鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白,本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株(下简称CyHV-2)感染异育银鲫尾鳍细胞系(GiCF),用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化,纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色后,用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示,透射电镜下观察发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒,也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示,抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应,质谱鉴定显示,其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明,通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后,本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。     

鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大小与预期一致,约为35 kD,且主要分布在包涵体中。Western blot分析显示,免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞;间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞。ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础。     

抗鲤疱疹Ⅱ型病毒卵黄抗体制备及其功能鉴定

为制备抗鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)的卵黄抗体,探索防治异育银鲫(Carassius auratus gibelio)鳃出血病的新方法和途径,本研究利用原核表达系统产生具免疫原性的重组CyHV-2-ORF72衣壳蛋白,纯化后免疫蛋鸡;二次免疫后采用间接ELISA法抽检免疫蛋的特异性卵黄抗体(IgY)含量,收集抗体效价达到1∶8000的免疫蛋。将免疫蛋分成全蛋组与蛋黄组,采用微包膜和冷冻干燥技术,分别制成全蛋粉或蛋黄粉,利用Western blot和ELISA技术检测全蛋粉和蛋黄粉中的IgY特异性及效价。将蛋黄粉稀释液与CyHV-2混合后孵育鲤鱼上皮瘤细胞,进行抗体中和试验。以0.15%和0.30%的添加量分别将抗CyHV-2-ORF72的免疫全蛋粉拌入商品饲料制成功能性饲料,投喂已发病的两个池塘的异育银鲫进行生产性治疗试验。结果显示,全蛋粉和蛋黄粉中的IgY均能特异性地结合CyHV-2-ORF72衣壳蛋白,效价达到1∶8000~1∶16000;抗CyHV-2-ORF72的IgY与CyHV-2具有较好的亲和力,中和活性高于鼠抗ORF72血清;两个池塘异育银鲫成活率分别达到74.3%和87.6%,远高于对照池的28.3%和31.5%。综上所述,本研究制备的抗CyHV-2-ORF72卵黄抗体可特异性地中和CyHV-2病毒,具较显著的免疫保护作用。     

黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备

为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体,笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列,将之克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组表达载体;经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和柱纯化了重组蛋白,通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体;采用Western blot和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性,用间接ELISA技术检测多抗的效价。结果发现成功构建pET/Eakr原核表达载体,并实现了重组蛋白的融合表达和纯化;Western blot检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝4种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达1∶6400。     

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体制备及其特异性分析

为了制备高效的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗体并对其特异性进行鉴定,实验以草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型HZ08株为模板,采用PCR方法扩增S9基因,将该S9基因与p ET-32a(+)载体连接构建p ET-32a-S9原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)后用IPTG诱导表达;纯化后的重组VP6蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,使用间接ELISA方法测定抗体效价,Western blot和IFA试验鉴定抗VP6蛋白多克隆抗体特异性。结果显示草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的S9基因在原核表达载体中能够正确地表达VP6蛋白,纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备的抗VP6多克隆抗体,经间接ELISA方法测定其效价约为1∶105,Western blot和IFA试验结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别GCRVⅡ型毒株,而不能识别GCRV I型、Ⅲ型以及其它病毒,表明该多克隆抗体具有较高的特异性。研究表明制备的抗VP6蛋白多克隆抗体能够特异性识别GCRVⅡ型病毒,为GCRVⅡ型病原学研究及草鱼出血病临床诊断奠定基础。     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。     

基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将p ORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短ORF65(truncated ORF65)插入p ET32a(+)载体,构建了p ET32a-trun ORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、Bepi Pred 1.0软件预测了p ORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入p ET32a(+)载体,构建了p ET32a-mod ORF65。重组质粒分别转入BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,p ET32a-mod ORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 k D。此外,利用r Protein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清Ig M,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的p ORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测p EGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。     

编码鳜传染性脾肾坏死病毒结构蛋白新基因ORF90.5L的鉴定分析

鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidhey necrosis virus,ISKNV)全基因组序列于2001年完成测定,全基因组为111 362 bp,含有124个推测的开放阅读框(ORF).21307年,Eaton等对12株已完成序列测定的虹彩病毒代表株进行分析比较,除了已经推测的ORF外,认为ISKNV基因组中还存在一个的核心基因(core gene)ORF90.5L.本研究以ISKNV的cDNA为模板,根据Eaton等报道中推测的上下游位点设计引物扩增出一段963 bp的PCR产物.该序列编码一个320个氨基酸的蛋白质,推测分子量为35 kD,含有预测的跨膜区,与虹彩病毒属(Iridovirus)其他成员编码的肉豆蔻基膜蛋白有较高的同源性.将该片段克隆到原核表达载体pET32a(+)中,纯化表达的重组蛋白pET90.5L免疫昆明鼠获得高效价多克隆抗体.利用抗pET90.5L抗体与纯化病毒进行免疫印迹,结果表明,抗pET90.5L的多抗可以特异性识别病毒粒子中大小约为35 kD的蛋白条带,ORF90.5L编码的蛋白应为病毒的结构蛋白.本研究旨在为ISKNV基因工程疫苗的研发和病源侵染机制研究提供基础参考.     

