枯草芽孢杆菌B2的生长及其对仿刺参的益生特性

从大连湾地区健康的仿刺参养殖池塘沉积物中分离得到一株芽孢杆菌菌株B2,经16SrDNA鉴定以及形态学分析确定其为枯草芽孢杆菌。该菌株生长适宜温度为15~35℃,适宜pH为6~8,适宜盐度为30~50。电镜观察发现,枯草芽孢杆菌B2周围有明显可见的芽孢。枯草芽孢杆菌B2可产淀粉酶和蛋白酶,但不具有产脂肪酶的能力。将枯草芽孢杆菌B2按照仿刺参体质量的0.1%、0.2%和0.3%配成不同密度的菌液,添加至饲料中,投喂7d后发现,该菌株可有效提高仿刺参肠道内的消化酶以及体腔液中多种非特异性免疫酶的活性。结果表明,枯草芽孢杆菌B2可作为益生菌剂的基础菌株添加至仿刺参饲料中。     

枯草芽孢杆菌表达柱状黄杆菌lip基因口服疫苗对草鱼免疫保护效果的研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种水产益生菌,最近也被用作口服疫苗的投递载体。本研究利用前期筛选到的柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)保护性抗原基因lip,与pBE2R载体连接后,以质粒的方式转入枯草芽孢杆菌WB800中,构建了重组菌株WB800 (pBE2R-lip)。聚丙酰胺电泳和免疫印迹实验表明,枯草芽孢杆菌WB800 (pBE2R-lip)能表达lip蛋白,其分子量约为32 kDa。利用枯草芽孢杆菌WB800 (pBE2R-lip)口服免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)后,通过酶联免疫吸附实验,在受免草鱼血清中检测到特异性抗体效价的上升,在人工感染实验中,受免草鱼的免疫保护率为52.4%。本研究表明,利用枯草芽孢杆菌能有效表达柱状黄杆菌的lip基因,以其作为口服疫苗能引起草鱼的免疫应答并提供免疫保护效果。     

一株广温性大菱鲆肠道益生菌的筛选与鉴定

从健康的大菱鲆肠道内分离细菌,以大菱鲆致病菌鲨鱼弧菌Vibrio archariae和大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi为指示菌,根据拮抗作用原则,分离得到一株菌TYTG-1.根据菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析,菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.从养殖大菱鲆肠道中分离获得枯草芽孢杆茵在国内属首次报道.该株茵在4～42℃均能生长,属广温性.经过28d的投喂添加浓度为107和109CFU/g枯草芽孢杆菌的饲料,大菱鲆生长正常,未产生不良反应.该株枯草芽孢杆茵对引起大菱鲆腹水病和肠炎病的两株致病弧茵具有良好的拮抗作用,其具有较大潜力作为肠道益生菌应用于大菱鲆的养殖.     

紫外诱变选育高活性蛋白酶枯草芽孢杆菌及其降解饲料能力评价

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘底泥中分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC2为出发菌株,利用紫外诱变的方法培育蛋白酶活性高的枯草芽孢杆菌菌株,并评价其降解饲料的能力。结果表明:(1)经6次紫外诱变,突变菌株B38的透明圈直径(H)与菌落直径(C)之比(H/C值)达到6.42,提高了2.13倍;(2)福林酚法测得B38的蛋白酶活性为86.82 U/m L,是出发菌株BC2的3.14倍,但紫外诱变对B38纤维素酶活性影响不显著;(3)连续传代培养10代后发现B38产蛋白酶和纤维素酶能力保持稳定,证明诱变菌株具有较好的遗传稳定性;(4)利用凯氏定氮法评价B38降解饲料蛋白的能力,发现与BC2相比,B38降解饲料中可溶性蛋白的能力提高了2.57倍,而降解不溶性蛋白的能力变化不大。本研究诱变选育的枯草芽孢杆菌B38为开发优良的水产微生态制剂产品提供了重要的前提和基础。     

芽孢杆菌及其在水产养殖业的利用（二）

二、枯草芽孢杆菌培养基配方的优化 在水产上应用的主要是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,BS）,在水体和饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂,可起到有效抑制或杀灭水体中或养殖水生动物体内的某些有害菌或致病菌的作用,并能增强有益菌的群落,从而达到防治水产养殖动物疾病的作用。芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，可降解饲料中某些抗营养因子，提高饲料转化利用率，促进养殖水生动物的生长等。     

