中华鲟胚胎细胞的冷冻保存及其核移植

为了保存濒危鱼类中华鲟种质资源,对其囊胚细胞和原肠细胞进行了冷冻保存和核移植试验。用二甲亚砜(DMSO)、1,2-丙二醇(PG)、羟乙基淀粉(HES)3种抗冻剂,配制4种冷冻保护液:CP1(12%D)、CP2(10%P)、CP3(8%D 6%E)、CP4(7%P 6%E),冷冻细胞存活率分别为47.4%±4.7%、64.4%±3.6%、54.7%±4.7%、76.7%±5.7%,CP4保存效果最好,说明添加非渗透型抗冻剂羟乙基淀粉能提高冷冻保存细胞的存活率。比较了两种冷冻方法,发现细胞在-7℃平衡30min之后直接投入液氮的一步冷冻降温法是可行的。对不同发育时期的胚胎细胞冷冻存活率进行了比较,结果表明原肠细胞冷冻存活率(64.4%±11.8%)明显比囊胚细胞的(57.1%±11.2%)高(P<0.05)。用冷冻复苏后的囊胚细胞和原肠细胞作供体,以中华鲟未受精卵作受体进行核移植,各移植了469和392枚卵,分别获得了5尾和2尾克隆鱼,核移植成功率分别为1.1%和0.5%。表明可通过冷冻保存胚胎细胞结合核移植技术保存鱼类种质资源。     

脂质体介导的鲫CAB细胞转化及转化细胞的核移植

采用脂质体法成功地使gfp基因转入鲫囊胚细胞株CAB细胞基因组，获得了具有G418抗性的细胞。以转化细胞为供体，银鲫卵为受体，核移植得到了转基因的囊胚和原肠胚；并发现4℃处理细胞24h能显著改善核移植胚胎的发育。     

鱼类精子超低温冷冻保存技术及其应用

鱼类精子的超低温冷冻保存对鱼类种质资源保护、低温生物学、遗传育种和水产养殖业都具有重要的意义。鱼类精子超低温冷冻保存技术主要包括冷冻保存方法、抗冻保护液、降温、解冻速率、冷冻保存温度、抗冻剂去除等过程。本文就鱼类精子超低温冷冻保存技术及其应用进行了综述。     

鱼类精液超低温冷冻保存研究进展

鱼类精液超低温冷冻保存研究是从五十年代开始的,经过三十年的努力已取得很大成就。国外的工作主要是在海水鱼类和鲑科鱼类中开展的,并在某些鱼类,如鳕鱼、虹鳟、鲑鱼,大马哈鱼等的精液冷冻保存中获得成功。不少学者还对精液冷冻的原理,冷冻保存的技术环节如稀释液的配制、抗冻剂的种类及浓度、降温平衡、冷冻速度及保存方法等进行了较为详细的研究。我国在鱼类精液超低温冷冻保存方面的工作开展得比较晚。近年来,广东、广西和新疆等地对草、鲢、鳙、鲮等鱼的精液冷冻保存作了一些     

鲑鳟鱼类精子超低温保存研究进展

鱼类精子超低温冷冻保存技术发展至今已有60年的历史,取得了巨大的成就,尤其在鲑科鱼类的精液冷冻保存及应用方面。经过统计发现,国外学者在精子超低温冷冻方面取得的主要突破都集中在鲑鳟鱼类领域。本文综述了鲑鳟鱼类精子超低温保存技术的发展史、相应的关键技术和冷冻保存研究的意义、基本生物学原理以及有关精液冷冻保存的研究现状与进展。     

超低温冷冻保存卤虫胚胎的损伤机理↑（*）

通过扫描电镜观察超低温冷冻保存的卤虫胚胎膜结构，查明造成卤虫胚胎损伤的主要机理是：（１）玻璃化液使胚胎膜受到损伤，改变了膜的通透性，玻璃化液进入胚胎内部造成胚胎死亡；（２）在超低温冷冻保存过程中，冷冻物理损伤造成胚胎膜的破裂，导致胚胎死亡。     

卤虫胚胎和无节幼体超低温冷冻保存的研究↑（*）

用玻璃化液作为低温保护剂，对卤虫胚胎和无节幼体进行超低温冷冻保存实验。通过实验筛选出５种适宜卤虫胚胎保存的玻璃化液，找出了影响胚胎成活的降温温层和升温温层，使胚胎经－１９６℃保存后的成活率稳定在９０％。建立了较为完善的卤虫胚胎冷冻保存的程序。卤虫无节幼体经超低温冷冻保存后，获得３－５％的成活率。     

猪细胞核移植研究进展

哺乳动物核移植研究,已取得了突破性进展,但由于猪细胞核核移植的难度较大,有关猪的报道较少。由于猪胚胎卵裂球脂滴太多,Nagashima等眼2演通过离心处理并用显微操作技术去除细胞内脂滴,再进行冷冻,解冻后将胚胎分成单个卵裂球作为核供体,重构胚的囊胚发育率高于正常胚胎细胞核移植。猪细胞核移植中的几个关键问题是:卵母细胞的体外成熟、受精和培养,移核胚重构后核、质相互作用和细胞同期同步化,受体母猪的处理。     

