转cry1C和cry2A不同抗虫基因水稻品种对非靶标害虫灰飞虱生物学特性的影响

为明确转cry1C和cry2A不同抗虫基因水稻品种对非靶标害虫灰飞虱生物学特性的影响,在室内恒温25 ℃条件下观察转cry1C和cry2A不同抗虫基因水稻品种对非靶标害虫灰飞虱寄主选择行为的影响,以及个体发育与种群发展情况,记录并分析各虫态的发育历期、存活率及实验种群生命表参数。结果表明,灰飞虱对转cry2A、cry1C基因水稻和对照亲本水稻‘明恢63’的定向选择栖息率反正弦转换值分别为27.5、28.5、26.5,差异不显著。灰飞虱对3种供试水稻品种的喜好程度基本一致,但在转cry1C基因水稻上的平均取食刺痕数508.3个/d显著高于转cry2A基因水稻（288.5个/d）和亲本水稻‘明恢63’（297个/d）。灰飞虱在两个转基因抗虫水稻上的若虫全历期、卵孵化率、各虫态存活率和成虫羽化率与对照亲本水稻相比均差异不显著。灰飞虱在转cry2A、cry1C基因水稻和对照亲本水稻‘明恢63’上的初羽化成虫鲜重分别为0.731、0.744 mg和0.821 mg,差异不显著。上述结果表明,转不同Bt抗虫基因水稻对非靶标害虫灰飞虱个体发育及种群生命参数影响不大,与对照亲本水稻相比较在统计学上差异不显著。     

转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗虫性评价

为评估转cry1Ab/cry2Aj、cry1Ab/vip3DA玉米对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)和斜纹夜蛾Prodenia litura(Fabricius)的抗虫性,在室内测定了3个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1个转cry1Ab/vip3DA玉米品系对3种害虫幼虫存活和生长发育的影响,研究了该系列Bt玉米不同组织器官对害虫的杀虫活性和控制效果。结果显示,棉铃虫初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片96h后死亡率为87.50%~90.00%,取食花丝和雌穗的幼虫96h后几乎全部死亡;甜菜夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗168h后死亡率为22.50%~68.33%,幼虫的生长发育受到明显抑制,体重抑制率达85.00%~95.00%;斜纹夜蛾初孵幼虫取食各品系Bt玉米叶片、花丝和雌穗96 h后死亡率显著高于非转基因亲本对照,168h后幼虫死亡率达90.00%以上。研究表明,转cry1Ab/cry2Aj和cry1Ab/vip3DA玉米品系对棉铃虫和斜纹夜蛾的初孵幼虫表现出较好的抗性,可以作为转多基因抗虫玉米育种的备选材料。     

转cry1Ac玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

目标性状的有效性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价研究的重要内容之一。采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、室内生测和田间人工接虫鉴定研究了转cry1Ac玉米纯合群体BT-X和分离群体BT-38、BT-181、BT-43、BT-105等转化事件Cry1Ac蛋白的表达量以及对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）的室内杀虫和田间抗虫效果。转cry1Ac玉米鲜组织中Cry1Ac蛋白含量在44.07～438.00 ng/g之间,不同转化事件及不同组织之间差异显著,其中BT-X鲜花丝中Bt蛋白表达量显著低于未展开心叶。室内生测试验中除BT-43与对照没有显著差异外,取食其它转基因玉米心叶的亚洲玉米螟初孵幼虫6或7天的存活率为0～15.3%,显著低于非转基因对照;取食夏播BT-X鲜花丝6天的幼虫存活率为62.5%,显著低于Bt11及非转基因对照。田间心叶期接虫鉴定显示BT-X高抗亚洲玉米螟。说明转cry1Ac玉米BT-X、BT-181、BT-38和BT-105对亚洲玉米螟有很高的杀虫作用,BT-X田间抗虫效果良好。     

