

上海市水稻田千金子对3种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的抗性现状及酶突变机制

为明确上海市水稻田千金子对乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase) 抑制剂类除草剂的抗性发生情况及可能存在的抗性机制,在上海市千金子发生严重地区的水稻田共采集51个种群,采用单剂量抗性甄别法测定了不同千金子种群对3种ACCase抑制剂类除草剂的抗性水平,扩增和比对了靶标酶ACCase基因部分片段的差异。结果显示:在氰氟草酯105 g/hm2有效成分剂量选择压下,8个千金子种群标记为抗性种群,6个种群为发展中抗性种群;在噁唑酰草胺 120 g/hm2有效成分剂量选择压下,4个千金子种群标记为抗性种群,5个种群为发展中抗性种群;在精噁唑禾草灵62.1 g/hm2有效成分剂量选择压下,6个千金子种群标记为抗性种群,2个种群为发展中抗性种群。对15个抗性千金子种群靶标酶基因片段的测序发现,9个种群共发生了4种ACCase基因突变类型,分别为ACCase基因 1999 位点色氨酸 (TGG) 突变为丝氨酸 (TCG)、1999位点色氨酸 (TGG) 突变为半胱氨酸 (TGT)、2027位点色氨酸 (TGG) 突变为丝氨酸 (TCG) 以及2027位点色氨酸 (TGG) 突变为半胱氨酸 (TGT/TGC)。其中,5个抗性千金子种群ACCase 基因突变频率均大于60%。研究表明,ACCase抑制剂类除草剂抗性千金子在上海市部分地区发生已较为严重,ACCase 基因突变是导致不同千金子种群对该类除草剂产生抗性的重要原因之一。     

山东省冬小麦田猪殃殃抗药性水平及ASL靶标抗性机理分析

为明确山东省冬小麦田猪殃殃Galium aparine对常规除草剂氯氟吡氧乙酸、苯磺隆及双氟磺草胺的抗性水平和抗性种群的乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,ALS)靶标抗性机理,在温室内采用整株生物测定法测定21个猪殃殃种群对氯氟吡氧乙酸、苯磺隆和双氟磺草胺的抗性水平,同时根据猪殃殃ALS基因序列设计引物,提取猪殃殃高抗种群单株基因组DNA进行测序,并与拟南芥Arabidopsis thaliana敏感型ALS基因进行比对,查找突变位点分析其抗性机理。结果表明,21个猪殃殃种群对氯氟吡氧乙酸均敏感,尚未产生抗性;90.48%的猪殃殃种群已对苯磺隆产生了抗性,其中低抗、中抗和高抗种群分别占总种群数的23.81%、23.81%和42.86%,相对抗性指数最高为1 134.82;71.43%的猪殃殃种群已对双氟磺草胺产生了抗性,其中低抗、中抗和高抗种群分别占总种群数的19.05%、9.52%和38.10%,相对抗性指数最高为87.05。高抗苯磺隆种群XZ-1和LW均发生了ALS基因第197位氨基酸功能位点的突变,其中XZ-1种群发生了CCC(脯氨酸)到TCC(丝氨酸)...     

马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗性的快速检测方法

为快速检测马铃薯晚疫病菌——致病疫霉Phytophthora infestans对甲霜灵的抗性,基于已知致病疫霉RPA190基因的T1145A变异引起的F382Y氨基酸点突变与甲霜灵抗性有关,通过设计4对特异性引物F382Y-F1/F382Y-R、F382Y-F2/F382Y-R、F382Y-F3/F382Y-R和F382Y-F4/F382Y-R建立等位基因特异性PCR(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR)快速分子检测法,其中F382Y-R引物在4对引物里保持不变,并分析所建分子检测法的特异性和灵敏度。结果表明,正向特异性引物F382Y-F2、F382Y-F3和F382Y-F4的3''末端在致病疫霉抗甲霜灵菌株原有核苷酸突变位点1145A(对应引物为F382Y-F1)的基础上,再人工引入第1144位的核苷酸突变,将1144T分别突变成1144G、1144C和1144A,并优化退火温度和特异性引物与内参引物ITS1/ITS4比例,最终确定最适退火温度分别为54、60和58℃,特异性引物与内参引物最适浓度比例均为5∶1。以该3条引物对应的3对特异性引物和内参引物ITS1/ITS4组成的3组多重AS-PCR引物对甲霜灵敏感和抗性菌株具有良好的特异性,敏感菌株的扩增产物含1条879bp的内参片段,抗性菌株的扩增产物为1条879bp的内参片段和1条461bp的目的片段。3组AS-PCR检测体系均具有较高的灵敏度,其中引物F382Y-F4/F382Y-R对致病疫霉DNA的检测灵敏度达0.4pg/μL,引物F382Y-F2/F382Y-R和F382YF3/F382Y-R的检测灵敏度达4pg/μL。     

