急性病毒性坏死病毒引物酶表达及酶学活性分析

根据急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)ORF 024序列设计引物,以AVNV的DNA为模板进行扩增AVNV引物酶(primase)基因,同时构建表达质粒pET32a-prim,并转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达两条蛋白条带,其中分子量为60 ku的蛋白条带与预期表达蛋白条带大小一致,另一蛋白条带分子量约为55 ku,经Western-blotting及质谱分析鉴定分子量60 ku的蛋白条带为AVNV-引物酶,而表达出的55 ku蛋白条带存在部分引物酶多肽片段。RNA结合荧光染料Pico-Green在30 min内荧光强度比较稳定,从而确定30 min为进行AVNV引物酶活性分析的最佳终止反应时间,并在引物合成实验中观察到30 min内引物酶活性较高。当使用多聚胞嘧啶寡核苷酸poly(d C)为模板时,重组引物酶能特异性催化底物GTP。0.1 mmol/L Zn2+可显著增强引物酶活性,而1mmol/L Mn2+和EDTA能抑制引物酶活性。     

斑点叉尾鮰源嗜麦芽寡养单胞菌胞外蛋白酶的纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析，DEAE Sephadex A－50凝胶层析等方法从嗜麦芽寡养单胞菌胞外产物中提纯了一种分子量为45.7 ku的单一多肽蛋白酶。该酶对小鼠和斑点叉尾鮰具有明显的致死作用，其LD50分别为4.33 μg•g-1体重和3.49 μg•g-1体重。酶的最适温度为20 ℃，热稳定性差，100 ℃作用15 min酶活完全丧失，最适pH为9.0，PMSF对酶活无影响，部分金属离子如Ca2+、Hg2+、Cu2+能使酶活性明显下降，而Co2+对酶有一定程度的激活作用，EDTA能完全抑制酶活性，表明该酶为一种金属蛋白酶。图1表4参29     

罗非鱼肠蛋白酶的分离纯化及其性质

以罗非鱼肠为原料,采用超声波辅助提取技术、电泳技术和层析技术等对罗非鱼肠道蛋白酶进行研究,结果表明:将鱼肠匀浆经超声波提取的粗酶液,用30%～70%的硫酸铵盐进行盐析、HitrapTM Q FF阴离子交换柱纯化及Sephadex G-100凝胶柱分离纯化,得到罗非鱼肠蛋白酶纯品,其比活为335U/mg,得率为32.8%;SDS-PAGE电泳为单一蛋白酶带,分子量为28ku。该酶最适pH为8.0～8.5,在pH7.0～9.0的条件下稳定;最适温度为37～42℃,热稳定性好;该酶的Km值和Vmax值分别为0.605g/L和9.407μg/min。金属离子Ag+、Pb2+对蛋白酶有完全抑制作用,Na+、K+对该酶无抑制作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂能完全抑制该酶活性,胃蛋白酶抑制剂和脲素对该酶有一定抑制作用,EDTA没有明显抑制作用,DTT能激活该酶活性,该酶为丝氨酸蛋白酶。     

三疣梭子蟹卵黄蛋白的纯化和部分生化性质

通过电泳法检测到了三疣梭子蟹卵巢中的卵黄蛋白,采用EDTA-Mg2+沉淀法以及凝胶过滤(Sephadex-100)对该蛋白进行了纯化,并通过相关染色和光吸收法确定该蛋白为糖脂磷类胡萝卜素蛋白;梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示该蛋白的总分子量为362.5 ku,由分子量为102.3 ku、66.1 ku、38.9 ku三个亚基组成。     

血管紧张素转换酶抑制肽的分离

采用截留分子量分别为30 ku、10 ku、6 ku、3 ku的中空纤维超滤膜对扇贝酶解产物进行分级分离,并结合凝胶柱层析分离技术测定了各分离组分的分子量分布,同时还测定了各分离组分对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制活性。实验结果表明,不同截留分子量超滤膜可以实现酶解产物按其分子量大小的分级分离,不同分离组分的ACE抑制力活性差异较大,总趋势是截留分子量相对较小的超滤膜透过液的ACE抑制活性较强。其中,截留分子量为3 ku超滤膜的透过液具有最强的ACE抑制活性,其ACE抑制率I(%)=96.17%,半抑制浓度IC_(50)= 0.078 mg·mL~(-1)。通过对截留分子量为3 ku超滤膜的透过液依次经过Sephadex G-25及Sephadex G-15凝胶柱层析分离纯化后,分离出了ACE抑制活性最强的2个组分活性肽,其平均分子量分别为1 300 u和900 u左右,其IC_(50)分别为0.026 mg·mL~(-1)和0.012 mg·mL~(-1)。     