Detection methods of Cyprinid herpesvirus 2 infection in silver crucian carp (Carassius auratus gibelio) via a pORF72 monoclonal antibody

Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV‐2) is the main pathogen responsible for causing haematopoietic necrosis disease in Carassius auratus gibelio. Although many nucleic acid‐based diagnostic methods have been applied, no stable and sensitive immunological diagnostic approaches have been reported. In this study, to detect CyHV‐2 in clinical samples using immunological methods, recombinant ORF72 protein (pORF72), encoded by the CyHV‐2 ORF72 gene, was used as a capture antigen to identify blood and tissues infected with CyHV‐2. First, ORF72 gene was amplified from the CyHV‐2 genome and cloned into a PGEX‐4t‐3 expression vector to produce pORF72 in Escherichia coli. The purified pORF72 was used as an immunogen to prepare monoclonal antibodies. The Western blotting assays revealed that the monoclonal antibody could specifically identify the pORF72. Furthermore, an immunohistochemical protocol and a blood smear method were established to detect CyHV‐2 in carps. The results indicate that the monoclonal antibody against pORF72 could be utilized as an effective detection tool for haematopoietic necrosis disease in Carassius auratus gibelio.     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66基因DNA疫苗载体的构建及其免疫效果

鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)能够引起鲫大量死亡,严重威胁我国水产养殖业的健康发展,目前,针对CyHV-2尚无有效的商业化疫苗或治疗措施。为构建CyHV-2DNA疫苗,本研究将其衣壳蛋白ORF66编码基因克隆至pVAX1真核表达载体上,构建重组质粒pVAX-ORF66。此外,在BL21(DE3)pLysS中对ORF66蛋白进行了原核表达,表达蛋白经纯化后免疫新西兰白兔制备了ORF66特异性抗体。酶联免疫吸附(ELISA)检测显示,制备抗体效价达1∶20000以上。将pVAX-ORF66质粒转染金鱼脑细胞系(GFB),利用制备的ORF66抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测,结果显示,ORF66蛋白可以在细胞中大量表达,且主要定位于细胞质中。将pVAX-ORF66质粒肌肉注射鲫后进行CyHV-2免疫保护实验,结果表明,其相对免疫保护率达55.6%。本研究针对CyHV-2构建了一种制备简单、成本低廉的DNA疫苗,为鲫造血器官坏死病的免疫预防及感染分子机制研究奠定了前期实验基础。     

鲤疱疹病毒3型T分离株主要免疫原性蛋白的鉴定

为了鉴定鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3,CyHV-3)主要免疫原性蛋白,研究采用CyHV-3-T分离株感染CCB细胞系,运用蔗糖密度梯度超速离心方法对CyHV-3进行纯化,纯化的病毒颗粒经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色后,用锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)抗CyHV-3阳性血清进行Western blotting分析和液相色谱串联质谱鉴定。结果表明,透射电镜下可观察到大量完整囊膜包裹或只有裸露核衣壳的CyHV-3颗粒,Western blotting结果显示抗CyHV-3阳性血清与多种病毒蛋白具有明显特异性免疫反应,质谱鉴定表明其中4种免疫原性蛋白分别为ORF92、ORF66、ORF72和ORF81,其中ORF66和ORF72为首次鉴定的具有免疫原性衣壳蛋白。本研究将为CyHV-3血清学诊断方法的建立、亚单位疫苗或DNA疫苗的研制提供更多候选抗原。     

鲤疱疹病毒3型ORF148 DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护

鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV),是一种高传染性、致死性病毒。为开发新型CyHV-3 DNA疫苗,前期研究中将CyHV-3 ORF148基因插入pEGFP-N1构建重组质粒,在此基础上,本研究通过转染试验、间接免疫荧光试验证实pORF148-EGFP融合蛋白可以在CCB-J细胞系和建鲤体内表达;将重组质粒作为DNA疫苗,肌肉注射免疫建鲤鱼苗,ELISA检测表明免疫pEGFP-ORF148重组质粒可以显著提高建鲤血清特异性抗体水平; RT-qPCR检测显示,免疫pEGFP-ORF148重组质粒后,建鲤脾脏和头肾中的免疫相关基因如IFN-a1、Mx-1、CXCa、CXCR1、TNF-α、IL-1β及IgM基因表达量均显著提高。攻毒实验显示, CyHV-3攻毒21 d后, PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF148组的建鲤存活率分别为30%、35%和85%,免疫pEGFP-ORF148可以显著提高建鲤的存活率(P0.01)。本研究旨在为CyHV-3 DNA疫苗的应用提供理论依据。     

罗非鱼罗湖病毒ORF10蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

为了研究罗非鱼罗湖病毒(tilapia lake virus, TiLV) ORF10 蛋白的功能, 从染病莫桑比克罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏和肝脏组织中克隆获得 TiLV ORF10 基因编码序列, 并成功构建了荧光定位载体 pEGFP-ORF10 和重组表达载体 pET32a-ORF10。将荧光定位载体 pEGFP-ORF10 转染鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC), 经荧光显微镜观察, 在 EPC 的细胞核中观察到绿色荧光信号, 表明该蛋白定位于细胞核中。将重组载体 pET32a-ORF10 转化大肠杆菌 BL21(DE3)进行目的融合蛋白表达, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明, His-TiLV ORF10 融合蛋白成功表达并主要存在于上清液中。随后, 采用 Ni-NTA 亲和层析的方法纯化融合蛋白 His-TiLV ORF10, 以其为抗原多次免疫 Balb/C 小鼠, 制备多克隆抗体。蛋白印迹法(WB)分析显示, 制备的抗体可以特异性识别 His-TiLV ORF10。利用蛋白印迹法进一步对感染 TiLV 莫桑比克罗非鱼的不同来源组织进行检测, 结果显示, TiLV ORF10 蛋白在染病莫桑比克罗非鱼肌肉、脾脏、肝脏和肾脏中的表达存在较大差异, 其中以肝脏和肾脏组织表达量为最高, 脾脏次之, 肌肉中表达量最低。本研究为深入了解 TiLV ORF10 蛋白的功能和病毒侵染与致病等机理提供了重要基础。