十字花科蔬菜黑斑病菌的PCR鉴定

 在对十字花科蔬菜黑斑病菌(Alternaria sp.)3个种及相近种的5.8SrDNA和其侧翼ITS区进行测序的基础上,分别设计合成了鉴定白菜黑斑病菌3个种的特异性引物。PCR扩增结果表明:Abre1和Abre2引物对能特异性扩增芸苔链格孢(A.brassicae)371bp的片段,Abra1和Abra2引物对能特异性扩增甘蓝链格孢(A.brassicicola)457bp的片段,Ajap1和Ajap2引物对能特异性扩增萝卜链格孢(A.japonica)411bp的片段,而且其它近源种未扩增出目标片段,说明这3个引物对可以作为十字花科蔬菜黑斑病菌3个种快速检测鉴定的分子特征标记。     

杀菌剂抗性分子检测技术的研究进展

靶标病菌基因突变是许多内吸性杀菌剂出现抗性的根本原因,检测与抗药性相关的靶标病菌基因突变对阐明抗药性发生的分子生物学机制及进行早期诊断具有重要意义。目前已成功用于检测靶标病菌抗药性菌株的分子检测技术有6种:等位基因特异性扩增、限制性片段长度多态性、等位基因特异性寡核苷酸杂交、单链构象多态性、实时定量PCR、变性高效液相色谱分析。这些技术能够快速、灵敏地检测田间早期出现的抗药性或抗药性种群的发展动态,在病害的可持续管理系统中科学使用杀菌剂方面发挥着重要作用。     

小麦赤霉病菌多菌灵抗性群体的扩散路径分析——基于致病菌种类及所产毒素化学型鉴定和抗药性检出的时序性

通过对江苏、安徽、山东、河南、湖北、河北和四川7省小麦赤霉病菌对多菌灵抗性及敏感菌株Fusarium asiaticum和F.graminearum的鉴定、所产生毒素的化学型及多菌灵抗性菌株检出时序性的分析,初步推测了小麦赤霉病菌对多菌灵抗性群体在中国麦区的扩散路径。结果表明:江淮流域的江苏、安徽、湖北3省和四川省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性或敏感菌株优势群体均是F.asiaticum,而黄淮流域的山东、河南2省及河北省小麦赤霉病菌对多菌灵的敏感菌株优势群体为F.graminearum,抗性菌株优势群体则为F.asiaticum。江苏、安徽、山东和河南抗多菌灵菌株F.asiaticum产生毒素的化学型为3-AcDON和NIV,并以3-AcDON为主。江苏省连续使用多菌灵防治小麦赤霉病长达20多年后才检测到田间抗性菌株,而近年来检测到田间抗性菌株的山东、河南2省用多菌灵防治赤霉病的历史较短,且为偶尔使用,药剂的选择压力相对较小,因此推测山东和河南麦区出现的小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株可能是通过种子调运及联合收割机跨区作业等方式从抗药性发生较早的江淮麦区流入的。     

靶标抗性点突变基因型检测技术

杀虫剂的不合理使用导致害虫的抗药性日趋严重。抗药性是一种涉及一个或几个昆虫基因的遗传特征。靶标抗性通常与点突变相关,对抗性相关的点突变的快速检测诊断是抗性治理的基础之一。评述了5种基因型检测技术——单链构象多态性、固相微型测序、双向等位特异PCR扩增、实时荧光定量PCR和焦磷酸测序的优缺点及其在突变检测中的应用。     

天津市小麦田荠菜对双氟磺草胺的抗性及其乙酰乳酸合成酶基因突变

为明确天津市小麦田荠菜种群对双氟磺草胺的抗性情况及可能的抗性机理,本研究在天津市静海区、武清区、宝坻区及蓟州区等荠菜发生严重地区的小麦田共采集到6个荠菜种群,采用整株水平测定法测定了6个荠菜种群对双氟磺草胺的抗性水平,并扩增、比对了其靶标乙酰乳酸合成酶 (ALS) 基因部分片段的差异。结果表明:6个荠菜种群对双氟磺草胺均产生了高抗性,抗性倍数在11.4~47.2之间。对抗性和敏感种群的ALS基因片段进行测定比对发现,6个荠菜种群ALS基因197位氨基酸均由脯氨酸 (CCT) 突变为丝氨酸 (TCT),该突变可能是导致荠菜种群对双氟磺草胺产生抗性的重要原因之一。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

