大豆异黄酮对褐牙鲆免疫细胞功能的体外研究

在超净台内剖取、研磨褐牙鲆头肾,用Ortuńo的方法分离头肾巨噬细胞;无菌抗凝尾静脉抽血分离外周血白细胞。用含有0、0.1、0.5、1.0、1.5mg/mL和2.0mg/mL大豆异黄酮的细胞培养液分别体外培养这些细胞,24h后分别测定细胞的氧呼吸爆发活力、增殖活力及吞噬活力等免疫指标。试验结果表明,在体外培养下,大豆异黄酮显著影响褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞免疫力(P0.05),且随着培养液中大豆异黄酮质量浓度的增加,上述细胞免疫力先增后降。当培养液中大豆异黄酮质量浓度为0.5mg/mL时,褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞的氧呼吸爆发活力、增殖活力以及吞噬活力显著高于其他处理组(P0.05);而当大豆异黄酮质量浓度达到2mg/mL时,显著抑制褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞免疫力(P0.05)。在本试验条件下,体外细胞培养中添加0.5mg/mL大豆异黄酮促进了褐牙鲆头肾巨噬细胞和外周血白细胞的免疫力;2mg/mL大豆异黄酮则明显抑制细胞免疫力。     

香菇多糖和黄芪多糖对鲤免疫细胞的活性和IL-1β体外诱生表达的影响

为了探讨香菇和黄芪多糖对鲤免疫细胞的免疫活性作用,采用Percoll密度离心等技术,对鲤的头肾巨噬细胞和外周血白细胞进行分离纯化,并离体培养,从细胞和分子水平上研究了香菇和黄芪多糖的免疫调节作用.巨噬细胞和外周血白细胞分别体外暴露不同浓度的黄芪多糖和香菇多糖后,采用MTT法测定它们对鲤外周血白细胞增殖的影响;NBT还原法和Griess试剂显色法测定对头肾巨噬细胞的呼吸爆发的影响;实时定量PCR法测定头肾巨噬细胞细胞因子IL-1β诱导表达的影响.结果显示,黄芪和香菇多糖作用头肾巨噬细胞24 h后,香菇多糖浓度为1,10,100μg·mL-1时能显著诱导巨噬细胞的氧爆发活性,黄芪多糖则没有显著的诱导作用;黄芪和香菇多糖作用头肾巨噬细胞96 h后,香菇多糖低浓度时对细胞的氮呼吸爆发活性无显著影响,黄芪多糖浓度10μg·mL-1能显著诱导氮呼吸爆发活性,而在浓度为1000μg·mL-1两者均表现为高浓度抑制作用;两者作用外周血白细胞24 h后,香菇多糖浓度为100,1000 μg·mL-1和黄芪多糖浓度为10,100μg·mL-1时都能显著促进鲤外周血淋巴细胞的增殖;两种多糖作用头肾巨噬细胞24 h后能显著增强IL-1β的体外诱导表达.结果表明黄芪多糖和香菇多糖对离体培养鲤免疫细胞有明显活性作用,对鲤非特异性免疫和特异性免疫具有促进作用.     

牙鲆头肾巨噬细胞的分离培养与鉴定

本研究使用密度梯度离心法从牙鲆(Paralichthys olivaceus)头肾中分离得到了巨噬细胞,通过差速贴壁法对获得的细胞进行纯化,后续经过优化培养条件和培养过程,采用L-15培养基(Gibco)、5%胎牛血清、1%青–链霉素、1%非必需氨基酸、30% L929细胞培养基在24℃、无CO2的条件下进行培养。显微镜观察及吉姆萨染色结果显示,贴壁细胞具备巨噬细胞形态特征,使用巨噬细胞特异性基因标记mpeg1基因对细胞进行鉴定,在分离得到的细胞中成功扩增出该基因。本研究为体外研究巨噬细胞功能、深入了解硬骨鱼先天性免疫奠定了基础。     

