脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及其表达特征分析

本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列，采用cDNA末端快速扩增技术克隆获得了脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT)。该基因cDNA全长为1855 bp，其中，开放阅读框为1407 bp，5?端非编码区为39 bp，3?端非编码区为409 bp，共编码468个氨基酸，预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa，理论等电点为4.90。同源性分析显示，脊尾白虾SHMT基因与甲壳类动物真宽水蚤(Eurytemora affinis)同源性最高，为96%。荧光定量分析结果显示，SHMT基因在脊尾白虾眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢中均有表达，其中，卵巢表达量最高，心脏次之。不同浓度Cd2+胁迫结果显示，其在低浓度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L) Cd2+胁迫中的表达模式基本一致，呈先升高后下降再升高再下降的趋势；而在高浓度(0.0278 mmol/L) Cd2+胁迫中，该基因表达量很低，甚至不表达，说明高浓度Cd2+胁迫可以抑制该基因的表达，具体机制有待进一步研究。     

碳酸盐碱度对脊尾白虾生存、生长、繁殖及免疫酶活性的影响

采用静态毒理学方法研究了不同碳酸盐碱度(3.5,5,6.5,8 mmol/L)胁迫对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)生存、生长、繁殖及免疫酶活性的影响。结果表明,碳酸盐碱度对脊尾白虾的96 h LC_(50)值为8.73 mmol/L(p H约为9.15);脊尾白虾的死亡率、特定生长率、抱卵率、孵化率、性腺发育及变态幼体成活率随碱度的上升而降低,3.5 mmol/L的低碳酸盐碱度对脊尾白虾生长繁殖影响不显著(P≥0.05),高于该碱度则会显著降低其生长及繁殖能力(P0.05);随着碳酸盐碱度胁迫时间的增加,各碱度胁迫组脊尾白虾鳃和肝胰腺中的免疫酶活性均呈先升高后降低的变化趋势。研究结果表明,脊尾白虾具有较高的碳酸盐碱度耐受性,碳酸盐碱度为3.5 mmol/L时对生长和繁殖影响不显著,高于5 mmol/L时影响显著;高碳酸盐碱度胁迫下脊尾白虾可以通过调节免疫酶的活性更好地适应高碱环境。     

氨氮对脊尾白虾幼虾和成虾的毒性试验

在水温24℃、盐度31、pH8.1条件下,研究了氨氮对脊尾白虾幼虾和成虾的毒性。试验结果表明,氨氮对脊尾白虾幼虾24、48、72、96h的半致死质量浓度分别为155.81、116.71、92.55、80.40mg/L,氨氮对脊尾白虾成虾24、48、72、96h的半致死质量浓度分别为178.80、156.37、140.28、120.86mg/L。脊尾白虾幼虾总氨氮和非离子氨的安全质量浓度为8.04、0.26mg/L,成虾总氨氮和非离子氨的安全质量浓度为12.09、0.50mg/L。     

蒽对脊尾白虾存活和免疫的影响

以脊尾白虾(Palaemon carincauda)为研究对象进行葱的毒性试验,设置0、6、9、12、15、18、21和24 mg/L 8个处理,每个处理设3个重复,每个重复10只白虾,96小时试验结果发现,蒽对白虾的24小时半致死浓度为19.62 mg/L、48小时半致死浓度为15.61 mg/L、72小时半致死浓度为11.18 mg/L、96小时半致死浓度为7.21 mg/L,安全浓度为2.95 mg/L。之后在蒽安全浓度下胁迫脊尾白虾,设2个处理,每个处理3个重复,每个重复60只白虾,使用相关酶活性试剂盒测定脊尾白虾0、3、6、12、24、48、96和192小时的超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力、过氧化物酶活性和丙二醛含量,结果发现随着时间的推移,虾体内超氧化物歧化酶活性先升高然后逐渐降低,丙二醛含量上下波动无明显变化,总抗氧化能力先升高后逐渐减小,过氧化物酶活力在波动中逐渐上升。总的来说,蒽会降低脊尾白虾的免疫调节能力。     

二硫氰基甲烷对脊尾白虾的急性致毒实验

利用水生动物急性毒性试验方法,分8个浓度进行二硫氰基甲烷对脊尾白虾的急性毒性试验.结果表明,二硫氰基甲烷对该地区养殖的脊尾白虾24、48、72和96h的半致死质量浓度LC50分别为0.364、0.200、0.032和0.022mg/L,并计算出二硫氰基甲烷对脊尾白虾的安全浓度Sc为0.002mg/L.试验结果提示,在脊尾白虾的养殖过程中,二硫氰基甲烷需慎用.     