看麦娘对甲基二磺隆靶标抗性的快速检测

甲基二磺隆是防除小麦田看麦娘Alopecurus aequalis等禾本科杂草的主要除草剂品种之一,但目前中国山东、江苏及安徽等地已有部分看麦娘种群对其产生了抗性。ALS基因197位点突变是看麦娘对甲基二磺隆产生抗性的重要机理,根据突变型和野生型看麦娘在197位点处碱基序列的不同,本研究设计出了一种衍生性酶切扩增多态性序列(dCAPS)分子标记方法,可用于197位点突变的快速检测。通过在引物D197F序列的3′ 端引入一个错配碱基,扩增所得不同种群看麦娘的ALS片段经限制性内切酶BamH I酶切后表现出多态性:野生敏感型分别产生了200和36 bp的2个条带;纯合突变型因无法被切开,只有236 bp的一个条带;而杂合突变型则同时产生了上述3个条带。该dCAPS检测结果准确、可靠,与经典的整株水平测定结果一致,并且可同时检测197位点上任一形式的突变。研究结果可为看麦娘等禾本科杂草对甲基二磺隆靶标抗性的快速检测提供理论依据。     

中国部分农区作物上本地烟粉虱隐种的鉴定

烟粉虱Bemisia tabaci是一个至少包括36个不同隐种的物种复合体,为明确中国本地烟粉虱隐种的分布,采用线粒体COI基因(mt COI)分子标记法对2011—2012年在中国27个省(市)61个烟粉虱种群中获得的45个非B/Q隐种烟粉虱个体进行了隐种鉴定和分析,并利用邻接法基于mt COI序列构建了本地烟粉虱隐种的系统发育树。结果显示:45个非B/Q隐种烟粉虱对应的45条线粒体COI序列中共有10个单倍型,所有单倍型分别属于烟粉虱Asia II 2、Asia II 6、Asia II 7、Asia I与China1隐种,均为我国本地隐种。其中,在安徽省发现烟粉虱Asia II 2和China1隐种,在福建省发现Asia II 6和China1隐种,在海南省发现Asia II和Asia I隐种,在广东省发现Asia II 7隐种,在江西省发现China1隐种。表明中国部分农区作物上仍然存在少量的本地烟粉虱。     

Molecular basis of resistance to tribenuron-methyl in Descurainia Sophia (L.) populations from China

Two Descurainia Sophia populations, HB16 and HB08, were discovered in China and exhibit high resistance levels to tribenuron-methyl. Resistance ratio values of HB16 and HB08 were 153.47 and 651.20, respectively. The extractable acetohydroxy acid synthase (AHAS) activity was similar between resistant and susceptible populations. However, AHAS from HB16 and HB08 was less sensitive to inhibition of tribenuron-methyl comparing to susceptible population. The tribenuron-methyl I₅₀ values for HB16 and HB08 were 46.25 and 54.07 greater than that for susceptible population respectively. Pro-197-Ser and Pro-197-Leu mutations were identified in AHAS extracted from HB16 and HB08 plants respectively. AHAS insensitivity of resistant D. Sophia caused by Pro197 mutation could be responsible for high resistance to tribenuron-methyl.     

西瓜噬酸菌hflX基因功能分析

为明确GTP结合蛋白基因hflX在西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli中的功能尤其是对该菌致病力的影响,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为材料获得hflX基因的缺失突变菌株及互补菌株,通过对致病力等表型以及相关基因表达量的测定初步探究西瓜噬酸菌hflX基因的功能。结果显示,同野生型菌株Aac5相比,缺失突变菌株的致病力显著下降,III型分泌系统基因hrpG和hrpE的表达量显著下调,仅为野生型菌株表达量的54.99%和27.39%;hflX基因的缺失并未影响其引起烟草过敏性坏死反应的能力;但缺失突变菌株的运动能力显著下降,鞭毛基因fliR和fliC的表达量显著下调,仅分别为野生型菌株的37.04%和29.68%。此外,缺失突变菌株的生物膜形成能力相较于野生型菌株显著增强了26.32%,同时,其体外生长能力也有所增强。表明hflX基因可能通过调控III型分泌系统基因hrpG和hrpE、鞭毛基因fliR和fliC的表达以及运动能力来影响西瓜噬酸菌Aac5菌株的致病力。     