Fe~(3+)浓度对淡水蛋白核小球藻Chlorella pyrenodiosa生长的影响

在500m L锥形瓶中加入培养基250m L,将氯化铁配制成Fe~(3+)浓度为0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、9μmol/L、12μmol/L、15μmol/L、18μmol/L、24μmol/L、30μmol/L,和36μmol/L 10个梯度,然后在10000Lux光强和恒温28℃下连续培养16d,研究Fe~(3+)浓度对淡水蛋白核小球藻Chlorella pyrenodiosa生长的影响。结果显示:不同浓度的Fe~(3+)先是促进藻类生长,第14d时藻种吸光度最大,是起始浓度的80倍左右,15d后开始抑制藻的生长。这可能是引起藻类爆发、水体富营养化的原因之一。因此治理此类问题时,也要考虑铁离子对藻类生长的影响。     

培养温度对LPS诱导的离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响

为研究温度对离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响,从大黄鱼头肾组织中分离巨噬细胞结合贴壁筛选法得到细胞单层后,在不同温度(16、22和28°C)下培养备用。使用25μg/mL的脂多糖(LPS)孵育细胞2 h后,测定不同培养温度下离体细胞活力、呼吸爆发活性、抗氧化酶(SOD和CAT)活性以及相关基因(SOD、CAT、Hsp70和IL-1β)表达的情况。结果显示,体外培养细胞36 h后,16°C和22°C条件下培养的细胞活力显著高于28°C处理组;LPS处理组大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性显著升高,但SOD和CAT酶活性较对照组显著下降。高温(28°C)显著提高了细胞CAT酶的活性和基因表达水平,但SOD酶活性和基因表达变化差异不显著;LPS显著促进了大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β基因的表达,并且随培养温度升高细胞IL-1β基因的表达水平显著降低;但大黄鱼头肾巨噬细胞Nrf2和Hsp70的基因表达量随温度升高而显著增加,且LPS处理组细胞基因表达水平显著高于对照组。研究表明,温度显著影响了离体大黄鱼头肾巨噬细胞的抗氧化能力和LPS所诱导的促炎基因的表达,Nrf2和Hsp70在这一过程中可能发挥重要作用。     

聚维酮碘、硫酸铜及氯氰菊酯对漠斑牙鲆幼鱼的急性毒性试验

研究了聚维酮碘、硫酸铜、高效氯氰菊酯三种药物在一定条件下对漠斑牙鲆幼鱼(70日龄)的毒性效应。结果表明:聚维酮碘的安全浓度为4.062g/mL;24h半致死浓度为55.296 mg/L,48h半致死浓度为34.560mg/L。硫酸铜的安全浓度为0.667mg/L,24h半致死浓度为2.812mg/L,48h半致死浓度为2.600mg/L。高效氯氰菊酯的安全浓度为0.079μg/L,24h半致死浓度为7.112μg/L,48h半致死浓度为2.371μg/L。     

谷氨酰胺对点带石斑鱼免疫细胞免疫力的影响

将从平均体质量400 g的点带石斑鱼中肾分离出的白细胞培养在添加0、0．5、1、2 mmol／L 谷氨酰胺的培养基中2、6、12、24 h后,测定白细胞的吞噬和呼吸爆发活力,结果发现,添加谷氨酰胺后白细胞的吞噬和呼吸爆发活力显著提高,随着培养时间的延长,吞噬和呼吸爆发活力进一步提高,最高值均在培养12 h后的1 mmol／L组。在培养12、24 h后测定了白细胞的增殖能力,发现培养12 h后,添加谷氨酰胺的各组增殖效果明显优于未添加谷氨酰胺组（对照组）（ P＜0．05）,但添加谷氨酰胺的各组之间差异不显著（P＞0．05）,最高值在1 mmol／L组;培养48 h后,除2 mmol／L组外,其他处理组的增殖效果均下降。白细胞对迟钝爱德华氏菌杀菌率变化趋势与吞噬活力相符,1、2 mmol／L 组杀菌率显著高于对照组（P＜0．05）,而0．5 mmol／L组与对照组之间差异不显著（P＞0．05）。试验结果表明,谷氨酰胺是石斑鱼有效的免疫增强剂,在培养基中添加1 mmol／L 谷氨酰胺培养12 h效果最佳。     