几种海藻中溴过氧化物酶的筛选及酶学性质

溴过氧化物酶(BrPOD)是具有特殊功能的过氧化物酶,海藻是其主要来源。对几种中国海域的红藻如角叉菜(Chondrus ocellatus)、龙须菜(Gracilaria sjoestedtii)、珊瑚藻(Corallina officinalis)进行了溴过氧化物酶的藻种筛选,并对酶活较高的珊瑚藻进行溴过氧化物酶分离纯化及性质的研究。通过硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose 52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析等方法,从珊瑚藻中分离得到溴过氧化物酶。对该酶性质研究表明,该酶分子量较大,表观分子量为64 kD;溴化单氯甲酮的最适pH值为6.0;pH在5.0-9.0时酶活性稳定;在30-70℃温度范围内酶活性稳定;Ca2 、Co2 、Cu2 、Mn2 、NaF和EDTA等化合物使溴过氧化物酶活性下降,钒酸盐能提高酶活性。反应动力学实验表明,该酶对Br-、H2O2的Km分别为7.40 mmol/L和96.09μmol/L。     

黄鳝肠道蛋白酶的分离纯化及其性质

黄鳝(MonopterusalbusZuiew)肠道经组织捣碎,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose离子交换层析和SephacrylS 200凝胶过滤,得到蛋白酶纯品。经等电聚焦电泳和SDS PAGE均显示为单一条带。酶的等电点为6 2,最适温度为55℃,最适pH值为10 5,Km(酪蛋白)值为5 5×103mg/L。用SDS PAGE和SephacrylS 200测得其分子量分别为26kD和25 5kD。酶的pH稳定性较好,在pH12时室温保持5h,活力还剩55%。NBS、BrAc、TNBS、PMSF对酶有很强的抑制作用,而PCMB、ME对酶活性影响不大。Ca2+对酶活性无激活作用,Mg2+和K+对酶活性有轻微抑制作用,EDTA对酶活性有很强的抑制作用,Na+对酶活性无影响。     

草鱼酸性磷酸酯酶的性质及金属离子对其活性的影响

以草鱼肝脏为材料提取一种酸性磷酸酯酶(ACPase,EC.3.1.3.2),进一步用(NH4)2SO4沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度鉴定呈现单一酶蛋白带,该酶紫外吸收峰为240nm和280nm,等电点为4.8,相对分子质量为100046.1。该酶水解对硝基苯磷酸二钠(pNPP)的最适pH值为4.4,最适温度为45℃,并有热激活现象,热激活温度为60℃。耐热实验表明,该酶在最适温度下耐热时间为33min,最适温度下20min时表现出最大活性。在60℃下耐热时间为25min,15min时表现最大活性。酶促反应初速度为0.0475μmol/min,最大反应速度为0.153μmol/min。米氏常数Km值为3.56×10-3mol/L。金属离子对酶活性影响的研究结果表明,K+对酶有激活作用,Li+、Na+对酶的活性没有明显影响;碱土金属离子Mg2+、Ca2+和Ba2+对酶有激活作用,其激活程度由大到小依次为:Ba2+、Mg2+、Ca2+;Mn2+对酶有激活作用,Zn2+、Cu2+、Co2+则有抑制作用;重金属离子Hg2+、Pb2+、Ag+和Cd2+对酶有抑制作用,其中Hg2+的抑制效应最强。Mg2+和Cu2+的作用机制研究结果表明,Mg2+对酶具有混合型激活作用,Cu2+对酶具有竞争性抑制作用。     

尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白中游离基清除肽的制备及其抗氧化活性

采用菠萝蛋白酶和Alcalase酶依次对尼罗罗非鱼皮胶原进行复合酶解.研究了该酶解产物的体外抗氧化活性.实验表明,该酶解产物具有较强的超氧阴离子/羟基自由基清除活性和还原能力.采用不同截留分子量的超滤膜将该酶解物分离成5个组分,即TGH-Ⅰ(＞10 ku),TGH-Ⅱ(10～5 ku),TGH-Ⅲ(5～3 ku),TGH-Ⅳ(3～1 ku)和TGH-Ⅴ(10 ku).其中TGH-Ⅴ组分显示出最强的超氧阴离子自由基清除活性,因此采用凝胶过滤、离子交换和反向高压液相色谱技术对该组分进一步分离纯化.纯化得到的肽具有很强的超氧阴离子自由基清除活性,其IC50值为4.6 μg·mL-1.通过质谱分析可知,该肽的分子量位于311.3～932.8 u之间.     

大菱鲆消化道蛋白酶的初步研究

以-龄大菱鲆为材料,研究养殖水温下不同pH条件胃、幽门盲囊、前肠、中肠、后肠中蛋白酶的活性,确定饵料中蛋白质的主要消化部位为胃和前肠,各部位主要蛋白酶的最适作用pH依次为2.0、8.0、8.0、8.5、8.0;蛋白酶单位酶活力从高到低依次为幽门盲囊＞胃＞前肠＞中肠＞后肠.以大菱鲆胃为材料,经Tris-HCl缓冲液抽提、硫酸铵分级分离,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化,获得大菱鲆胃蛋白酶的电泳纯制品,并对该酶的性质进行了研究.结果显示:纯酶的分子量为39900Dal,纯酶最适反应pH为2.0,最适反应温度40℃;pH稳定范围1.0-9.0,40℃以下酶活性稳定;Mn2+和Cu2+可激活大菱鲆胃蛋白酶,Fe3+对酶活性有抑制作用.     

盐藻超氧化物歧化酶分子类型鉴定

对盐藻细胞反复冻融和超声波破碎获得超氧化物歧化酶粗酶液,再经丙酮沉淀、70℃热处理、DEAE-52柱层析获得纯化超氧化物歧化酶,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测出1条超氧化物歧化酶谱带。该纯化超氧化物歧化酶在紫外光区的吸收峰波长259 nm和可见光区的吸收峰波长671 nm与报道的Cu/Zn-SOD基本一致,并且它对H2O2和KCN均敏感,说明盐藻中的超氧化物歧化酶为Cu/Zn-SOD类型。     

上覆水类型及流速对养殖池塘底泥耗氧速率的影响

为了探究上覆水类型及流速对养殖池塘底泥耗氧速率(SOD)的影响,在实验室进行6组水池平行实验,实验期为2 d,采用6个装置相同的玻璃缸进行对照实验,分别选取自来水和池塘原水作为上覆水体,在实验过程中利用水泵对上覆水进行循环流动,调节水泵循环流量以得到不同的上覆水流速,并采用2台溶氧仪测定不同实验条件下的上覆水水温和DO浓度,记录每次测量的对应时间点,测量间隔约为30 min。结果表明,当上覆水体为自来水和池塘原水时,在不同的循环流速下,SOD的范围为0.042~0.426 g/(m~2·d)。实验第2天各水池的SOD值较第1天均有一定下降,说明SOD随着水体中DO降低也相应减小,表明SOD与DO浓度有显著相关性。当上覆水处于静止状态时,其类型对SOD值有较大的影响,池塘原水在第1天和第2天的SOD值分别为0.426 g/(m~2·d)和0.297 g/(m~2·d),而自来水在第1天和第2天的SOD值均为0.258 g/(m~2·d),与上覆水体为自来水相比,有机物质含量高的池塘原水在第1天和第2天的SOD值分别高出65.12%和15.12%;当上覆水处于流动状态时,池塘原水的SOD为0.042~0.237 g/(m~2·d),自来水的SOD为0.045~0.252 g/(m~2·d),增幅仅为5.9%~15.0%,表明在此条件下上覆水体类型对实验水池的SOD值影响不显著。SOD与上覆水流速存在一定的相关性,对应最小的SOD值有一个流速较低值。     