番茄枯萎病菌和青枯病菌拮抗细菌的评价

为筛选出对番茄枯萎病和青枯病有较好防效的生防菌,采用平板对峙法,以番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum和番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum为靶标菌,从江苏沭阳、宿迁、溧水及内蒙古海拉尔分离到的2 062株细菌菌株中筛选拮抗菌株,并采用平板对峙法、拮抗菌液灌根法、分子生物学方法进行拮抗物质检测、盆栽试验及种属鉴定。结果表明:从2 062株细菌中共筛选到21株对番茄枯萎病和青枯病具有很强拮抗作用的菌株,均能分泌蛋白酶,具有解磷作用;不能分泌几丁质酶和纤维素酶,仅4株细菌能分泌嗜铁素。拮抗细菌SY290对番茄枯萎病和番茄青枯病防效最高,分别达到74.2%和75.0%,SQ728和LS536次之,但防效均大于60%。结合各菌株形态特征、16S r DNA与gyr-B序列分析结果,菌株SY177、SY290和SQ728鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens,菌株LS536为枯草芽胞杆菌B.subtilis。     

江苏、河南、安徽和山东四省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性监测

采用菌丝生长速率法监测了1984、2001和2010年江苏省小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis对井冈霉素的敏感性变化趋势,以及2010年河南、安徽和山东3省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性现状。结果表明:1984、2001和2010年江苏省小麦纹枯病菌对井冈霉素的EC50值范围分别为0.31~0.87、0.05~1.21和0.20~1.09 μg/mL,26年间江苏省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性未发生显著性变化;2010年河南、安徽和山东3省小麦纹枯病菌对井冈霉素的EC50值范围分别为0.15~1.16、0.43~0.90和0.09~1.33 μg/mL,4省小麦纹枯病菌对井冈霉素的敏感性相互间差异不显著。井冈霉素仍然可以作为防治小麦纹枯病的主要药剂。     

河南省多花黑麦草对ACCase和ALS抑制剂的抗性及其靶标基因突变分析

为明确河南省部分地区的多花黑麦草Lolium multiflorum种群对乙酰辅酶A羧化酶（acetylCoA carboxylase,ACCase）和乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase,ALS）抑制剂类除草剂的抗性水平和抗性机理,采用整株生物测定法测定采自新乡市和驻马店市的多花黑麦草种群对ACCase抑制剂类除草剂精噁唑禾草灵、炔草酯、唑啉草酯和ALS抑制剂类除草剂甲基二磺隆、氟唑磺隆、啶磺草胺的抗性水平,并对多花黑麦草ACCase和ALS靶标酶编码基因进行克隆及氨基酸序列比对,分析其靶标抗性机理。结果显示,与多花黑麦草敏感种群HNXX01相比,HNZMD04和HNXX05种群对6种除草剂均产生了抗性,HNZMD04种群对精噁唑禾草灵和啶磺草胺的相对抗性倍数分别为44.65和40.31,对炔草酯和氟唑磺隆的相对抗性倍数分别为11.91和11.93;HNXX05种群对精噁唑禾草灵和氟唑磺隆的相对抗性倍数分别为27.70和25.67。HNZMD04和HNXX05抗性种群的ACCase基因均发生了D2078G突变,2个种群的突变率分别为55%和70%;HNZMD04...     

基于MaxEnt模型预测苹红缢管蚜在中国的适生区

为评估苹红缢管蚜Rhopalosiphum oxyacanthae入侵我国的潜在地理分布范围,基于其在全球的118个分布点和筛选的9个环境变量数据,利用MaxEnt模型和ArcGIS软件对苹红缢管蚜于当前和未来气候条件下在我国的潜在适生区进行预测。结果表明,基于苹红缢管蚜的全球分布数据,MaxEnt模型预测的平均AUC值为0.919,预测结果准确性较高。当前气候条件下,苹红缢管蚜在我国的总适生区面积占全国陆地面积的48.73%,其中高、中、低适生区的面积分别占全国陆地面积的5.92%、13.30%和29.51%,高适生区主要位于河南、江苏、安徽、湖北、湖南、贵州、江西、浙江、福建、广西、台湾等省区。未来RCP2.6和RCP8.5气候情景下,苹红缢管蚜在我国的总适生区面积增加并呈逐渐向东北方向迁移扩散的趋势,其中低适生区面积逐渐增加,高、中适生区面积逐渐减少,原先中南部的高适生区逐渐转变为低适生区或非适生区,但新疆维吾尔自治区北部、吉林省与辽宁省边界处的高适生区面积呈逐渐增加趋势。表明苹红缢管蚜在我国的适生范围极为广泛,具有较高的入侵风险,应加强进境口岸对该虫的检疫监管力度。