枯草芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌,主要以芽孢形态存在,稳定性和抗逆性强,抗菌性能好,其作为绿色免疫增强剂之一可部分替代抗生素,在水产养殖中适量使用枯草芽孢杆菌已成为一种健康养殖方式。枯草芽孢杆菌通过发挥自身营养功效、分泌抑菌物质等方式调节动物体内微生态平衡、提高免疫力和抗病力,从而促进养殖动物生长、减少病害发生以及改善养殖环境。本文综述了枯草芽孢杆菌的特性、作用机理、适宜添加量以及使用方式和现状,并进一步展望未来的研究方向,使其应用更加广泛,促进中国水产养殖的健康发展。     

解淀粉芽孢杆菌在对虾养殖中的应用

<正>解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为芽孢杆菌属,是一种与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亲缘性很高的细菌。该菌为革兰氏阳性、兼性厌氧的杆状细菌;在自然界中分布广泛,不但可在土壤、植物根际体表、深海水等外界环境中存在,同时在植物体内也很常见;其最适生长温度为28~30℃,最适宜生长的p H 6.5~7。     

草鱼肠道微生物抗生素抗性基因研究

水产养殖过程中抗生素的过度使用导致耐药菌株不断出现，细菌耐药性成了威胁公共安全的一个全球性问题。抗性基因是细菌产生耐药性的根本原因，动物肠道微生物是抗性基因的储存库，然而目前我国对水产养殖动物消化道微生物抗生素抗性基因的研究匮乏。为探究草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肠道微生物中抗性基因的类型和丰度，通过提取草鱼肠道内容物的基因组DNA，采用shotgun宏基因组技术进行测序和序列注释，分析草鱼肠道内容物微生物数据，对比抗性基因数据库ARDB筛选出微生物序列中的抗性基因。结果表明，草鱼肠道内容物共有61554个可注释微生物的基因序列，包括409个真核生物序列、88个古细菌序列和61057个真细菌序列；共得到1011个抗性基因，归为123种基因型，包括78种单抗性基因型（679个单抗性基因），45种多抗性基因型（304个多抗性基因），多抗性基因数量占抗性基因总数的30.1%，说明草鱼肠道中可能存在大量的多重耐药性微生物；检出草鱼肠道中数量最多的抗性基因是抗大环内酯类抗生素基因MacB，其在国内水环境中研究甚少，可能是因为其单独存在时无法使微生物表现出抗性。本研究统计了草鱼肠道中微生物抗生素抗性基因的种类及数量，为水产养殖中抗生素的使用监管提供基础数据，验证了宏基因组测序技术检测抗性基因的可行性。     

枯草芽孢杆菌WB600芽孢和营养体耐受凡纳滨对虾胃肠道环境及定殖存活的研究

采用体外模拟胃肠道环境与体内芽孢存活计数相结合方法,考察枯草芽孢杆菌WB600耐受凡纳滨对虾胃、肠道环境及其在凡纳滨对虾肠道内的定殖存活情况。试验结果表明,枯草芽孢杆菌WB600芽孢在不同的pH环境中均表现出很强的耐受性和良好的生长增殖趋势,而营养体的耐受性较差;在含不同浓度胰蛋白酶的模拟肠液中芽孢和营养体均能表现出良好的耐受性,其中芽孢的耐受能力更为显著;当温度高达80℃时,仍有93.9%的芽孢存活,而营养体基本失活;在虾的肠道内容物中能检测到大量的活芽孢,说明芽孢在进入虾肠道内是可以在其内存活并生长定殖的。表明枯草杆菌WB600芽孢比营养体对胃肠道环境和高温具有更强的耐受能力,且能顺利在虾肠道内定殖存活,有望在水产养殖领域发挥益生作用的同时成为新型的口服疫苗载体。     

一株水产芽孢杆菌的筛选鉴定及其净水效果研究

从刺参(Stichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离芽孢杆菌,筛选后获得1株优势目的菌株YT-2;根据形态学特征和生理生化特性结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。安全性试验证实,枯草芽孢杆菌YT-2对孔雀鱼(Poecilia reticulata)和南美白对虾(Penaeus vannamei)无毒性;水质净化试验结果显示,10d后菌株YT-2对养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解率分别为81.9%和64.3%,表明该菌对净化养殖池塘水质有明显的作用,具有作为益生菌开发应用的潜力。     

