嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡后鳜IgM基因表达量和抗体效价的变化

应用荧光定量PCR技术,研究了嗜水气单胞菌疫苗浸泡免疫后,鳜(Siniperca chuatsi)鳃、皮肤、脾脏和头肾中IgM基因表达量变化,同时应用ELISA检测皮肤黏液和血清中抗体滴度变化。结果显示:最早检测到IgMmRNA转录水平上调的是皮肤和鳃(第4天),而脾脏和头肾在第7天才达到高峰。IgM基因在头肾和脾脏中表达量较高(高峰值分别达到16.3和23.8),皮肤和鳃中的表达量较小(高峰值分别为4.3和8.6)。抗体效价方面,皮肤黏液中抗体滴度峰值出现时间较早(第7天),但抗体从开始形成到消失持续时间较短(28 d);血清中抗体滴度峰值出现时间较迟(第21天),但持续较长(42 d)。结果表明:浸泡免疫能够引发鳜机体和局部均出现免疫应答。从抗体滴度和IgM基因表达量方面考虑,系统免疫组织均高于黏膜免疫组织,表明前者是合成IgM的主要场所。从时间上比较,对抗原刺激最早做出应答的是皮肤黏膜和鳃,其后系统免疫才表现应答作用,这表明了局部黏膜能够在抗原入侵的早期起到抵制作用。     

紫红笛鲷血细胞发生研究

将体质量510~620 g的紫红笛鲷用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉后解剖,取出头肾、体肾、肝脏、脾脏,用干净的刀片居中横切、纵切,印片和涂片用Wright-Giemsa染液染色10 min,观察头肾、体肾、脾脏、肝脏4个组织印片以及外周血涂片。试验结果显示,头肾、体肾、脾脏是其造血器官。头肾能发育生成各类型血细胞,体肾能生成红细胞、淋巴细胞、粒细胞和单核细胞,脾脏能生成淋巴细胞。肝脏中未发现幼稚型血细胞。红细胞发育经过原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞和红细胞5个阶段;原粒细胞发育至早幼粒细胞后,分化为嗜碱性中幼粒细胞、嗜酸性中幼粒细胞和中性中幼粒细胞,最后发育成嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞;淋巴细胞和单核细胞发育经过原始、幼稚和成熟3个阶段。血细胞在发育过程中,胞体逐渐变小,细胞核逐渐变小,染色质由疏松到致密;粒细胞中,颗粒由少到多。     

人IgG诱导尼罗罗非鱼特异性抗体分泌细胞的ELISPOT检测

通过酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测了经人 IgG 免疫后尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)头肾、外周血和脾脏中的特异性抗体分泌细胞(antibody secreting cell, ASC)数量。结果表明, 首次免疫 1 d 后可在头肾中检测出 ASC, 而外周血和脾脏第 3 天才能检测出 ASC; 头肾、外周血以及脾脏中的 ASC 均在第 12 天达到峰值, 随后头肾, 外周血中的 ASC 数量显著减少, 而在脾脏中 ASC 数量减少不显著。二次免疫 1 d 后在头肾、外周血和脾脏中均可检测到 ASC, ASC 数量均在第 9 天达到峰值, 时间早于首次免疫, 且在首次免疫和二次免疫中, 头肾组织的 ASC 数量均是 3 个组织中最高的。酶联免疫吸附试验(ELISA)分别对首次免疫和二次免疫后血清中的抗体水平检测发现, 其变化趋势与 ASC 数量变化规律相同。研究结果表明, 尼罗罗非鱼在初次免疫后产生了免疫记忆, 在二次免疫过程中产生了更多的 ASC 和抗体, 头肾是 ASC 的主要来源组织。该结果可为鱼类的免疫记忆研究提供重要的科学依据。     