海带种质保存技术的研究现状和发展前景

综述了海带继代培养种质保存技术的研究现状及存在的问题,介绍了藻类超低温冷冻保存技术的研究进展及其在海带种质保存中的研究前景。     

棘皮动物精子超低温冷冻保存技术研究进展

棘皮动物(Echinodermata)是无脊椎动物中进化地位最高等的类群,其海参纲(Holothurioidea)和海胆纲(Echinoidea)的一些物种具有非常高的经济价值和营养价值。由于受到人类活动的影响,很多棘皮动物物种数量和生物多样性遭到了严重破坏,种质资源保存迫在眉睫。超低温冷冻保存是种质资源长期保存的重要方法,具有突破地理隔离、实现远缘杂交、保护种质资源、解决种质退化和保护濒危物种等作用。本文综述了海胆、海参和海星3种主要棘皮动物的精子超低温冷冻保存研究进展,并展开描述了精子收集、稀释剂和抗冻剂制备、平衡、冷却、解冻和质量评价等精子冷冻保存过程的各个步骤,以期为棘皮动物种质资源保存的进一步研究及产业化应用提供参考。     

虾夷扇贝精子形态结构和超低温冷冻损伤的电镜观察

应用透射电镜和扫描电镜技术,研究了超低温冷冻保存前后虾夷扇贝精子超微结构和形态的变化。结果显示,虾夷扇贝精子由头部、中段和尾部3部分组成,外被光滑质膜;顶体位于头部最前端,呈倒"v"形,细胞核近似圆柱状,电子密度较高;4个线粒体和两个相互垂直的中心粒构成了精子的中段;鞭毛细长,轴丝为典型的"9 2"结构。经超低温冷冻保存后,冷冻损伤的精子表现为:精子被膜肿胀、被膜与核膜分离、丢失;顶体破裂、内容物流出;线粒体解体、线粒体嵴变形;鞭毛被膜肿胀、部分精子鞭毛脱落。可以推测,超低温冷冻保存对精子膜、顶体、线粒体和鞭毛的损伤可导致冻精活力和受精能力的下降。     

长期超低温冷冻保存对鞍带石斑鱼精子超微结构及酶活性的影响

【目的】本文旨在探究长期超低温冷冻保存中鞍带石斑鱼精子质膜、活力、超微结构及酶活性的变化，为阐明影响鞍带石斑鱼精子冷冻保存质量的相关机制提供理论依据。【方法】采集2022年鞍带石斑鱼鲜精及储存时间分别为23、49、61个月冷冻保存精液，用伊红-苯胺黑染色方法检测精子质膜完整性；用计算机辅助精子分析仪（CASA）检测精子运动参数；测量精浆和精子中琥珀酸脱氢酶（SDH）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和肌酸激酶（CK）共六种酶活性的变化及三磷酸腺苷（ATP）浓度变化；用扫描电镜和透射电镜观察鲜精和冻精超微结构。【结果】伊红-苯胺黑染色检测结果发现，鲜精质膜完整性最高为83.43±2.73 %，经过超低温冷冻后，精子质膜完整性显著降低（P<0.05），且随着冷冻保存时间的延长而逐渐降低。CASA结果显示鲜精活力最高为90.47±3.34 %，经过超低温冷冻后精子活力显著降低（P<0.05），但长期保存23-61个月精子活力无显著性差异，精子活力保持在63.95±3.66 %-68.58±2.73 %，具有稳定的活力，且鲜精与冻精之间精子平均直线运动速度（VSL）、平均曲线运动速度（VCL）和平均路径速度（VAP）均没有显著差异（P>0.05）。精子超微结构显示，鲜精形态结构正常、线粒体排列结构规则、形态大小正常。经过超低温冷冻保存后，精子形态结构损伤明显，表现为精子头部质膜破损、细胞质外漏、细胞核膜破损、尾部鞭毛断裂或脱落等损伤；鞍带石斑鱼精浆和精子超低温冷冻前后六种酶活性的变化及ATP含量结果显示，经过超低温冷冻后，精子内SOD、GSH-PX和CAT三种酶及ATP含量均有显著性降低（P<0.05）。精浆中酶活力升高，除GR和CAT外，其余酶活性均差异显著（P<0.05）。【结论】长期超低温冷冻对鞍带石斑鱼精浆和精子酶活性、精子活力及精子超微结构均具有较显著影响，【意义】研究结果为鱼类精子冷冻损伤机理研究积累了丰富的数据，为鱼类精子长期冷冻保存提供了技术参考和评价指标。     

刀鲚精子超低温冷冻保存技术的研究

本文对刀鲚精子的超低温冷冻保存技术进行了研究.以解冻后精子的运动力为参数,分别探讨了不同的稀释液、不同种类不同浓度的保护剂、不同的平衡时间以及不同的稀释比例对刀鲚精子进行超低温冷冻保存的保护效果.结果显示:采用D-15稀释液,将精液和稀释液按1:2稀释,4℃平衡20 rmin,加入10％ DMSO,混匀后液氮面上方6 cm处平衡10 min,接着在液氮面上平衡5 min,最后投入液氮中保存,一周后,液氮蒸气中平衡5min,37℃水浴解冻,活力效果最佳,达70％左右.     

