膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达。对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高。HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控。对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显。原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达。本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据。     

mPRα在性成熟雌性牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同组织中的定性定量表达特征

通过荧光实时定量PCR方法(qRT-PCR)检测雌性性成熟牙鲆(Paralichthys olivaceus)第Ⅴ时期不同时相的卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,同时采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究性成熟雌性牙鲆mPRα mRNA和蛋白在各组织中的分布和表达.qRT-PCR结果显示,在牙鲆卵巢成熟时期的第Ⅴ时相卵母细胞,mPRα mRNA的表达量最高,表明mPRα介导孕激素参与了牙鲆卵母细胞成熟的调控.组织定量定位结果显示,在牙鲆的卵巢、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα mRNA和蛋白表达存在,且在脑、卵巢中表达量较高,表明mPRα在牙鲆不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑和卵巢中的作用更明显.原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在牙鲆卵母细胞膜上,且分布在其他组织的管腔结构.本研究为进一步探究牙鲆mPRα信号转导机制提供了理论基础和形态学依据.     

mPRα在性成熟雌性牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同组织中的定性定量表达特征

通过荧光实时定量PCR方法(qRT-PCR)检测雌性性成熟牙鲆(Paralichthys olivaceus)第Ⅴ时期不同时相的卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,同时采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究性成熟雌性牙鲆mPRα mRNA和蛋白在各组织中的分布和表达。qRT-PCR结果显示,在牙鲆卵巢成熟时期的第Ⅴ时相卵母细胞,mPRα mRNA的表达量最高,表明mPRα介导孕激素参与了牙鲆卵母细胞成熟的调控。组织定量定位结果显示,在牙鲆的卵巢、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα mRNA和蛋白表达存在,且在脑、卵巢中表达量较高,表明mPRα在牙鲆不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑和卵巢中的作用更明显。原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在牙鲆卵母细胞膜上,且分布在其他组织的管腔结构。本研究为进一步探究牙鲆mPRα信号转导机制提供了理论基础和形态学依据。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)新型膜孕激素受体基因(mPRL)在卵母细胞成熟过程中的表达特征

为进一步提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)人工育苗技术的水平,对半滑舌鳎新型膜孕激素受体(mPR-like,mPRL)基因的表达特征和作用机制进行了研究。应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现半滑舌鳎mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞。原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织的细胞学定位,发现mPRL mRNA分布在半滑舌鳎性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑的神经元和垂体内分散的细胞中,mPRL mRNA阳性信号较强。制备半滑舌鳎mPRL的多克隆抗体,采用Western blotting方法检测半滑舌鳎mPRL蛋白在不同组织的表达特征,发现mPRL蛋白的表达量在卵巢、脑、垂体中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少。免疫组化结果显示,半滑舌鳎mPRL蛋白在卵巢、脑和垂体的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致。应用实时定量PCR和Western blotting方法检测促性腺激素调控下半滑舌鳎不同时相卵母细胞mPRL基因mRNA和蛋白的表达变化,结果显示,促性腺激素对半滑舌鳎卵母细胞中mPRL基因mRNA和蛋白表达都有一定的上调作用,特别是对Ⅴ时相卵母细胞中mPRL mRNA和蛋白的表达量提升明显;发现表达量与促性腺激素调控作用具有剂量依存关系。半滑舌鳎mPRL在繁殖相关组织的表达特征表明其通过脑–垂体–卵巢轴参与繁殖调控,同时也揭示了mPRL介导卵母细胞成熟机制。     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1 (PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P＜0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1mRNA表达量最高(P＜0.05).采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过qRT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测.结果显示,20IU/mlHCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系.HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P＜0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用.PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)新型膜孕激素受体基因(mPRL)在卵母细胞成熟过程中的表达特征