壳聚糖和益生菌对暗纹东方鲀抗病力和免疫功能的影响

为了解壳聚糖和益生菌刺激和增强免疫应答的可能作用,本试验在基础饲料中添加0.2%、0.5%、1.0%的壳聚糖,0.1%、0.2%、0.4%的益生菌,甘露聚糖与益生菌混合物,壳聚糖与益生菌的混合物,在室内水泥池中喂养暗纹东方鲀(3.15±0.05)g 2个月,根据抗菌活力筛选出免疫增强饲料组(0.2%壳聚糖,0.1%、益生菌,甘露聚糖与益生菌混合物,壳聚糖与益生菌混合物)测定免疫功能。结果表明,甘露聚糖与益生菌混合物仅提高头肾T淋巴细胞转化,壳聚糖与益生菌混合物显著增强头肾T、B淋巴细胞转化和脾脏B淋巴细胞体外培养时分泌的IgM。筛选出的四种免疫增强饲料均能使头肾B淋巴细胞体外培养时分泌的IgM显著增加。无论是脾脏B淋巴细胞还是头肾B淋巴细胞,体外培养时所分泌的IFN-α都不同程度地受抑制。     

牙鲆免疫相关组织特征及抗体阳性细胞的免疫组化定位

应用抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体(2D8、1H1)对牙鲆外周血系统、肾、脾、肝、胰、肠道组织中抗体阳性细胞进行了定位观察，并对其组织学特征进行了描述。两株单抗均能在外周血滴片和组织切片中成功地检测到抗体阳性细胞。外周血系统中的抗体阳性细胞主要为淋巴细胞，没有发现抗体阳性的巨噬细胞；牙鲆头肾中没有肾单位，肾小管、肾小球等主要存在于后肾中，脾脏和肾脏都含有巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞等免疫相关细胞，抗体阳性细胞存在方式也极为相似，成簇或单独分布于黑色素巨噬细胞中心和血管周围；牙鲆的胰组织镶嵌在肝上，形成肝胰脏，也参与免疫应答，抗体阳性细胞单个存在，分布于肝组织中，胰组织中没有发现抗体阳性细胞；肠道抗体阳性细胞主要存在于固有层中，有成簇存在现象，在上皮层也可见到单个存在的抗体阳性细胞。     

拥挤胁迫对已接种疫苗的大菱鲆部分免疫和应激指标的影响

通过对3个养殖初始密度(低、中、高密度组分别为5、10、20 kg/m~2)的大菱鲆(Scophthalmus maximus)接种减毒迟缓爱德华氏菌疫苗,观察其血液、脾脏、头肾、鳃和皮肤中部分免疫和应激指标的变化规律,研究经接种疫苗操作后大菱鲆应对拥挤胁迫的应激响应。结果显示,低密度养殖的白细胞介素(1L-1β)、补体(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等免疫指标显著高于中、高密度组(P0.05),高密度组血液中皮质醇的含量高于中、低密度组(P0.05);通过基因表达分析发现,高密度组的热休克蛋白(HSP70)表达量显著高于中、低密度组;低密度组的免疫球蛋白M(IGM)表达量高于中、高密度组。研究表明,为提高大菱鲆的免疫效果、减少应激反应,可以采用低密度(5 kg/m~2)养殖。     

暗纹东方鲀血细胞发生的观察

通过对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)血液涂片及头肾、体肾、脾脏和肝脏四种脏器印片的光镜观察,发现血细胞的发育大致经过三个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。实验对不同发育阶段的红血细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞进行了观察和测量,并对暗纹东方鲀血细胞的发生过程做了初步探讨。实验结果表明暗纹东方鲀血细胞的发育主要在头肾和体肾,肝脏印片未观察到原始造血细胞,提示肝脏可能不是暗纹东方鲀的造血器官。     

淡水石斑鱼血细胞发生的观察

通过对淡水石斑鱼血涂片及头肾、肾、脾和肝脏器印片的光镜观察,发现血细胞的发育大致经过3个阶段,即原始阶段、幼稚阶段、成熟阶段。试验对脏器中不同发育阶段的红血细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞进行了观察和测量,并进行了分类统计。试验结果表明头肾、肾和脾是淡水石斑的主要造血器官,肝组织印片上未观察到原始阶段血细胞,提示肝脏不是淡水石斑鱼的造血器官。     