蒽对黑鱼君超氧化物歧化酶活性的影响

采用毒性实验的方法 ,研究了蒽对黑鱼君几种组织的超氧化物歧化酶活性的影响。结果表明 :1 .不同的组织其SOD活性高低不同 ,按SOD活性由高到低的顺序依次排列为 :肝 >血清 >肾 >鳃 >肌肉 ;2 .不同的组织 ,其SOD活性对蒽的敏感性有所差异 ,按敏感性由大到小的顺序依次排列为 :血清 >肝 >鳃 >肌肉 >肾。3.不同组织的SOD活性在蒽胁迫下的变化规律不同。低浓度的蒽引起鳃、肾、肌肉组织的SOD活性升高 ,随着蒽浓度的提高 ,SOD活性又表现出抑制效应 ;而蒽对血清及肝组织的SOD活性从低到高浓度下始终呈现出抑制作用     

蒽对黑鲪超氧化物歧化酶活性的影响

采用毒性实验的方法，研究了蒽对黑Ｊｕｎ几种组织的超氧化物歧化酶活性的影响。结果表明：１．不同的组织其ＳＯＤ活性高低不同，按ＳＯＤ活性由高到低的顺序依次排列为：肝＞血清＞肾＞鳃＞肌肉；２．不同的组织，其ＳＯＤ活性对蒽的敏感性有所差异，按敏感性由大到小的顺序依次排列为：血清＞肝＞鳃＞肌肉＞肾。３．不同组织的ＳＯＤ活性在蒽胁迫下的变化规律不同。低浓度的蒽引起鳃、肾、肌肉组织的ＳＯＤ活性升高，随着蒽浓度的提高，ＳＯＤ活性又表现出抑制效应；而蒽对血清及肝组织的ＳＯＤ活性从低到高浓度下始终呈现出抑制作用。     

柴油对斑马鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的影响

研究了不同浓度的柴油处理液对斑马鱼死亡率、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的影响。结果表明:380号柴油处理对斑马鱼的96h半致死浓度为450mg/L;低浓度的柴油处理对斑马鱼肌肉中SOD和CAT活性起诱导作用,而高浓度则起抑制作用,在处理浓度为300mg/L时SOD和CAT活性达到最高值,在试验过程中存在明显的"毒理兴奋"作用。建议以斑马鱼肌肉中SOD和CAT活性变化作为水环境监测的生物指标,从而达到评价水生生态环境的目的。     

低pH对草鱼鳃和肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

在实验室条件下，把草鱼置于低pH（6．0，5．5，4．5）水中4d和7d，测试鳃和肝组织SOD活性的变化。结果表明，在实验的第4天，低pH引起肝组织SOD活性升高,而对鳃组织SOD活性无显著影响；在第7天，低pH引 起肝组织SOD活性显著降低，而鳃组织在pH6．0和pH5．5时SOD活性升高，在pH4．5时SOD活性下降。提高水中钙浓度，可减缓pH4．5实验组（第7天）鳃和肝组织SOD活性的降低。     

Modeling industry-wide sediment oxygen demand and estimation of the contribution of sediment to total respiration in commercial channel catfish ponds