为进一步提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)人工育苗技术的水平,对半滑舌鳎新型膜孕激素受体(mPR-like,mPRL)基因的表达特征和作用机制进行了研究.应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现半滑舌鳎mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞.原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织的细胞学定位,发现mPRL mRNA分布在半滑舌鳎性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑的神经元和垂体内分散的细胞中,mPRL mRNA阳性信号较强.制备半滑舌鳎mPRL的多克隆抗体,采用Westem blotting方法检测半滑舌鳎mPRL蛋白在不同组织的表达特征,发现mPRL蛋白的表达量在卵巢、脑、垂体中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少.免疫组化结果显示,半滑舌鳎mPRL蛋白在卵巢、脑和垂体的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致.应用实时定量PCR和Westem blotting方法检测促性腺激素调控下半滑舌鳎不同时相卵母细胞mPRL基因mRNA和蛋白的表达变化,结果显示,促性腺激素对半滑舌鳎卵母细胞中mPRL基因mRNA和蛋白表达都有一定的上调作用,特别是对Ⅴ时相卵母细胞中mPRL mRNA和蛋白的表达量提升明显;发现表达量与促性腺激素调控作用具有剂量依存关系.半滑舌鳎mPRL在繁殖相关组织的表达特征表明其通过脑-垂体-卵巢轴参与繁殖调控,同时也揭示了mPRL介导卵母细胞成熟机制.     

促性腺激素调控半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞孕酮受体膜组分1的表达特征

采用qRT-PCR方法分析性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)不同发育时期卵巢卵母细胞的孕酮受体膜组分1(PGRMC1)mRNA的表达,研究发现,在发育Ⅳ期的卵巢,处于第Ⅳ时相的卵母细胞PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05);在发育Ⅴ期的卵巢,成熟期卵母细胞的PGRMC1 mRNA表达量最高(P0.05)。采用不同浓度促性腺激素(HCG)处理卵巢发育Ⅴ期半滑舌鳎不同时相的卵母细胞,并通过q RT-PCR和Western blotting技术对其表达量变化进行检测。结果显示,20 IU/ml HCG对PGRMC1 mRNA和蛋白表达的调控作用比10 IU/ml HCG作用更明显,表明PGRMC1 mRNA和蛋白表达对HCG调控作用存在剂量依存关系。HCG对半滑舌鳎不同时相的卵母细胞的调控作用效果不同,对第Ⅴ时相卵母细胞作用最明显(P0.05),表明PGRMC1主要在卵母细胞成熟阶段发挥作用。PGRMC1对HCG调控作用的正向应答效应预示其参与了卵母细胞成熟调控,为进一步探讨PGRMC1在半滑舌鳎繁殖过程的功能提供重要基础资料。     

孕酮受体膜组分1基因在性成熟雌性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的组织学定位定量分析

运用Western blotting、免疫组化和原位杂交方法检测性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(Progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)蛋白和mRNA在不同组织的分布和表达特征.原位杂交结果发现,PGRMC1 mRNA主要分布在成熟的卵母细胞膜上,在脑组织神经元和分散的垂体细胞中也有表达.利用制备的半滑舌鳎PGRMC1多克隆抗体,对不同组织中的PGRMC1蛋白表达量进行Western blotting检测,发现在半滑舌鳎卵巢、脑、肝脏中PGRMC1蛋白表达量相对较高,在垂体、头肾、肾也有表达,但表达量相对较少.免疫组化结果表明,半滑舌鳎PGRMC1蛋白在成熟的卵母细胞膜上显著表达,进一步证明PGRMC1为卵膜上的受体基因,推测其主要在卵膜上行使相关的生理功能.研究结果为探究PGRMC1在半滑舌鳎卵母细胞成熟过程中的生理功能提供了重要参考.     

孕酮受体膜组分1基因在性成熟雌性半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的组织学定位定量分析

运用Western blotting、免疫组化和原位杂交方法检测性成熟半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(Progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)蛋白和mRNA在不同组织的分布和表达特征。原位杂交结果发现,PGRMC1 mRNA主要分布在成熟的卵母细胞膜上,在脑组织神经元和分散的垂体细胞中也有表达。利用制备的半滑舌鳎PGRMC1多克隆抗体,对不同组织中的PGRMC1蛋白表达量进行Western blotting检测,发现在半滑舌鳎卵巢、脑、肝脏中PGRMC1蛋白表达量相对较高,在垂体、头肾、肾也有表达,但表达量相对较少。免疫组化结果表明,半滑舌鳎PGRMC1蛋白在成熟的卵母细胞膜上显著表达,进一步证明PGRMC1为卵膜上的受体基因,推测其主要在卵膜上行使相关的生理功能。研究结果为探究PGRMC1在半滑舌鳎卵母细胞成熟过程中的生理功能提供了重要参考。     