蒽对脊尾白虾存活、免疫和能量分配的影响

以脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)为试验对象,探讨了蒽对脊尾白虾存活、免疫和能量分配的影响。将同一批亲虾繁殖的幼虾放在试验室暂养7 d,挑选健康活泼和规格相似的幼虾作为试验对象,推算蒽对脊尾白虾的半致死浓度和安全浓度。试验设置8个浓度梯度,每个处理设3个重复。在试验过程中,每个水族箱加入5只白虾,经试验计算蒽对脊尾白虾24、48、72和96 h半致死浓度分别为21.53、16.31、11.76和9.06 mg/L,安全浓度为2.81 mg/L。在安全浓度下胁迫192 h,测定血清酚氧化酶和超氧化物歧化酶的活性,发现蒽对脊尾白虾免疫有着一定程度的抑制作用。随后在安全浓度下试验21 d,设两个处理,每个处理设3个重复,每个重复投放10只白虾,待试验结束后,选取白虾的肌肉部分进行能量分配测定,计算出蛋白含量、脂肪含量、糖元含量和肌肉的总能量储备以及对应能量分配的变化,结果发现对照组与处理组总能量储备相差240.67 mJ·mg^-1(湿重),能量消耗相差252 mJ·mg^-1(湿重),细胞能量分配相差11.33 mJ·mg^-1·h^-1(湿重)。以上结果表明,蒽明显影响脊尾白虾的存活、免疫和代谢。     

长期碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长及卵巢发育的影响

为探讨碳酸盐碱度对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）生长及卵巢发育的影响。本研究设置3 mmol/L（对照组）、5 mmol/L和8 mmol/L 3种碳酸盐碱度梯度养殖脊尾白虾60天,比较不同碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长性能、组织结构、酶活性以及卵巢发育的影响,结果显示：5 mmol/L组与对照组体长增长率、体重增长率以及成活率差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组体长增长率、体重增长率以及成活率显著低于对照组（P<0.05）。肝胰腺组织切片显示,5 mmol/L组中部分B细胞体积增大,部分转运泡内出现颗粒物质,8 mmol/L组管腔的形态结构严重变形。鳃组织切片显示,5 mmol/L组出现轻微鳃丝肿大现象,角质层略有变形,且角质层下间隙扩张变长,上皮细胞与支柱细胞排列紊乱;8 mmol/L组鳃丝肿大,排列不规则,出现血细胞肿胀现象,鳃丝上皮细胞严重破坏,毛细血管网结构形态改变,角质层下间隙变形。肌肉组织酶活性测定结果显示,5mmol/L组的碳酸酐酶活性显著高于对照组（P<0.05）,Na+/K+-ATP酶活性在肌肉中差异不显著（P>0.05）;肝胰腺组织酶活性测定结果显示,碳酸酐酶在肝胰腺组织中差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组Na+/K+-ATP酶活性显著低于其他组（P<0.05）,鳃组织中,5 mmol/L和8 mmol/L组鳃组织中和Na+/K+-ATP酶活性均显著高于对照组（P<0.05）,且两组间差异显著。卵巢发育统计结果显示,三组脊尾白虾卵巢均能发育,其发育至Ⅱ期的百分比分别为20.51%、10.52%和6.25%,其中5 mmol/L组与对照组间无显著差异（P>0.05）,8 mmol/L组显著低于对照组（P<0.05）;3 mmol/L组和5 mmol/L组均有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾,但两组差异不显著（P>0.05）,8 mmol/L组未见有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾。卵巢组织切片显示,8 mmol/L组卵原细胞细胞排列疏松,周围滤泡细胞排列疏松且数量较少。综上所述,脊尾白虾可以在低于8 mmol/L的碳酸盐碱度中生长发育,但高碳酸盐碱度可能会造成脊尾白虾鳃和肝胰腺组织损伤,导致其生长受到影响,同时猜测高碳酸盐碱度可能也会影响卵巢的发育速度。     

致病性粪肠球菌对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫相关基因表达的影响

为了研究致病性粪肠球菌(Enterococcus faecalis)对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫相关基因表达的影响,分别对健康脊尾白虾注射生理盐水和粪肠球菌,测定了不同时间点血细胞和肝胰腺中酚氧化酶原(proPO)、C型凝集素(CTL)、超氧化物歧化酶(SOD)、组织蛋白酶D(Cat D)和组织蛋白酶L (Cat L)基因的相对表达量变化.结果显示,与对照组相比,感染粪肠球菌后,血细胞和肝胰腺中proPO基因表达量均于6h达到最大值(P＜0.05),随后逐渐降低至对照组水平;血细胞和肝胰腺中CTL基因表达量分别于12h和6h上升至最大值,随后逐渐降低;血细胞中CTL基因表达量于72 h虽有降低,但仍显著高于对照组(P＜0.05);血细胞和肝胰腺中SOD基因表达量分别于6h和3h达到最大值,随后逐渐降低,并于72 h达到正常水平;血细胞和肝胰腺中Cat D基因表达量变化趋势基本一致,呈现先降低后升高、然后显著降低再升高的趋势;血细胞和肝胰腺中Cat L基因表达量分别于6h和3h显著降低,随后逐渐升高至最大值,并于72 h达到对照组水平.研究表明,长时间的粪肠球菌感染对脊尾白虾免疫相关基因表达影响显著,本研究所用免疫相关基因均可作为粪肠球菌感染疾病的监测指标.     