一株从草鱼中分离的嗜水气单胞菌的病原学及基因组特征

为确定南昌地区某渔场草鱼出血性败血症的病原体及病原特征，从患病草鱼的肝脏病灶中分离出一株致病菌A1310。对分离菌进行了形态特征、理化特性等表型生物学检验、人工感染实验及对抗菌药物的敏感性实验，并对其进行了全基因组测序、基于多序列位点分型(multilocus sequence typing，MLST)的系统进化分析及毒力基因分析。结果显示，生理生化鉴定证明该菌为嗜水气单胞菌，当浓度达1.0×10⁶ CFU/mL时，对草鱼有致病性；对供试20种抗菌药物中的青霉素等7种耐药，对卡那霉素等5种敏感；A1310株基因组框架序列共包含96个与毒力和防御相关基因，其中多药耐药性外排泵基因占大多数，约为22%；与美国斑点叉尾鮰分离株(S15-242、S15-458、S15-591、S15-700)聚类为同一进化分支；比较基因组分析发现，A1310具有一个删减版的Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)，基因数量为标准Ⅵ型分泌系统的80%，缺少vgrG和vca0109基因的部分片段。综上所述，来源于草鱼的嗜水气单胞菌菌株A1310，与美国斑点叉尾鮰分离株具有亲缘关系，含有多个已报道的嗜水气单胞菌的毒力基因。本研究不仅丰富了嗜水气单胞菌的生物学性状内容，也为嗜水气单胞菌的有效检验、防治和深入研究提供一定的参考，对草鱼的疾病防控具有一定意义。     

草鱼miR-462通过靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1调控嗜水气单胞菌感染诱导的免疫应答

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny,CIK)后的调控机制,实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462表达水平的变化;运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统进行确定;此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果显示,在CIK细胞感染嗜水气单胞菌的过程中,miR-462的表达发生显著变化;cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高,与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示,miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3′非编码区抑制其表达,过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后,下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达受到抑制。研究表明,miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-462可通过靶向slc9a3.1和tbk1影响下游基因的功能。     

草鱼miR-23a在嗜水气单胞菌感染过程中的调控机制

为探索嗜水气单胞菌感染后草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)中miR-23a的调控机制,实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)测定了嗜水气单胞菌感染CIK细胞后miR-23a的表达量变化,使用RNAhybrid软件预测miR-23a的靶基因并用双萤光素酶报告基因检测系统进...     

肌醇对嗜水气单胞菌致生长期草鱼头肾和脾脏氧化损伤的保护作用

本实验探索了肌醇对嗜水气单胞菌致生长期草鱼头肾和脾脏氧化损伤的保护作用。实验选取平均体质量（221.83±0.84） g的草鱼540尾，随机分为6组，每组3个重复，分别饲喂含不同水平肌醇[27.0（基础饲料组，未添加肌醇）、137.9、286.8、438.6、587.7和737.3 mg/kg]的饲料10周。随后经腹腔注射嗜水气单胞菌进行14 d攻毒实验。结果显示，嗜水气单胞菌注射后，与基础饲料（未添加肌醇）组相比，饲料中适宜水平肌醇组生长期草鱼头肾和脾脏活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）和蛋白质羰基（PC）含量显著降低，而超氧化物歧化酶（SOD/CuZn-SOD和MnSOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx/GPx1a、GPx1b、GPx4a和GPx4b）、谷胱甘肽S-转移酶（GST/GSTP1、GSTP2、GSTO1和GSTO2）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性及mRNA水平，谷胱甘肽（GSH）含量显著提高。此外，饲料中适宜水平肌醇上调了嗜水气单胞菌注射后生长期草鱼头肾和脾脏核因子E2相关因子2（Nrf2）mRNA和蛋白水平，下调了Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）a和b mRNA水平。研究表明，饲料中适宜水平肌醇可激活鱼类头肾和脾脏Nrf2信号途径，提高其抗氧化能力，增强抵抗嗜水气单胞菌致头肾和脾脏氧化损伤的能力。此外，以嗜水气单胞菌注射后生长期草鱼头肾和脾脏ROS含量为标识，生长期草鱼肌醇需要量分别为452.1和449.0 mg/kg。     