半滑舌鳎膜孕激素受体基因克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，首次获得全长为1 319bp的半滑舌鳎膜孕激素受体（mPRα）的cDNA序列；将推断的氨基酸序列与其他物种mPRα氨基酸序列进行多重比较分析，发现存在7个跨膜区域。使用MEGA 4.0临位相联法和ClustalX方法对mPRα的氨基酸序列进行聚类分析和序列相似度分析。结果表明，半滑舌鳎mPRα与漠斑牙鲆、大西洋绒须石首鱼以及青鳉等鱼类的mPRα聚为一支，亲缘关系较近，相似度较高，分别为94%、93% 和90%；而与高等哺乳动物人和牛相似性均为53%，亲缘关系较远。应用半定量RT-PCR技术分析了mPRα mRNA在性成熟雌性半滑舌鳎不同组织的表达，结果表明,mPR α mRNA组织表达具有广泛性，但表达量存在差异，在脑、肾、脾和卵巢等组织表达丰富，在肝、胃和肌肉组织表达较弱。     

性成熟雌性牙鲆(Paralichthys olivaceus)新型膜孕激素受体(mPRL)的定性定量表达分析

在牙鲆(Paralichthys olivaceus)繁殖周期,新型膜孕激素受体基因(mPR-Like,mPRL)在脑-垂体-性腺轴的表达变化规律与性腺发育成熟密切相关.为进一步研究牙鲆mPRL作用机制,本研究对其mRNA和蛋白的表达特征进行了分析.应用实时定量PCR方法分析mPRL mRNA在卵子形成过程中的时序表达,发现牙鲆mPRL mRNA相对表达量的最高值出现在性成熟阶段卵巢的Ⅴ时相卵母细胞.原位杂交分析mPRL mRNA在繁殖相关组织中的细胞学定位,发现mPRL mRNA主要分布在牙鲆性成熟阶段卵巢的卵母细胞膜上;在脑组织的神经元附近区域mPRL mRNA阳性信号也较强.制备牙鲆mPRL的多克隆抗体,采用Western blotting方法检测牙鲆mPRL蛋白在不同组织的表达特性,发现mPRL蛋白表达量在卵巢和脑组织中相对较高,在肝脏、头肾、肾脏中表达量相对较少.免疫组化结果显示,牙鲆mPRL蛋白在卵巢和脑组织的细胞学定位与mPRL mRNA定位一致.牙鲆mPRL在繁殖相关组织的表达特征说明其参与卵母细胞成熟的过程,并通过内分泌方式参与牙鲆的繁殖调控.     

半滑舌鳎促性腺激素α亚基cDNA的克隆及组织表达特征

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,从半滑舌鳎脑垂体中克隆了促性腺激素α亚基（CGα）全长cDNA（GenBank序列登录号：JQ364953）.半滑舌鳎CGα基因全长685bp,其开放阅读框384bp,编码含127个氨基酸的蛋白,N端33个氨基酸为信号肽.半滑舌鳎CGα成熟肽与其他脊椎动物CGα成熟肽结构特征相似,具有10个半胱氨酸残基和两个N-糖基化位点.CGα成熟肽序列分析表明,半滑舌鳎CGα与鲽形目和鲈形目鱼类CGα同源性为60％～70％,与鲤形目鱼类CGα同源性为55％～60％.实时荧光定量RT-PCR结果表明,半滑舌鳎CGα mRNA在被检测的12个组织中均有表达,除头肾和脾脏、脾脏和肝脏间表达量差异不显著外,其他组织间表达量差异显著（P＜0.05）;CGα mRNA在垂体组织中大量表达,其次是鳃、肾脏、肌肉、卵巢和脑组织,而在心脏、头肾、肝和脾等组织中表达量很低.本研究为进一步探讨促性腺激素在半滑舌鳎繁殖生理中的作用机制奠定基础.     