关于牙鲆Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)白化诱因的探讨

用鱼肝油、鱼油、大豆油和V.A(0、10000、500000IU/L)营养强化的生物饵料培育牙鲆,探讨n3—HUFA和V.A降低白化率的作用和有效浓度。结果表明,饵料缺乏n3—HUFA和V.A是牙鲆种苗白化的主要原因,添加富含n3—HUFA的鱼肝油和10000IU/L的V.A降低白化的效果最好。试验发现,光照强度是牙鲆白化的重要诱因之一。     

溴氰菊酯对河蟹的急性毒性研究

采用换水式渔药毒性试验的方法,在水温20-23℃条件下,用敌杀死（每升含溴氰菊酯25 g）,分别对3种不同规格的河蟹进行急性毒性试验。结果表明：成蟹、幼蟹、扣蟹48小时LC50值分别为2.19μg/L、1.01μg/L、0.67μg/L;96小时LC50值分别为0.65μg/L、0.42μg/L、0.31μg/L;安全浓度分别为0.15μg/L,0.19μg/L,0.46μg/L。     

明矾处理对雨生红球藻形态结构的影响

试验用显微镜和透射电镜观察了不同明矾浓度处理后的雨生红球藻(Haematococcus plu-vialis)的显微和超微结构变化。试验以MAV培养基为基本培养基,在温度为20±1℃、光强为40μmol/m2s条件下进行扩增培养,达到一定量后用不同浓度的明矾进行处理。浓度梯度分别为0、20、40、60、80、100、120、140mg/L,暗处理24h后计算其沉降率,用显微镜和透射电镜观察并拍照,比较其显微与超微形态结构上的差异。结果表明,随着明矾浓度的升高,藻的沉降率逐步上升,明矾可以快速且有效地使雨生红球藻凝集并沉淀,浓度为60mg/L的明矾对雨生红球藻不会造成伤害,但会延迟和影响虾青素的积累。     

金属离子Ni2+和Co2+对卤虫孵化率和变态率的影响

在去除重金属离子的天然海水中添加不同浓度的Ni^2 和Co^2 进行养殖实验，研究了Ni^2 和Co^2 对盐卤虫（Artemia saline)孵化率及变态率的影响。在试验过程中保持温度（27℃）、盐度（30‰）以及pH(=8)恒定。结果表明：当海水中Ni^2 和Co^2 浓度分别为40μg/L和30μg/L时对旧金山湾卤虫的孵化最为有利，当Ni^2 浓度为40μg/L,Co^2 浓度为40μg/L-50μg/L时对其发育变态最为有利。从而得出结论：当海水中Ni^2 浓度在40μg/L范围左右时可促进卤虫的孵化及变态发育，当海水中Co^2 浓度为30μg/L-50μg/L范围内时可促进卤虫的生长发育。     

鲇鱼（Silurus asotus）头肾中含色素的巨噬细胞集结的发生

以实验诱导方法研究了鲇鱼头肾中含色素的巨噬细胞集结（PMA）的发生。结果表明鲇鱼头肾中巨噬细胞（mΦ）存在不均一性，含色素的巨噬细胞（PM）是由网状／纤维状mΦ经过梭状mΦ、圆形红色mΦ和圆形黄红色mΦ等中间阶段发育而来的，实际上是一种已丧失吞噬功能的衰老mΦ，PMA     

硅浓度对纤细角毛藻和三角褐指藻生长及叶绿素荧光特性的影响

在温度为23±1℃,盐度为31,光照强度为100μmol/m2.s的条件下,用含有不同硅浓度(0、12、24、48、96和384μmol/L)的培养基对中国海洋大学微藻种质库保存的纤细角毛藻(Chaetoc-eros gracilis)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)进行培养,研究两种硅藻一次性培养过程中,不同硅浓度对其细胞密度、叶绿素含量以及PSⅡ最大光能转化效率(Fv/Fm)的影响。单因子方差分析结果表明,硅浓度对两种硅藻的生长及光合作用均有显著影响(P<0.05)。纤细角毛藻的细胞密度、叶绿素含量和Fv/Fm比值均随着起始硅浓度的增加而增加,在96μmol/L处达到最大值,其后随着起始硅浓度的增加,上述指标反而下降。三角褐指藻的细胞密度、叶绿素含量和Fv/Fm比值均随着起始硅浓度的增加而增加,在384μmol/L处达到最大值。多重比较结果表明,纤细角毛藻和三角褐指藻生长和进行光合作用的最适硅浓度分别为96和384μmol/L。     