亚洲草鱼群体的差异甲基化分析

为探究水产养殖过程中DNA甲基化对亚洲草鱼群体人工驯化与环境选择适应的影响，本实验对亚洲范围内8个地区的养殖和野生草鱼群体进行了全基因组甲基化测序，测序序列经质控后比对到草鱼参考基因组上，并进行差异甲基化分析和功能富集分析。结果显示，甲基化测序共获得308.15 Gbp测序数据，平均测序深度31×，平均比对率62.97%。对5个养殖群体分别与野生背景群体间进行差异甲基化分析，共发掘出76 422个差异甲基化位点、3 737个差异甲基化区域、1 950个差异甲基化基因。功能分析发现，差异甲基化基因被注释到血管生成、神经嵴细胞迁移、T细胞分化、颅骨系统发育、肌肉细胞发育等GO功能分类中。KEGG代谢途径富集分析的结果显示，差异甲基化基因主要参与细胞黏附连接、Notch信号通路和Wnt信号通路等代谢途径。在这些功能注释的基因中，有许多与神经、免疫、骨骼和肌肉等组织发育相关的重要基因，如sema3d、sema5bb和nrg2a等。本研究进一步对表观遗传修饰在草鱼人工驯化和环境选择适应作用机制的探究奠定了基础，为保存和科学利用草鱼种质资源提供了有价值的遗传基础数据。     

Isolation and identification of a phosphate-solubilizing bacterium Pantoeastewartii subsp. stewartii g6, and effects of temperature, salinity, and pH on its growth under indoor culture conditions

In South China, certain problems exist in some of aquaculture pond ecosystems, where the concentrations of total phosphorus are high in the sediment but the concentrations of phosphate are low in the overlying water. It is very important and necessary to isolate and screen some phosphate-solubilizing bacteria (PSB) that can adapt to the pond environment for enhancing the utilization of phosphorus in the aquaculture systems. To reach the objective, one PSB, named g6, was isolated using modified Pikovskaya and Pikovskaya medium. By 16S rDNA sequencing analysis and BIOLOG auto-identification system, this strain was identified as Pantoea stewartii subsp. stewartii. After 144 h strains cultivation in liquid National Botanical Research Institute’s phosphate growth medium, its activity resulted in accumulations of soluble phosphate 543 mg l⁻¹. Based on the aquaculture pond ecosystems in South China, effects of temperature, salinity, and pH on g6’s growth were also conducted under indoor culture conditions. Results indicated that Pantoea stewartii subsp. stewartii g6 could tolerate wide range of temperature 15–35°C, salinity 5–35‰, and initial pH 6–10. The results showed that g6 had high solubilization efficiency in vitro and could be expected to adapt well to different aquaculture pond environments, based on culture results.     

sodA、sodB和KatG在嗜水气单胞菌抗氧化胁迫中的协同作用

以嗜水气单胞菌野生株B11和基因稳定沉默株sodA-RNAi、sodB-RNAi和KatGRNAi为研究对象,比较野生株和沉默株在不同氧化胁迫条件下sodA,sodB和KatG表达的相关性及与细菌生长和存活的相关性,以探讨抗氧化胁迫基因在细菌抵御氧化胁迫过程中的作用和机制。结果显示,无氧化胁迫条件下sodA、sodB和KatG中任何一个基因被沉默后,其余两个基因的表达均受到显著抑制,说明这些抗氧化胁迫基因在表达上密切相关。在外源H2O2胁迫下,sodA、sodB和KatG中任何一个基因被沉默后,其他两个抗氧化胁迫基因的表达均表现为显著上调;在甲基紫晶(MV)诱导的内源性活性氧(ROS)胁迫下,各沉默株中sodA或sodB的表达水平总体表达为上调,但是在KatG的表达却呈现下调,说明sods的表达在细菌抵御内源性ROS的损伤中更具重要性。在H_2O_2胁迫下,随着H_2O_2浓度的增加,野生株B11的存活率仍然保持在较高的水平,而沉默株sodA-RNAi、sodB-RNAi和KatG-RNAi的存活率则显著降低;此外,菌株生长曲线显示,sodA、sodB和KatG的表达可影响嗜水气单胞菌生长曲线延滞期的长短。在不同浓度MV诱导的ROS胁迫下,野生株B11和沉默株KatG-RNAi的存活率仍然保持在较高的水平,沉默株sodA-RNAi和sodB-RNAi的存活率则显著降低,但4株菌仍然能保持一定的生长能力。研究表明,在不同氧化胁迫条件下,细菌可通过不同抗氧化胁迫基因的协同作用,共同抵御ROS的损伤,在H_2O_2的胁迫下,KatG对嗜水气单胞菌的生存更为重要,而在MV诱导的内源性ROS胁迫下,sod的表达对嗜水气单胞菌生存的贡献更为突出。     