Data collected from 45 commercial channel catfish, Ictalurus punctatus, ponds were used to develop empirical models predicting sediment oxygen demand (SOD). Seven acceptable models were combined with a Monte-Carlo sampling distribution to predict industry-wide sediment oxygen demand (SOD_i). The SOD_i values obtained from the best equation were used in simulations to assess the effect of diurnally varying water column dissolved oxygen (DO) concentrations on SOD and the effect of pond water depth on the contribution of SOD to overall pond respiration. Estimated SOD_i ranged from 62 to 962 mg m⁻² h⁻¹, with a mean of 478 mg m⁻² h⁻¹. There was a 95% probability of mean SOD_i being ≥700 mg m⁻² h⁻¹. The effects of diurnal variation in DO concentration in the water column on expression of SOD was modeled by combining maximum SOD_i, an empirical relationship between DO and SOD, and simulated pond DO concentrations. At DO concentrations >15 mg l⁻¹, diel SOD in catfish ponds exceeded 20 g O₂ m⁻² day⁻¹. But when average diel DO was <4 mg l⁻¹ and the range of DO concentration was 6–8 mg l⁻¹, SOD decreased to 13 g O₂ m⁻² day⁻¹ because DO availability limited the full expression of potential SOD. Respiration totals for sediment (average SOD_i), plankton, and fish respiration were calculated for pond water depths ranging from 0.25 to 4 m. Although whole-pond respiration increases as pond depth increases, the proportion of total respiration represented by sediment decreased from 48 to 10% by increasing water depth over this range. The results of these studies show that SOD is a major component of total pond respiration and that certain management practices can affect the impact of SOD on pond oxygen budgets. Mixing ponds during daylight hours, either mechanically or by orienting ponds for maximum wind fetch, will increase oxygen supply to sediments, thereby allowing maximum expression of SOD and maximum mineralization of sediment organic matter. Given a mixed condition caused by wind or other artificial means, the construction of deeper ponds increases the total mass of DO available for all respiration, causing nighttime DO concentrations to decline at a slower rate, reducing the need for supplemental aeration. Because a pond’s water volume decreases over time from sediment accumulation, annual aeration costs will increase with pond age. Constructing ponds with greater initial depth will therefore reduce long-term cost of aeration, allow more flexible management of pond water budget, and reduce the long-term expense associated with pond reconstruction.     

磺胺间甲氧嘧啶钠对厚颌鲂幼鱼SOD活性和MDA含量的影响

以(30±2.3)g/尾的厚颌鲂(Megalobrama pellegrini)幼鱼为研究对象,采用一次性胸腔注射法,通过观察磺胺间甲氧嘧啶钠对厚颌鲂幼鱼超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响,探讨磺胺间甲氧嘧啶钠对厚颌鲂幼鱼各组织酶活性的影响变化及其休药期。结果显示,在同一浓度下,随着给药时间的延长,肝脏、肌肉和鳃组织SOD活性出现先降后升再降的趋势,而随着浓度的增加,则出现先升后降的趋势;肝脏、肌肉和鳃组织MDA,随着给药时间的延长和浓度的增加,均出现先升后降的趋势;厚颌鲂各组织SOD和MDA受磺胺间甲氧嘧啶钠影响最小的是肌肉,其次是鳃、肝脏;通过SOD和MDA变化情况,确定休药期为28 d左右。     

pH与氨氮对黄颡鱼幼鱼生长与肝脏超氧化物歧化酶的影响

为了解不同水体pH和氨氮组合对瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)特定生长率(SGR),饲料效率(FE)和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响。实验采用中心复合设计与响应曲面法分析方法,利用瓦氏黄颡鱼幼鱼开展试验,养殖周期为7周。结果表明,水体氨氮对SGR,FE和肝脏SOD活力有显著影响;pH对SGR有显著影响。pH对SGR,FE和SOD活力存在显著的二次效应。氨氮浓度小于1.7 mg/L时对黄颡鱼生长无抑制作用;高氨氮与高pH环境对幼鱼的生长、饲料利用与肝脏SOD活力有明显的抑制作用。水体pH和氨氮水平分别为7.5和1 mg/L时,SGR、FE和SOD同时最优,分别为1.47%/d、1.71和97.9 U/(mg.prot),优化的可信度为0.836。建议在黄颡鱼养殖中,将pH与水体氨氮维持在7.0~8.0与0.1~1.7 mg/L内,从而保证黄颡鱼的正常生长与较强的抗氧化活性。     

黑鲷受铜、镉胁迫的生理反应

研究了不同浓度的铜、镉处理液对黑鲷体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的影响。结果表明:在48 h内对照组和铜、镉处理组(≤5 mg/L)中黑鲷均未出现死亡;48 h后对照组与铜、镉处理组中黑鲷体内SOD和CAT活性值差异极显著(P<0.01),而且变化趋势基本一致,即低浓度处理组对黑鲷体内SOD和CAT活性起诱导作用,而高浓度处理组则起抑制作用,其中在处理浓度为0.5 mg/L时SOD和CAT活性达到最高值,在试验过程中存在明显的"毒理兴奋"作用。因此,铜、镉处理对黑鲷的生理生化存在着一定的影响,建议可以以黑鲷SOD和CAT活性变化作为水环境监测的生物指标物,从而达到评价水生生态环境的目的。