Use of an ELISA-based assay for the detection of antibody-secreting cells in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque)

Abstract. An ELISA-bascd plaque assay for the detection and quantification of antibody-secreting cells has been adapted for use in fish. The assay involves incubating catfish lymphocytes in 24-well plates previously coated with the antigen of interest. Cells producing antibody to the antigen leave an immunological fingerprint of bound antibody which is detected through the use of an ELISA technique to yield a colored plaque (Elisaplaque). Specificity of the assay was established by demonstrating that cells taken from fish vaccinated with an antigen exhibit the greatest response on plates coated with the given antigen. A strong positive correlation was also demonstrated between the number of Elisaplaques generated and serum agglutination titre. Using the ELISA plaque assay, it was found that antibody-secreting lymphocytes located at a different density interface and behaved differently from other lymphocyte populations when separated through discontinuous Percoll gradient centrifugation. Among the haematopoietic organs examined, the head kidney appeared to produce more antibody-secreting cells per million lymphocytes than did spleen or peripheral blood lymphocytes.     

细鳞鲑早期发育过程中免疫器官发生

应用连续切片技术和显微观察法,对胚胎末期至仔鱼期的细鳞鲑(Brachymystax lenok)免疫器官(头肾、胸腺及脾组织)早期发育进行了系统研究。研究表明,在实验水温为10.0～16.2℃时,细鳞鲑的免疫器官原基发生及其淋巴化的先后顺序均为胸腺、头肾和脾。仔鱼出膜前5 d胸腺原基形成,出膜前1 d胸腺即出现少量淋巴细胞,仔鱼19日龄后,结缔组织和毛细血管渗入胸腺实质而形成小梁,仔鱼35日龄左右,胸腺己经分化出模糊的内区和外区;仔鱼出膜前2 d,出现头肾原基,由未分化的造血干细胞组成,仔鱼3日龄后,头肾由肾小管构成,10日龄后,组织开始淋巴化,仔鱼35～45日龄,肾小管上皮细胞开始退化,头肾内出现血窦,并进一步淋巴化,50日龄后,肾小管退化完毕,头肾主要由淋巴组织和大量血窦构成;5日龄细鳞鲑仔鱼,脾原基出现,16日龄后,脾开始淋巴化,35～50日龄,脾内建立起发达的微血管系统以及血窦结构。细鳞鲑的免疫器官分化较早,其发育速度较其他淡水硬骨鱼类相对滞后,但组织淋巴化速度较快。本研究旨在揭示细鳞鲑早期死亡率高的根本原因,为实现细鳞鲑的规模化养殖提供科学基础。     

Individual variations in behavior and free cortisol responses to acute stress in tiger pufferfish Takifugu rubripes

Abstract:   The aim of the present study was for individual variation in behavior to be characterized and related to differences in physiological stress responses in juvenile tiger pufferfish (fugu) Takifugu rubripes . A set of siblings ( n  = 330) from wild parents was subjected to behavior tests, and some were classified into active and inactive groups ( n  = 42 each group). The active animals consisted of those individuals that kept active swimming during 6 min after transfer from one tank to another, and the inactive animals were those that stopped swimming within 6 min. Time-course acute stress responses, which were elicited by anesthesia and subsequent removal of a pectoral fin, were compared between the active and inactive fish. The stress indicators used were free and total plasma cortisol, and plasma glucose. Although no significant difference was observed at each sampling point between groups, the inactive fish required shorter recovery time from acute stress in all three indicators than the active fish. The percentage of free to total plasma cortisol in the pre-stress condition was significantly lower in the inactive group than in the active group. Our findings indicate that fugu has behavioral variation that is associated with stress responsiveness. The inactive fish are expected to be more tolerant of stress and suitable for aquaculture.     