鳖源柠檬酸杆菌属新种的分离鉴定与多位点序列

为确定2020年10月湖北一中华鳖发病的病原体及病原特征，实验从该养殖场患病中华鳖个体肝脏中分离获得1株优势菌A3，经理化性状及16S rRNA序列鉴定，表明菌株A3属于柠檬酸杆菌。进一步通过recN序列鉴定，发现A3与布氏柠檬酸杆菌recN碱基一致性为95.58%～96.01%，与柠檬酸杆菌属其他种的recN碱基一致性均低于93.72%，表明菌株A3为柠檬酸杆菌属潜在新种。人工回归感染实验证实菌株A3是引起本次中华鳖患病的病原菌。与嗜水气单胞菌相比，A3感染病程偏慢但致死率较高。药敏实验结果显示，菌株A3对美罗培南等10种抗生素敏感，对氟苯尼考等9种抗生素耐药。多位点序列分型(MLST)鉴定显示，菌株A3属于新序列型(ST)。对柠檬酸杆菌多位点序列分型的7个管家基因序列进行级联并构建系统发育树，结果显示，柠檬酸杆菌的进化与菌株的分离源及分离地点没有明显关系；菌株A3与分离自欧洲人源的ST120型菌株Citfre2580亲缘关系最近。本研究对中华鳖的病原进行了分离鉴定，并阐述了一种更可靠的柠檬酸杆菌鉴定方法，旨在引起人们对柠檬酸杆菌致病性的重视，为水产品健康养殖提供一定的参考依据。     

Screening of gastrointestinal bacteria of Indian major carps for a candidate probiotic species for aquaculture practices

Probotic selection could be detrimental for the success of aquaculture practices. While, in most of the cases emphasis is given to the production of antibacterial compounds, and in vitro inhibitory activities of a bacterium for choosing a probiotic strain, however, other criteria like non‐antibiotic resistant, non‐haemolytic nature and non‐pathogenic potentiality of probiotic strain are often overlooked. We have screened gastrointestinal bacteria isolated from all the three species of Indian major carps viz., Labeo rohita, Catla catla and Cirrhinus mrigala for a suitable probiotic. Bacteria like Aeromonas (Aeromonas species, A. hydrophila), Micrococcus, Corynebacterium, Plesiomonas, Bacillus (Bacillus species, B. subtilis) and Pseudomonas (Pseudomonas species, P. aeruginosa) exhibited antibacterial activities against different pathogens. Among these, B. subtilis was found to grow at a wider range of temperatures, pH and salt concentrations and was non‐haemolytic, non‐antibiotic resistant, non‐pathogenic and inhibited all the tested primary and secondary pathogens. Dietary supplementation of the bacteria at 10⁸ CFU g^?1 feed also enhanced the growth of Indian major carp, L. rohita. Based upon these characteristics, we aimed to develop a suitable probiotic for aquaculture practices.     

Inhibitory activity of probiotic Enterococcus faecium MC13 against Aeromonashydrophila confers protection against hemorrhagic septicemia in common carp Cyprinuscarpio

The present study involved the control of Aeromonas hydrophila in Cyprinus carpio by bacteria Enterococcus faecium MC13 isolated from fish Mugil cephalus intestine. Antagonistic effects were confirmed against Aeromonas hydrophila by cross-streaking and the agar spot method. Probiotic effects of the isolate were confirmed by injection and oral administration to check for nonpathogenicity to fish. All the two probiotics were orally administered to fingerlings of Cyprinus carpio for 60 days through feed. The intestinal load of bacteria and NBT assay were analyzed on 7, 15, 30, and 60th day of treatment. Experimental fish were challenged with Aeromonas hydrophila on 30 and 60th day. The neutrophil activity was higher in E. faecium MC13 fed fish on day 60 (1.525 ± 0.379 OD). In respect of relative percentage survival (RPS), the higher protection of 75 and 77.8% was observed in E. faecium MC13 fed fish on 30 and 60th day of challenge with Aeromonas hydrophila This study identified the bacterial probiont MC13 (Enterococcus faecium) effectively controlled the Aeromonas hydrophila infection in Cyprinus carpio.