转cry1Ab+cry1C双价抗虫水稻对二化螟的抗性评价

为明确转cry1Ab+cry1C双价抗虫水稻对二化螟的抗性及其杀虫蛋白的时空表达,本研究采用离体水稻组织生测法系统评价了cry1Ab、cry1C、正交cry1Ab+cry1C和反交cry1C+cry1Ab 4种抗虫水稻品系对二化螟的杀虫效果,并用ELISA方法测定了Cry1Ab、Cry1C蛋白在各个抗虫水稻品系中的表达情况。结果显示,二化螟在不同生育期的4种转基因抗虫水稻上取食的叶面积显著低于非转基因对照亲本明恢63。4个转基因抗虫水稻品系在生长前期（苗期、分蘖和拔节期）对二化螟表现极高的杀虫效果,生长后期（孕穗期和成熟期）杀虫效果有所下降。两双价抗虫水稻杀虫效果最好,其次为转cry1Ab和cry1C水稻。Bt蛋白表达水平随着抗虫水稻生育期的变化而变化,且差异显著;Cry1Ab的蛋白表达量在水稻整个生长期均显著高于Cry1C。Cry1Ab蛋白在单价抗虫水稻叶片和茎杆中均表现出随生育期先升高后下降的趋势,但在双价抗虫水稻中表现出随生育期逐渐下降的趋势。Cry1C蛋白在单、双价抗虫水稻的叶片组织中均表现出逐渐升高的趋势。与单价抗虫水稻相比,双价抗虫水稻中的Cry1Ab、Cry1C的蛋白表达水平并没有表现出显著的降低。因此,双价抗虫水稻不仅能高效防治害虫,还能延缓害虫抗性,在生产上表现出良好的应用前景。该研究结果可望为转Bt基因抗虫作物的环境安全评价提供科学数据和理论依据。     

转cry1Ab基因玉米对粘虫的抗性评价

粘虫Mythimna separata(Walker)是我国玉米上的重要害虫。转Bt基因玉米为防治粘虫提供了新的途径。从室内生测和田间抗性鉴定分别研究了转cry1Ab基因抗虫玉米YieldGard对粘虫的杀虫效果。用4~7叶期转cry1Ab基因玉米心叶室内饲养1~3龄粘虫幼虫3、7和10天的死亡率分别为39.0%~92.0%、96.0%~98.0%和97.0%~100%,第14天全部死亡,而对照的死亡率分别为3.0%~8.0%、6.0%~20.0%和11.0%~28.0%,差异极显著。取食转cry1Ab基因玉米的幼虫不能正常生长发育,存活10天的幼虫其体重仅为取食对照玉米的9.0%。田间玉米4~5叶期,分别接1~6龄粘虫幼虫于转cry1Ab基因和非转基因玉米心叶。转cry1Ab基因玉米上各龄期幼虫平均存活率仅为0.0~6.7%,极显著低于非转基因玉米的8.3%~80.0%。转cry1Ab基因玉米的危害级别0.1~0.7,显著小于非转基因玉米的2.1~7.3。结果说明转cry1Ab基因玉米YieldGard对粘虫各龄幼虫有很高的杀虫作用和田间控制效果,同时能有效保护玉米免受危害。     

转cry1C,cry2A基因水稻对稻田浮游动物群落物种多样性的影响

转Bt基因水稻的非靶标效应一直以来都是人们关注的重点,为了解转Bt基因水稻对稻田浮游动物群落的安全性,本文以转cry1C基因水稻(T1C-19)、转cry2A基因水稻(T2A-1)及其非转基因亲本水稻明恢63(MH63)为材料,以浮游动物的种类和群落多样性为指标,研究并分析了转Bt基因水稻对稻田浮游动物群落物种多样性的影响。结果显示,水稻不同生长时期里稻田中浮游动物种类变化不明显,数量变化明显,Shannon-Wiener物种多样性指数和均匀性指数在拔节期达到最大值。另外由于孕穗期不得不施用农药防治蝗虫,导致孕穗期浮游动物的数量及物种多样性显著降低,并且在使用农药后,多样性指数和均匀性指数随着水稻的生长逐渐下降。但转Bt基因水稻对浮游动物种类和数量及群落物种多样性与对照非转基因水稻相比均无显著性差异。与施用农药对水体带来的负面影响相比,转Bt基因水稻对水体环境无负面影响。     

转Bt cry1Ab基因水稻花粉对中华 草蛉成虫产卵和寿命的影响

用ELISA法测定了转Bt基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)花粉中Cry1Ab含量.将转Bt基因水稻和其亲本对照秀水11(XS11)花粉加入到草蛉人工干粉饲料中,评价了对中华草蛉Chrysoperla sinica Tjeder成虫产卵和寿命等参数的影响.结果显示,转Bt基因水稻"克螟稻"花粉中表达cry1Ab杀虫蛋白,且表达量较高.分别用含5%KMD1、KMD2和XS11花粉的人工饲料饲喂中华草蛉初羽化成虫,发现两类Bt水稻花粉对该虫产卵前期、产卵量、产卵天数和成虫寿命等参数均无显著影响.人工饲料中水稻花粉的比例上升至20%和80%后,KMD1、KMD2和XS11花粉饲料处理中的草蛉均出现产卵前期延长、产卵量减少和产卵天数缩短的趋势,但在同一花粉比例下这些参数在3个花粉饲料处理间均无显著差异.结果表明,Bt水稻花粉中cry1Ab杀虫蛋白对该草蛉成虫产卵和寿命等参数无显著的负面影响.     