Blood cleansing cells in head kidney and spleen in Buenos Aires tetra, Hyphessobrycon anisitsi (Eigenmann), (Characidae: Teleostei)

The general structure and cell types in kidney and spleen in Buenos Aires tetra, Hyphessobrycon anisitsi, family Characidae, are described. The capability and capacity of these organs to clean foreign ferritin from the blood stream are analysed and compared. Head kidney was mainly composed of neutrophils, macrophages, lymphocytes and other white blood cells, whereas unmatured and matured red blood cells were few in number. Spleen often contained much red pulp, that is mainly matured red blood cells between splenic cords, often with some macrophages and neutrophils in the latter. Occasionally, this pulp contained large volumes of unmatured red blood cells, particularly in the periphery of the spleen. The splenic white pulp consisted of ellipsoids composed of an inner endothelial layer covered by a thick sheet of white blood cells, which in the periphery consisted mainly of macrophages. Erythrocytes occupied nearly the entire splenic volume in some specimens, whereas up to half of this volume was filled by ellipsoid macrophages, neutrophils, lymphocytes and other white blood cells in other specimens. The macrophages and sinusoidal endothelial cells in kidney and spleen from ferritin-injected specimens were tightly packed by yellow-brown granules or Prussian blue precipitations, in tissue treated with Mallory stain or acid ferrocyanide, respectively, suggesting a large uptake of foreign ferritin. In the present tetra large amounts of white blood cells are developed in head kidney, where macrophages and sinusoidal endothelial cells play important roles in the cleansing of scavenger and foreign molecules and particles from the blood stream. The spleen seems primarily to be a site for iron recycling and production and storage of red blood cells. Sometimes, however, it was rich in macrophages, neutrophils, lymphocytes and other white blood cells, suggesting functions like blood cleansing and non-specific and specific defence in such specimens.     

低温驯化下4种不同品系罗非鱼血清皮质醇与免疫相关指标的变化

选取4种不同品系罗非鱼, 分别为吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)、奥尼罗非鱼(O. niloticus×O. aureus)、红罗非鱼(O. nilotica♂× O. mossambica♀)和奥利亚罗非鱼(O. aureaus)。在26℃水温下饲养3周后, 选取规格基本一致的罗非鱼(体质量50.73 g±4.23 g)进行低温驯化实验。水温以3℃/d的速度从26℃降至8℃, 分别于水温为26℃、20℃、14℃和8℃时进行采样, 比较不同驯化阶段4种不同品系罗非鱼血清皮质醇和免疫相关指标的变化规律。结果表明, 与26℃时的免疫指标相比, 水温降至8℃时, 吉富与红罗非鱼血清皮质醇水平显著升高; 然而血清C3、C4、IgM以及头肾C型溶菌酶mRNA水平显著下降(P<0.05), 血清中高皮质醇水平对鱼体的免疫产生了抑制作用。水温为8℃时, 奥尼罗非鱼血清皮质醇、IgM和补体C3以及头肾抗菌肽mRNA水平显著升高; 奥利亚血清皮质醇、C4和IgM以及头肾C型溶菌酶mRNA水平与26℃时相比无显著差异, 然而血清溶菌酶与C3水平降低。驯化实验结束后, 比较了4种不同品系罗非鱼在8℃水温下48 h内的累积死亡率。吉富与红罗非鱼组累积死亡率较高, 分别达到43.3%和40.0%; 奥尼罗非鱼其次, 为23.3%; 奥利亚罗非鱼最低, 为20.0%。较高的血清IgM和头肾溶菌酶和抗菌肽mRNA水平可能有助于提高奥尼和奥利亚罗非鱼的抗低温应激能力, 增加低温时的成活率。本研究通过分析4种品系罗非鱼不同驯化阶段血清皮质醇和免疫相关指标, 探讨不同品系罗非鱼在低温驯化过程中的免疫保护机制, 旨在为下一步抗低温新品系罗非鱼的选育提供理论依据。

     