鱼类胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞(Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞)是从动物早期发育胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离得到的一种未分化的永久性细胞系,它一方面保留了所有的发育潜力,在适合的条件下,能够分化成多种类型的细胞、组织。将ＥＳ细胞移植到动物囊胚后,它可以参与宿主胚胎各种组织的构成,形成嵌合体,直至达到种系嵌合,遗传给后代;另一方面,人们可以对ＥＳ细胞的基因组进行各种遗传操作,包括随机引入外源基因到ＥＳ细胞基因组中,或通过同源重组,定点引入外源基因到ＥＳ细胞基因组中或破坏基因组中某一特定的靶基因;通过细胞移植或核移植技…     

白鲢冻精后代的生长观察

鱼类精液是鱼类自然繁殖及人工授精的基础，其品质的优劣直接关系到后代的性状。近年来，鱼精冷冻保存作为鱼类选种育种的一项新手段为水产科技界所重视，并取得可喜的进展。实验证明，鱼类精液经超低温(-196℃)冷冻保存之后，解冻复苏的精子具有正常的授精能力且胚胎发育正常，     

白鲢冻精后代的生长观察

鱼精冷冻保存作为鱼类选种育种的一项新手段，已为人们所重视，并取得了可喜的进展。实验证明，鱼类精液经超低温(-196℃)冷冻保存之后，解冻复苏的精子具有正常的受精能力，且胚胎发育正常，孵出正常鱼苗。但随着研究工作的深入，人们十分自然地关注到这样一个问题，     

零下196℃冷冻胚胎仍能孵化出鱼苗

正在-196℃环境中冷冻保存,仍能成活并孵化出鱼苗,生命不仅顽强,科学的力量也让人叹为观止。2017年12月30日,从黄海水产研究所获悉,由该所领衔合作完成的"石斑鱼种质库和远缘杂交育种技术的建立及应用"项目近日通过了科技成果标准化评价。该项目建立了10种石斑鱼类精子冷冻库,并在国际上首次研制了石斑鱼胚胎超低温冷冻保存技术,突破了-196℃冷冻保存成活的"瓶颈",孵化率达     

鲈鱼胚胎程序化冷冻保存的研究

对鲈鱼(Lateolabrax japonicus)胚胎的程序降温冷冻保存进行了研究。通过稀释液的筛选实验，选择了一种培养效果好的稀释液DSl液。研究了不同发育阶段胚胎对抗冻液的毒性耐受力，表明肌肉效应期胚胎的耐受力最强。测定了心跳期胚胎在抗冻液A1、A2、B1、B2中的平衡处理时间，为进行鲈鱼胚胎冻前平衡提供了参考时间。比较了植冰和不植冰对鲈鱼胚胎冷冻保存结果的影响及不同洗脱方法洗脱胚胎的效果。结果表明，在冷冻过程中诱导植冰的胚胎成活率高于未植冰组，两步法洗脱效果优于一步法和三步法。用不同降温速率进行了鲈鱼胚胎的超低温冷冻保存实验，结果表明，采用1．5℃／min的降温速率降温，在液氮中冷冻保存30min的72粒心跳期胚胎中有3粒成活，成活率为4．2％。     

家鸡囊胚细胞微量DNA提取方法的探讨

为了提取微量的家鸡囊胚细胞DNA应用于种蛋孵化前的PCR性别鉴定,本实验应用Chelex-100法、常规试剂提取法、DNA试剂盒提取法进行微量囊胚细胞的DNA提取,并应用W染色体性别鉴定引物进行PCR鉴定。结果表明,3种方法均能提取适合于PCR的模板,其中以Chelex-100法提取的效果最好,最小细胞数为10个,其次为常规试剂提取法和DNA试剂盒提取法,最小细胞数分别为50个和1200个。本研究对微量家鸡囊胚细胞DNA提取方法进行了大量的摸索和改进,为家鸡种蛋孵化前性别鉴定技术研究奠定了一定的基础。     

日本黄姑鱼精子生理特性及超低温冷冻保存研究

对日本黄姑鱼精子部分生理特性及其超低温冷冻保存技术进行了研究。结果表明,日本黄姑鱼精液pH值为7.0~7.5,精子密度为(11.23±2.78)×109/m l,精子寿命(229.33±17.16)s。在盐度为30~35,pH为7.5~8.5时,精子的活力最高,分别达到(88.33±2.89)%和(88±4.33)%。精子在室温(25℃)条件下,可存活24 h;在低温(4℃)条件下可以存活36 h。以D液作为稀释液,20%的乙二醇作为抗冻剂,利用快速降温法对精子进行超低温冷冻保存,38℃水浴快速解冻,解冻后的精子获得最高的活力为(47±5.78)%。