转cry1Ab基因粳稻对稻纵卷叶螟成虫产卵行为的影响

为评价转cry1Ab基因粳稻(KMD1和KMD2)对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenée)成虫产卵行为的影响,采用"Y"型嗅觉仪和笼罩以及田间试验等方法对稻纵卷叶螟成虫对转基因水稻的趋性以及其产卵选择性进行了研究,并利用固相微萃取和GC-MS技术测定了这2种Bt水稻及其对照亲本秀水11挥发物的组成及其相对含量。结果表明,稻纵卷叶螟成虫在"Y"型嗅觉仪和小型笼罩内对Bt水稻和对照亲本的选择性差异不显著,而在大型笼罩和田间条件下均显著趋向于在非转基因水稻上产卵,其中大田中稻纵卷叶螟在KMD1、KMD2和对照中的百叶卵量分别为2.20±1.28、1.00±0.77和5.60±2.16粒。水稻挥发物的组成及其相对含量在Bt水稻及其对照亲本之间差异不显著。表明相对于Bt水稻,在田间条件下稻纵卷叶螟成虫趋向于在非转基因水稻产卵,而水稻挥发物可能不是引起这种行为趋性的直接原因。     

转Bt基因玉米(瑞丰125、DBN9936、DBN9978)对亚洲玉米螟的抗虫效果研究

评价转Bt基因玉米对靶标生物亚洲玉米螟的杀虫作用是转基因玉米研发的重要一环。本文采用室内生测法对3种转Bt基因抗虫玉米‘瑞丰125’(表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白),‘DBN9936’‘DBN9978’(表达Cry1Ab杀虫蛋白)对亚洲玉米螟敏感品系ACB-S及抗Cry1Ab品系ACB-AbR、抗Cry1Ac品系ACB-AcR、抗Cry1F品系ACB-FR、抗Cry1Ah品系ACB-AhR、抗Cry1Ie品系ACB-IeR的杀虫活性进行测定,同时采用心叶期和抽丝期人工接虫法进行田间抗虫效果鉴定。结果表明,取食3种Bt玉米的ACB-S幼虫, 3 d死亡率100%,而取食对照常规玉米3 d存活率100%。取食3种Bt玉米的5个抗性品系幼虫除ACB-AbR和ACB-AcR有2%~6%的个体存活4~5 d, 6 d死亡率也达到了100%,其余品系均在3 d全部死亡,而取食对照玉米5~6 d的死亡率仅为4%~14%,差异显著。田间心叶期食叶级别及穗期活虫数、雌穗被害和茎秆被蛀等为害等级说明3种Bt玉米高抗亚洲玉米螟。明确了‘瑞丰125’‘DBN9936’和‘DBN9978’对亚洲玉米螟有很高的杀虫活性和田间防治效果。5个Bt蛋白抗性亚洲玉米螟品系幼虫在常规玉米上显示一定的适合度劣势。     

新疆南部棉区转Bt基因棉花对棉铃虫抗性的季节性变化规律

采用ELISA检测和室内生物测定方法,测定6个转Bt基因棉花品种(系)不同生育期叶片中的Bt毒蛋白含量及其对各世代棉铃虫的抗性水平。转Bt基因棉花叶片中的Bt毒蛋白含量总体上随着棉花生育期的推进而逐渐下降,6个品种(系)叶片的Bt毒蛋白含量子叶期最高,达1 210.03～1 733.15 ng/g,与子叶期相比,三叶期、七叶期、盛蕾期、花铃期、吐絮期Bt毒蛋白含量减少幅度为2.5%～96.0%。6个品种(系)对第4代棉铃虫幼虫抗虫性较低,毒杀效果仅为19.0%～41.3%。幼虫的校正死亡率逐代下降,各棉花品种对第4代幼虫的校正死亡率仅为12.0%～36.2%。     