致病性粪肠球菌对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫相关基因表达的影响

为了研究致病性粪肠球菌(Enterococcus faecalis)对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)免疫相关基因表达的影响,分别对健康脊尾白虾注射生理盐水和粪肠球菌,测定了不同时间点血细胞和肝胰腺中酚氧化酶原(proPO)、C型凝集素(CTL)、超氧化物歧化酶(SOD)、组织蛋白酶D(Cat D)和组织蛋白酶L(Cat L)基因的相对表达量变化。结果显示,与对照组相比,感染粪肠球菌后,血细胞和肝胰腺中pro PO基因表达量均于6 h达到最大值(P0.05),随后逐渐降低至对照组水平;血细胞和肝胰腺中CTL基因表达量分别于12 h和6 h上升至最大值,随后逐渐降低;血细胞中CTL基因表达量于72 h虽有降低,但仍显著高于对照组(P0.05);血细胞和肝胰腺中SOD基因表达量分别于6 h和3 h达到最大值,随后逐渐降低,并于72 h达到正常水平;血细胞和肝胰腺中Cat D基因表达量变化趋势基本一致,呈现先降低后升高、然后显著降低再升高的趋势;血细胞和肝胰腺中Cat L基因表达量分别于6 h和3 h显著降低,随后逐渐升高至最大值,并于72 h达到对照组水平。研究表明,长时间的粪肠球菌感染对脊尾白虾免疫相关基因表达影响显著,本研究所用免疫相关基因均可作为粪肠球菌感染疾病的监测指标。     

镉胁迫对凡纳滨对虾血细胞基因表达的影响

为探讨镉(Cd)胁迫下凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血细胞的分子响应,以不同浓度的Cd2+(0,0.5 mg/L和5 mg/L)进行胁迫,于不同胁迫时间取血淋巴,测定血细胞中Trx 2、Grx 2、Grx 3和MGST 3的基因表达量变化。结果显示,Trx 2、Grx 3和MGST 3表达量在胁迫的中后期显著上调,Grx 2表达量在5 mg/L Cd2+胁迫6 h开始即有显著的升高,并持续至48 h。结果表明在Cd胁迫作用下,对虾血细胞中上调这四个氧化还原与抗氧化相关基因的表达水平,以进行胁迫防御;Grx 2对Cd胁迫较为敏感,在整个胁迫过程发挥作用,Trx 2、Grx 3和MGST 3主要在胁迫的中后期发挥作用;基因的表达响应具有一定浓度效应。     

脊尾白虾全人工繁育技术初步研究

脊尾白虾是我国沿海地区池塘养殖重要品种,但目前尚未实现全人工繁育,严重制约了产业进一步发展。选取野生脊尾白虾作为亲虾,经过越冬培育、促熟交尾、幼体孵化培育、仔虾选育等手段,进行了脊尾白虾全人工繁育技术研究。试验结果显示,在盐度31.3、水温18.1~26.2℃、pH 8.1条件下,室内越冬脊尾白虾亲虾可成功培养至性腺成熟,并交尾抱卵,平均抱卵率达70%,平均孵化率为61.02%。幼体最佳培育密度20尾/L,仔虾适宜养殖密度0.13~0.53尾/L,培育至2cm时存活率可达80%,继续培育3个月后发育至性成熟。一年可繁殖2~3代。在此基础上建立了脊尾白虾近交家系,现已培育至第6代,各家系繁殖力、生长速度和存活率均未出现近交衰退现象。本研究初步解决了脊尾白虾室内全人工繁育技术,并为试验动物培育奠定了良好的技术基础。     

脊尾白虾腺苷酸转移酶基因应答蜕皮的表达特征研究

蜕皮是脊尾白虾等甲壳类生物的一种特殊生活史,在前期克隆获得腺苷酸转移酶基因的基础上,研究了该基因在脊尾白虾蜕皮后不同组织和不同时间点(0、1、5、10、15min)的表达特征。试验结果表明,蜕皮后鳃组织中腺苷酸转移酶基因的表达量显著上升(P0.01);在蜕皮后1min,腺苷酸转移酶基因的表达量开始升高,至10min时达到峰值,随后下降。该结果显示,腺苷酸转移酶基因的表达特征与脊尾白虾蜕皮时的行为学特征一致,说明腺苷酸转移酶基因在甲壳动物蜕皮过程中起着非常重要的作用。     