溴氰菊酯对克氏原螯虾的氧化胁迫效应

为了解溴氰菊酯对克氏原螯虾的毒性及致毒机理,采用24h换水式生物试验研究了溴氰菊酯对克氏原螯虾的96h急性毒性,分光光度法检测了6、12、24和48h后0.01、0.02和0.04μg/L溴氰菊酯对肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)的含量等氧化胁迫相关指标的影响。结果表明,24、48和96h的半致死浓度分别为0.1560、0.0993和0.0562μg/L,安全浓度为5.62ng/L;在整个暴露过程中,溴氰菊酯各个处理组都引起了氧化胁迫相关指标的变化。SOD和CAT活力的变化趋势相同,都呈抑制-诱导-抑制的变化规律,MDA含量则一直高于对照组。暴露6h后,0.01μg/L浓度组MDA含量极显著高于对照组(P<0.01),0.04μg/L浓度组MDA含量约为对照组的1.98倍(P<0.05);暴露12h后,MDA仍保持较高水平,0.02μg/L浓度组MDA含量约为对照组的1.76倍(P<0.05);暴露24h后,各浓度组CAT活力分别比对照组上升了70.98%、73.05%和66.67%(P<0.01);暴露48h后,0.01、0.02μg/L浓度组的SOD活力分别下降了...     

中草药提取物黄连素对草鱼肝细胞氧化应激和细胞凋亡的影响

本研究运用细胞生物学研究方法,探讨中草药提取物黄连素对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞(L8824)活力、氧化应激和细胞凋亡的影响。用不同浓度黄连素(0μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)分别处理体外培养的草鱼肝细胞Oh、6 h、12 h和24 h,采用CCK-8法检测细胞活力。结果显示,黄连素浓度和时间对细胞活力有显著交互作用(P0.05),且黄连素浓度对其活力影响差异显著(P0.05),草鱼肝细胞活力随着黄连素的浓度增加先升高后降低(P0.05)。在此基础上,设置了黄连素梯度浓度(0μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)培养草鱼肝细胞12 h后,收集细胞,测定细胞谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)活性,丙二醛(MDA)及活性氧(ROS)含量、细胞凋亡水平和相关基因mRNA表达量。结果表明,与不添加黄连素组相比,当黄连素浓度为100μmol/L时,细胞GOT和GPT活性、ROS和MDA含量显著(P0.05)增加。当黄连素的浓度为25μmol/L和50μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P0.05)升高;当黄连素的浓度增加到100μmol/L时,细胞凋亡水平显著(P0.05)降低。当黄连素的浓度为50μmol/L和100μmol/L时,细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)mRNA表达量显著(P0.05)升高。综上所述,当黄连素浓度超过50μmol/L会抑制细胞的生长,引发氧化应激,影响细胞功能。因此,黄连素在草鱼肝细胞培养液中添加的适宜浓度为25～50μmol/L。     

黄芪对鲤头肾中巨噬细胞的增殖和一氧化氮产量的影响：离体研究

用密度梯度离心分离鲤头肾中的巨噬细胞和嗜中性粒细胞。用RPMI细胞培养液对分离的细胞进行原代培养,在细胞培养液中加入不同浓度的黄芪水提取液来研究黄芪对鲤头肾中免疫细胞非特异性免疫应答的影响。黄芪水提取液单独使用时能刺激鲤头肾中巨噬细胞的增殖,但不能刺激巨噬细胞的氮暴发活性。用黄芪和脂多糖(LPS)混合刺激巨噬细胞和中性粒细胞时,黄芪水提取液能显著提高脂多糖刺激所产生的一氧化氮的产量。研究结果表明,黄芪不仅能刺激巨噬细胞数量的增加,而且能协同脂多糖增强头肾中免疫细胞的功能,从而对机体的非特异性免疫起调节作用。     