半滑舌鳎骨形态发生蛋白4基因的克隆和表达分析

本研究克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)骨形态发生蛋白4(BMP4)基因的c DNA序列,并分析其在半滑舌鳎成鱼的组织表达分布及其在早期发育阶段的定位和表达变化趋势。结果表明,半滑舌鳎BMP4基因c DNA全长为1680 bp,包括了419 bp的5′非翻译区(5′UTR)、编码403个氨基酸的1212 bp的开放阅读框(ORF)以及49 bp的3′非翻译区(3′UTR)。同源性分析和分子进化聚类分析结果显示,半滑舌鳎与已报道慈鲷科(Cichlidae)各鱼种的同源性最高,并与之共同聚为鱼类BMP4分支。BMP4 m RNA在半滑舌鳎成鱼的13个组织中具有广泛的分布,并在鳃组织中表达量最高,其次在背鳍、软骨等组织具有中等水平的表达。此外,BMP4基因在早期胚胎发育阶段(卵裂期和原肠期)具有极高水平的表达,此后其表达水平逐渐降低;但在后期仔鱼期(孵化后3日龄和4日龄),其表达水平再次升高。整体原位杂交检测结果表明,BMP4 m RNA在早期仔鱼期主要在头部及躯干前部表达;后期仔鱼BMP4基因主要在冠状幼鳍、上下颌及胸鳍处表达;进入稚鱼期后在鳃盖骨及各鳍均有表达。上述研究结果揭示了BMP4在半滑舌鳎早期骨骼发育中的重要作用,为揭示海水硬骨鱼类骨骼发生、发育的调控机制奠定了理论基础。     

介导鱼类孕激素快速、非基因作用的受体研究进展

许多研究发现某些孕激素受体介导的生物学反应较迅速,而经典的通过基因起作用的孕激素核受体介导的生物学反应都较慢,因此有学者提出生物体可能存在不通过基因起作用的孕激素受体,并研究了其结构和功能,探讨了其快速反应的机制。迄今为止,在鱼类已发现了3类可能的非基因作用的膜受体。第1类为孕激素脂联素受体家族(PAQR)的3个成员,即PAQR7(mPRα),PAQR8(mPRβ)和PAQR5(mPRγ),这些成员存在于多种硬骨鱼类中,具有和G蛋白偶联受体(GPCRs)相似的7次跨膜结构域。其中对mPRα和mPRβ的研究较多,它们可以诱导鱼类卵母细胞成熟和增强鱼类精子的活动性。第2类为孕酮受体膜组成部分(PGRMCs),是一类小分子蛋白。目前发现有PGMRC1和PGMRC2两种,对PGMRC1的研究较多,它的作用与mPRβ的作用相似,都参与孕酮的调节作用。第3类是孕激素核受体(nPRs),研究发现一些细胞中的孕激素核受体也能够参与介导孕激素的快速生物学反应。本文对介导鱼类非基因作用的孕激素受体在结构、功能和作用机制等方面的研究进展进行了介绍。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70?90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式。结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低。鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达。鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达。其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调。用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达。研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程。本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制。     

半滑舌鳎RasGRP3基因的克隆和免疫应答分析

RasGRP3(Ras Guanyl nucleotide Releasing Protein 3)是一种鸟苷酸交换蛋白,差异表达的Ras GRP3蛋白在疾病发生和固有免疫中发挥着重要作用。为了探究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Ras GRP3基因组成、组织表达及免疫应答特征,根据本实验室半滑舌鳎转录组数据获得的部分Ras GRP3序列,采用RACE(Rapid-Amplification of c DNA Ends)技术,克隆了Ras GRP3基因的全长,将测序结果进行氨基酸序列比对和同源性分析:半滑舌鳎Ras GRP3基因全长2756 bp,ORF(Open Reading Frame)长度为2244 bp,编码747个氨基酸;推导的半滑舌鳎Ras GRP3氨基酸序列与其他鱼类的Ras GRP3氨基酸序列相似性较高,是同源基因。采用q RT-PCR(Quantitative Real-Time PCR)方法对Ras GRP3基因在健康半滑舌鳎13种组织、鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染后不同时间点的6种免疫组织及LPS、PGN、WGP和poly I:C 4种病原模拟物处理的半滑舌鳎外周血淋巴细胞不同时间点中的表达特征进行分析:Ras GRP3基因在健康半滑舌鳎13种组织中均有表达,其中在性腺中表达量最高,其次是肝、脑和脾,在血液中表达量最低;Ras GRP3基因在鳗弧菌感染后半滑舌鳎6种免疫组织中都表现出不同的表达趋势,其中肝和鳃中上调趋势明显,6 h比0 h上调表达倍数分别为3倍和30倍,在肠、脾、头肾和血液中6 h都出现了下调表达;Ras GRP3在4种病原模拟物处理的半滑舌鳎外周血淋巴细胞中整体上调表达,在PGN和poly I:C这2种病原模拟物刺激后表达趋势出现明显上调,在PGN刺激后24 h比0 h上调表达倍数为13倍,在poly I:C刺激后6 h比0 h上调表达8倍。结果表明,Ras GRP3基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程,可能在免疫调控中发挥着重要的作用。