Development of insect‐resistant transgenic rice with Cry1C*‐free endosperm

BACKGROUND: Yellow stem borer (Tryporyza incertulas Walker), striped stem borer (Chilo suppressalis Walker) and leaf folder (Cnaphalocrocis medinalis Guenec) are three lepidopteran pests that cause severe damage to rice in many areas of the world. In this study, novel insect‐resistant transgenic rice was developed in which Bt protein expression was nearly absent in the endosperm. The resistant gene, cry1C*, driven by the rice rbcS promoter (small subunit of ribulose‐1,5‐bisphosphate carboxylase/oxygenase), was introduced into Zhonghua 11 (Oryza sativa L. ssp. japonica) by Agrobacterium‐mediated transformation. RESULTS: A total of 83 independent transformants were obtained, 19 of which were characterised as single‐copy foreign gene insertion. After preliminary screening of the T₁ families of these 19 transformants in the field, six highly insect‐resistant homozygous lines were selected. These six homozygous transgenic lines were field tested for resistance to leaf folders and stem borers, and for their agronomic performance. The Cry1C* protein levels in leaves and endosperm were measured by ELISA. Subsequently, the elite transgenic line RJ5 was selected; this line not only possessed high resistance to leaf folders and stem borers, normal agronomic performance, but also Cry1C* expression was only 2.6 ng g^?1 in the endosperm. CONCLUSION: These results indicated that RJ5 has the potential for widespread utility in rice production. Copyright © 2009 Society of Chemical Industry     

转苏云金杆菌毒蛋白基因水稻抗螟性的离体叶片测定法

提出了转苏云金杆菌ｃｒｙｌＡｂ基因水稻抗螟性的快速离体叶片测定法,并用该方法评价了转ｃｒｙ１／Ａｂ基因水稻对二化螟、三化螟和大螟的抗性程度。结果表明,３种螟虫蚁螟取食纯合株系ＰＲ１６及分离株系ＰＲ１８、ＰＲ５７或ＰＲ５８中抗性植株中片后,食叶量与对照和分离株系中的非抗性植株相比极显著下降,接虫后第４ｄ的幼虫死亡率高达１００％。该方法评价转ｃｒｙ１／Ａｂ基因水稻对３种螟虫的抗性结果与活化成株测定法评     

Development and characterisation of transgenic rice expressing two Bacillus thuringiensis genes

BACKGROUND: Transgenic crops that produce insecticidal toxins from the bacterium Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) were first commercialised in 1996. The risk that pests have the potential to evolve resistance to Bt toxins is one of the most serious challenges to this technology. Gene stacking, pyramiding two Bt genes into one variety, is considered to be an effective insect resistance management (IRM) strategy. In this study, insect‐resistant rice expressing two Bt genes was developed by sexual crossing, and then characterised. RESULTS: Homozygous rice lines of two pyramided Bt genes were obtained in the F₃ generation. Quantification of Bt toxin showed that protein concentrations of Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2A in the two‐gene lines were comparable with their single‐gene parents, while the expression of cry1C gene decreased after gene stacking. Four two‐gene lines showed higher activity to striped stem borer (Chilo suppressalis Walker) than parental lines in the laboratory bioassay. All pyramided lines and their hybrids exhibited excellent efficacy against stemborers and leaffolders in field evaluation, while most pyramided lines had no significant differences from original variety in yield under spraying of insecticide. CONCLUSION: These results demonstrate that the two‐gene lines have commercial potential and could serve as a valuable IRM strategy. Copyright © 2011 Society of Chemical Industry     

Marker‐free,tissue‐specific expression of Cry1Ab as a safe transgenic strategy for insect resistance in rice plants

BACKGROUND: Rice is the major food resource for nearly half of the global population; however, insect infestation could severely affect the production of this staple food. To improve rice insect resistance and reduce the levels of Bt toxin released into the environment, the Cry1Ab gene was conjugated to the rice rbcS promoter to express Bt toxin in specific tissues of transgenic plants. RESULTS: Eight marker‐free, T₂ lines were separated from the T₀ cotransformants. Using RT‐PCR, high levels of Cry1Ab expression were detected in the leaf but not in the seed. The Cry1Ab protein level ranged from 1.66 to 3.31 µg g^?1 in the leaves of four transgenic lines, but was barely detectable in their seeds by ELISA. Bioassays showed that the mortality rate of silkworm larvae feeding on mulberry leaves dipped in transgenic rice flour and pollen was less than that of the positive control (KMD), and that their average weight was higher than that of KMD, suggesting that the Cry1Ab protein was not expressed in the seed and pollen. CONCLUSION: The transgene conferred a high level of resistance to insects and biosafety to the rice plants, which could be directly used in rice breeding. Copyright © 2012 Society of Chemical Industry     