磷浓度对盐生杜氏藻和纤细角毛藻叶绿素荧光特性及生长的影响

在温度(23±1)℃,盐度31,光照度5000 lx的条件下,用含有不同磷浓度(0、2.27、18.15、36.3、72.6、290.4μmol/L)的培养基对盐生杜氏藻和纤细角毛藻进行培养,研究2种微藻在一次性培养过程中,不同磷浓度对其PSII最大光能转化效率(Fv/Fm)、叶绿素含量以及细胞密度的影响。单因子方差分析结果表明,在整个培养周期中,磷浓度对两种微藻的光合作用及生长均有显著影响(P<0.05)。盐生杜氏藻的PSII最大光能转化效率、叶绿素含量以及细胞密度均随着起始磷浓度的增加而增加,在290.4μmol/L处达到最大值;纤细角毛藻的PSII最大光能转化效率、叶绿素含量以及细胞密度在18.15μmol/L处达到最大值,而后随着磷浓度的继续升高,其上述指标反而降低。所以盐生杜氏藻和纤细角毛藻进行光合作用和生长的最适磷浓度分别为290.4μmol/L和18.15μmol/L。     

促甲状腺激素释放激素(TRH)对大西洋牙鲆促生长作用

针对促甲状腺激素释放激素(TRH)对大西洋牙鲆的促生长作用进行了试验,将TRH分别以3μg/g和8μg/g的比例添加至颗粒饲料中,通过口服连续10天给药,在试验的第30天和第50天检测各组试验鱼的体重增长率。结果显示8μg/g组试验鱼体重增长明显,2次测量其增长率较对照组分别提高114.21%和70.77%,3μg/g组仅提高24.44%和2.63%。使用SPSS软件对各组试验鱼体重增长率进行差异性分析,8μg/g组试验鱼增重率和对照组存在差异显著(P0.05),3μg/g组牙鲆增重率与对照组无显著性差异(P0.05)。     

锰、铜、锌和铁离子对抑食金球藻生长的影响

研究了不同质量浓度锰离子、铜离子、锌离子和铁离子对抑食金球藻细胞密度、相对生长率和叶绿素含量的影响,试验结果表明,当锰离子、铜离子和铁离子质量浓度分别为0～25μg/L、0～5μg/L和0～12 500μg/L时,抑食金球藻的细胞密度、相对生长率和叶绿素含量均随质量浓度的升高而增加,随着3种重金属离子质量浓度的继续升高,抑食金球藻生长受到不同程度的抑制。不同质量浓度锌离子对抑食金球藻生长均产生抑制作用。选取锰离子、铜离子和铁离子进行正交试验,分析其综合效应。试验结果显示,3种重金属离子对抑食金球藻细胞密度影响程度为铁铜锰。对抑食金球藻细胞密度影响最大的组合为62 500μg/L铁离子、1μg/L铜离子和5μg/L锰离子,但铜离子和锰离子所对应的细胞密度的■值间差异不显著(P0.05)。分析抑食金球藻细胞密度、相对生长率和叶绿素含量与3种重金属离子吸收量的相关性得出,铁离子与上述参数均呈极显著正相关(P0.01),相关系数分别为0.745、0.577和0.870;铜离子和锰离子吸收量与上述3个参数相关性均不显著(P0.05)。因此,铁离子是影响抑食金球藻生长最大的因素。     

低氧水体对尖吻鲈Lates calcarifer(Bloch)头肾巨噬细胞(Head-kidney macrophage)活性的影响

尖吻鲈在水体中含氧量约3.0mg/L状态下(实验组)养殖3天,其吞噬百分率(PA)和吞噬指数(PI)与对照组(含氧量约6.0mg/L)相比无显著变化(P>0.05);在第6天和第9天,实验组的PA和PI比对照组有明显降低(P<0.05);在第12天,实验组与对照组间的PA和PI差异达到极显著(P<0.01)。实验的前6天,实验组与对照组间的动物头肾NBT阳性巨噬细胞数目基本相等;而在第9天后,实验组动物的头肾NBT阳性巨噬细胞数目显著减少(P<0.05)。