生石灰对蟹虾围塘养殖的影响

通过对越冬和非越冬锯缘青蟹、脊尾白虾、弹涂鱼耐生石灰试验,证明青蟹有很强的耐生石灰能力,脊尾白虾有较强的耐生石灰能力。蟹虾围塘养殖在围塘清淤后对越冬青蟹进行生石灰消毒,养殖过程中定期用生石灰泼洒,并与对照塘做对比试验,以及大面积推广应用,结果表明:使用生石灰能使围塘锯缘青蟹、脊尾白虾发病率显著减少,成活率显著提高,生长明显加快,蜕壳时间相对集中,饵料系数明显降低,产量和效益显著提高。生石灰对围塘蟹虾健康生长有很大作用。     

Cu~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)对厚颌鲂幼鱼的联合致毒效应研究

采用单因子静态急性毒性试验方法与加和等毒性溶液法,分别研究了Cu2+、Zn2+、Cd2+对厚颌鲂(M ega-lobrama pellegrini)幼鱼的急性毒性和联合毒性效应。结果显示:3种重金属离子对厚颌鲂幼鱼的毒性由强到弱依次为Cu2+、Cd2+、Zn2+,其中Cu2+对厚颌鲂幼鱼24 h、48 h、72 h、96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为0.54 mg/L、0.38 mg/L、0.27 mg/L、0.23 mg/L;Cd2+对厚颌鲂幼鱼24 h、48 h、72 h、96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为14.32 mg/L、8.34 mg/L、6.36 mg/L、4.44 mg/L;Zn2+对厚颌鲂幼鱼24 h、48 h、72 h、96 h的半致死质量浓度(LC50)分别为21.95 mg/L、17.56 mg/L、15.33 mg/L、14.62 mg/L。Cu2+、Cd2+、Zn2+对厚颌鲂幼鱼的安全质量浓度分别为0.056 mg/L、0.849 mg/L、3.372 mg/L。Cu2+、Cd2+、Zn2+两两共存时对厚颌鲂幼鱼96 h的联合毒性效应均表现为毒性增强的协同作用。     

Cd胁迫对泥蚶Cd积累及相关生理代谢的影响

为了探讨镉(Cd)胁迫对泥蚶(Tegillarca granosa)体内重金属 Cd 含量积累、相关酶活力变化及基因表达水平的影响, 本研究将泥蚶暴露于 Cd 质量浓度为 0 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L 的海水中, 对其软体部 Cd 含量, 超氧化物歧化酶(SOD)和三磷酸腺苷酶(ATP)的酶活力, 丙二醛(MDA)含量以及 ATP 结合盒转运子 A 家族(ABCA3)、 金属硫蛋白(MT)、ATP 合酶(ATP)、超氧化物歧化酶(SOD)基因表达等指标的变化进行分析。结果显示, Cd 胁迫后泥蚶软体部 Cd 含量明显增加, 呈现明显的时间–剂量效应；Cd 胁迫后 0.05 mg/L 和 0.1 mg/L 质量浓度组中鳃和外套膜 Cd 含量显著高于其他组织(P＜0.05), 0.5 mg/L 组内脏团 Cd 含量最高。Cd 胁迫后泥蚶内脏团中 SOD 酶和 ATP 酶活力及 MDA 含量前期呈上升趋势, 后期呈现下降趋势, 且均高于对照组。Cd 胁迫后 ABCA3、SOD、MT 基因表达上调, ATP 合酶基因的表达与对照组相比没有显著变化。胁迫后泥蚶软体部 Cd 大量增加, 诱导机体产生氧化应激反应, 泥蚶通过调整自身酶活力和相关基因表达水平的变化, 减少 Cd 胁迫产生的氧自由基对自身的毒害作用。     

镉胁迫对泥鳅金属硫蛋白基因表达的影响

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析了不同浓度Cd2+(0、0.25、2.5 mg/L)胁迫24、48、72 h对泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)肝脏和鳃中金属硫蛋白(MT)基因相对表达水平的影响。结果表明,泥鳅肝脏和鳃MT基因的表达对外源Cd2+胁迫所表现出的反应存在差异,肝脏比鳃更为敏感;Cd2+浓度越高,胁迫时间越长,则肝脏和鳃中MT基因的相对表达水平越高。在受到Cd2+胁迫时,肝脏和鳃中大量表达MT,可降低Cd2+对机体造成的损伤。泥鳅MT基因可以作为监测水环境中镉污染的生物标志物之一。