不同条件下转cry1Ab基因玉米植株残体中杀虫蛋白降解动态

为明确转cry1Ab基因玉米植株残体中Cry1Ab杀虫蛋白在不同条件下的降解动态,选取转cry1Ab基因玉米MON810和Bt11,采用ELISA方法测定4种条件下秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量。结果表明,在不同条件、不同取样时间,2种玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的残留量差异显著;整株秸秆中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度比粉碎后的慢;秸秆粉碎埋入土壤后播种冬小麦,玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度最快,且可完全降解;在不同条件下,MON810玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度比Bt11玉米慢,MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的DT50分别为10.2~207.8、13.6~124.0 d,DT90分别为185.1~368.3、45.2~224.0 d。研究表明,在不同条件下MON810和Bt11玉米秸秆中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度不同,依次为秸秆粉碎后埋在土壤后种植冬小麦秸秆粉碎埋在玉米田土壤中秸秆粉碎后放在地表整株秸秆放在地表。     

嘧草醚在水稻及其环境中的残留

采用改良的QuEChERS-高效液相色谱-质谱 (HPLC-MS) 技术，建立了嘧草醚在水稻及其环境中残留量的检测方法。样品经V (乙腈) : V (甲酸) = 199 : 1的混合溶液提取，由十八烷基键合硅胶 (C₁₈) 或C₁₈ + 丙基乙二胺 (PSA) 吸附剂净化。以V (乙腈) : V (0.1%甲酸水溶液) = 70 : 30的混合溶液为流动相，经ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱分离，采用电喷雾正离子 (ESI+) 模式扫描，HPLC-MS检测，外标法定量。结果表明:在0.01~1 mg/L范围内嘧草醚的峰面积与其质量浓度间线性关系良好，在乙腈、稻田水、土壤、稻株、糙米和稻壳中的相关系数均大于0.99。嘧草醚在稻田水中的检出限 (LOD) 为0.0015 mg/L，定量限 (LOQ) 为0.005 mg/L，在土壤、糙米、稻壳和稻株中的LOD分别为0.003、0.015、0.015 和0.003 mg/kg，LOQ分别为0.01、0.05、0.05 和0.01 mg/kg。在0.005、0.01和0.1 mg/L (或mg/kg) 添加水平下，嘧草醚在稻田水、土壤和糙米中的平均回收率分别为95~109%、92%~106%和89%~107%，相对标准偏差 (RSD) 分别为3.0%~5.0%、1.1%~2.9%和3.1%~3.7%；在稻壳和稻株中的平均回收率分别为95%~102%和93%~107%，RSD分别为1.1%~3.8%和3.5%~9.9%。该方法灵敏度、精密度和准确度均符合农药残留分析要求。     

对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及cry基因鉴定

为获得对大黑鳃金龟甲幼虫具有较高杀虫活性的菌株,利用拌土法测定了本实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对大黑鳃金龟甲的杀虫活性,建立Bt菌株比较鉴别技术来进行多样性分析,并对菌株的晶体形态及幼虫感染Bt后的中肠组织切片进行观察。结果显示,从500株Bt菌株中筛选到42株对大黑鳃金龟甲幼虫具有不同程度活性的菌株,分属于14个菌株类型;其中有10株校正死亡率大于60%,261-1菌株杀虫活性最高,7 d校正死亡率达100%。从14个菌株类型中各选取1个代表菌株进行基因鉴定,仅P65-1、1126-1、FCD114和78-2菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea共5个cry8类新基因,其它10个菌株均不含cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。14个菌株中,78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体,261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体。幼虫感染261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2菌株后,中肠组织发生明显的病理变化:2 d时肠壁细胞明显出现空洞化,排列疏松,4 d时受到严重破坏并脱离底膜。表明筛选到的Bt菌株具有防治大黑鳃金龟甲幼虫的潜力。     

水稻抗白叶枯病基因Xa47(t) a的敲除及抗性鉴定

为鉴定水稻Xa47(t)a基因对白叶枯病的抗性,以水稻种质L214为材料,通过构建针对Xa47(t)a基因的Xa47(t)a-Cas9敲除载体来获得敲除突变体,利用生物信息学技术对突变的Xa47(t)a基因进行突变类型分析,同时采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术分析突变体中Xa47(t)a及病程相关基因的表达情况,并于水稻孕穗期对突变体及其野生型植株接种11株白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae菌株进行抗性鉴定。结果表明,在Xa47(t)a基因的第2外显子区域进行基因编辑后成功获得25株T₀代突变体株系;测序分析发现T₀代突变体株系中有13种不同的突变体类型,其中纯合突变体有3种类型,且突变位点均在靶标位点的11位碱基处缺失1～4个A碱基;氨基酸序列分析发现大部分突变体中Xa47a编码的蛋白翻译会提前终止,由原来的803个氨基酸变为144～166个氨基酸;qPCR分析结果表明突变体中Xa47(t)a及大部分病程相关基因的表达水平显著低于野生型株系;抗性鉴...