3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异

为研究处于同一时期但养殖条件不同的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼体规格与发育状态间是否具有一致性,观察压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏的显微结构,并对压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼进行腹腔注射疫苗处理,实时荧光定量PCR检测免疫7 d后、14 d后各期草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM与MHCⅠ的表达量。结果显示,压塘3月龄草鱼各组织发育较普通3月龄草鱼迟缓。压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼在免疫后,头肾、中肾、肠道与脾脏中IgM和MHCⅠ的表达量均有上升,且IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍;MHCⅠ为56.02倍。结果表明,草鱼出血病活疫苗可以增强草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM和MHCⅠ的表达,且在3月龄时期进行注射免疫效果最佳。     

四指马鲅淋巴器官发育组织学观察

采用石蜡组织连续切片和HE染色技术,对1~60 dph(Days post hatching)四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)的淋巴器官个体发育进行研究,描述了淋巴器官发育特点及组织学特征。结果显示,在盐度为9.0±0.5,水温为(28±2)℃条件下,3 dph胸腺原基出现,由4~6层未分化干细胞和淋巴母细胞样的细胞组成;胸腺发育迅速,主要由淋巴细胞填充;至25 dph皮质区和髓质区分明显,胸腺发育基本完成。3 dph头肾原基形成,由前肾管和少量造血干细胞组成;5 dph胸腺淋巴细胞向头肾迁移,头肾开始淋巴化;随着鱼体生长,造血干细胞分化成不同类型细胞;18 dph前肾管开始退化,至53 dph完全消失,头肾主要由网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成。7 dph脾脏原基形成,至16 dph开始淋巴化;脾脏内皮系统较头肾发达,但其发育速度较胸腺和头肾慢,淋巴细胞明显少于胸腺和头肾。研究表明,四指马鲅淋巴器官原基出现及淋巴化的顺序是胸腺、头肾、脾脏。免疫淋巴器官结构及功能尚未发育完善,可能是四指马鲅在变态期间幼体死亡率高的主要原因之一。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响

为研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)灭活疫苗对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(250 g±12 g)免疫力和抗病力的影响,给试验鱼腹腔注射0.2 mL的灭活嗜水气单胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)。分别在注射前(0 d)和注射后7、14、21、28、35、42 d取样,测定血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶(LZM)活力、补体C3含量以及头肾和脾脏中IgM、IgT基因表达情况。结果表明:注射嗜水气单胞菌疫苗能显著提高白细胞吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)、LZM活力和补体C3含量,注射后21 d达峰值,PI、LZM和补体C3在42 d仍显著高于对照组。免疫后21 d头肾和脾脏中IgM基因上调表达,35 d达峰值(分别上升24倍和26倍),42 d下降但仍极显著高于对照组。头肾和脾脏中IgT的上调表达比IgM弱得多,头肾35 d达峰值(上升6.2倍),脾脏28 d达峰值(上升6.1倍)。免疫42 d后嗜水气单胞菌攻毒结果表明,嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用,免疫保护率达到71.43%。     

GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性

为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平。结果显示,经GCRV弱毒疫苗免疫的草鱼母本血液、早期胚胎及幼鱼阶段IgM蛋白活性均显著高于对照组样品。子代各阶段中,28日龄的夏花样品IgM蛋白活性水平最高,而5日龄水花样品中蛋白活性最低;从受精卵发育至3日龄水花阶段,实验组样品免疫因子C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组;2组鱼中IgM、C3和LSZ蛋白的活性水平随着发育进行,总体上呈先下降后升高的趋势,从卵细胞至3日龄水花阶段实验组样品C3和LSZ蛋白活性水平均显著高于对照组。实验组和对照组受精卵IgM基因的表达水平差异最大,实验组表达量为对照组的3.4倍。从24 h器官形成期至3日龄水花样品中,实验组C3基因的表达水平显著高于对照组。从卵细胞至3 h囊胚期阶段,实验组LSZ基因表达水平显著高于对照组。实验组2月龄草鱼体肾、头肾、脾脏组织中IgM基因表达量均显著高于对照组;感染GCRV病毒后,实验组死亡尾数(2尾)低于对照组死亡尾数(5尾)。研究表明母源性免疫可在草鱼进行代间传递,并对子代起到一定程度的免疫保护作用。