拟赤梢鱼卵巢早期发育与sox3基因cDNA克隆及表达分析

为初步阐明拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)卵巢发育特征及sox3 (sry related high mobility group box 3)基因在其卵巢发育过程中的作用,本研究通过组织切片观察了拟赤梢鱼卵巢早期发育过程,利用RACE技术克隆了该鱼sox3基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术分析了sox3基因在拟赤梢鱼不同组织及性腺不同发育时期的表达模式。结果显示,拟赤梢鱼卵巢在孵化后45 d分化形成,160 d时由Ⅰ期进入Ⅱ期,孵化后360 d,卵巢仍处于Ⅱ期。拟赤梢鱼sox3基因cDNA全长为1 800 bp (GenBank登录号：MT952206),编码299 个氨基酸,存在保守的HMG (histidine, methionine, glycine-rich)结构域。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示,拟赤梢鱼SOX3蛋白与斑马鱼(Danio rerio)和翘嘴鲌(Culter alburnus)亲缘关系最近。此外,sox3基因在拟赤梢鱼卵巢中表达量最高,其次是脑和眼睛,在精巢和其他组织中微量表达;在性腺分化过程中,sox3基因在卵巢中表达量显著高于未分化性腺和精巢,在卵巢发育阶段表达量不断升高,而在精巢中持续低水平表达。综上,本研究推测sox3基因主要参与拟赤梢鱼卵巢的分化和发育。     

不同倍性鲫鲤MeCP2基因分子克隆及时空表达分析

为了探寻不同倍性鱼生殖育性的表观遗传调控规律,实验基于不同倍性鲫鲤精巢的转录本信息库设计引物克隆了不同倍性鲫鲤的MeCP2基因。序列比对结果发现,在远缘杂交的过程中基因组发生了遗传重组和变异。基于序列公共部分设计引物,通过半定量PCR和实时定量PCR的方法分析了MeCP2基因在不同倍性鱼发育过程中的时空表达特征。结果还发现,MeCP2基因在所有组织中都有表达,但在脑组织中的表达量最高;纵向对比性腺的发育过程,MeCP2基因的表达量会随着性腺发育成熟而下降;横向对比不同倍性鱼的性腺发育,MeCP2基因在三倍体鱼卵巢中的表达量明显高于二倍体和四倍体鱼,但在精巢中的表达量随鱼的倍性增加而增加。研究表明,MeCP2基因的表达与不同倍性鱼的卵巢发育密切相关,这为研究鱼类生殖不育的分子机理及其在水产育种上的应用奠定了坚实的基础。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

中华鳖StAR基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

摘要 为探索StAR基因在中华鳖（Pelodiscus sinensis）性腺发育过程中的作用，利用RACE技术克隆获得中华鳖StAR基因全长cDNA，采用Real-time PCR分析其在不同组织及胚胎不同发育时期的表达情况，并制备多克隆抗体，采用western blot检测StAR在不同组织的表达，通过免疫组化对其在细胞中的表达进行定位，同时检测芳香化酶抑制剂来曲唑处理雄性中华鳖后StAR在精巢中的表达情况。结果显示：该基因全长2377bp，开放阅读框903bp，编码300个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析表明，中华鳖StAR与龟类亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，StAR基因在精巢中表达量最高，显著高于其他组织；StAR基因于中华鳖胚胎发育16期已有表达，20期表达量最高，提示StAR可能参与中华鳖早期性腺分化;来曲唑处理的中华鳖精巢中，StAR表达量显著降低。本研究利用原核表达系统构建中华鳖StAR基因原核重组表达载体，经蛋白纯化后免疫小鼠，获得中华鳖StAR多克隆抗体。Western blot检测结果显示StAR在不同组织的表达量与荧光定量结果基本一致。免疫组化结果显示，StAR蛋白在卵巢间质细胞、精巢的间质细胞，精原细胞及胞质中表达。研究表明，StAR基因可能参与中华鳖性腺发育过程。     

拟穴青蟹PHGPx基因的克隆及其表达分析

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(Phospholipid hydroperoxide Glutathione Peroxidase, PHGPx)是GPx基因家族的重要一员,能特异地清除磷脂和胆固醇等氢过氧化物,在机体抗氧化、抗凋亡、抗炎症以及雄性性成熟等过程中发挥着重要的作用。本研究从实验室拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)转录组数据库中筛选出该基因的EST序列,利用SMART-RACE 技术克隆得到该基因的全长cDNA。经Blast 比对后,其与丰年虾(Artemia franciscana)的PHGPx氨基酸序列一致性最高,达到69%。同时系统进化树分析表明,该基因与其他物种的PHGPx(GPx4)聚为一支,而与GPx1、GPx2等亚型距离较远,故命名该基因为Sp-PHGPx。实时定量PCR结果显示,Sp-PHGPx在成熟青蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达,其中精巢的表达量最高;且在雌雄相同组织中,雌性性腺的表达量显著低于雄性;而在鳃和心脏中的表达量显著高于雄性。在性腺不同发育阶段,Sp-PHGPx在卵巢发育过程中的表达量差异不显著;而在精巢发育过程中,其表达量在精子细胞期(T2期)显著高于精母细胞期(T1期)和成熟精子期(T3期),同时也显著高于卵巢发育各时期的表达量。在LPS应激下,鳃和肝胰腺中Sp-PHGPx的表达量分别在6h和12h显著上调;H2O2应激下,鳃中的表达量在3 h显著升高,肝胰腺中的表达量在被检测的各时相中无显著差异。以上结果表明,Sp-PHGPx可能在免疫防御反应以及精巢的发育和成熟等过程中发挥着重要作用。     

三疣梭子蟹甲基转移酶2基因克隆及在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(Pt Dnmt2)基因。该基因c DNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,PtDnmt2氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。系统进化分析显示,三疣梭子蟹PtDnmt2氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Dnmt2关系最近。qRT-PCR结果显示,PtDnmt2基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量显著高于其他组织(P0.05)。PtDnmt2基因在胚胎和幼体发育过程中的表达量随发育时期而变化,其在受精卵和多细胞时期无表达,从囊胚期开始出现,随着胚胎的发育表达量逐渐上升。在性腺发育不同时期PtDnmt2基因表达量存在显著差异,其在卵巢II期表达量最高,之后逐渐下降;在精巢中该基因的表达量随着精巢的发育逐渐上升,在IV期达到峰值。本研究结果表明,PtDnmt2基因参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控。     

泰国斗鱼Dmrt1基因的部分cDNA克隆及表达分析

Doublesex和Mab-3相关转录因子1(Dmrt1)隶属于DMRT家族,在脊椎动物性别决定、性别分化和性腺发育中具有重要作用。利用RACE克隆技术从泰国斗鱼脑中克隆Dmrt1基因的部分cDNA序列,分别采用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测Dmrt1基因的组织分布和胚胎发育过程的表达变化。试验结果显示,克隆的泰国斗鱼Dmrt1基因的部分cDNA序列长为1037 bp,其中开放阅读框长为798 bp,编码265个氨基酸残基;进一步构建Dmrt1系统进化树,结果显示,泰国斗鱼与龟壳攀鲈亲缘关系最近;半定量PCR和实时荧光定量PCR结果显示,Dmrt1基因的表达具有明显的组织特异性及性别差异,在雄性个体中,Dmrt1基因在精巢和脾脏中特异表达,而在雌性个体中,Dmrt1基因在心脏中高表达,其次在脑、垂体、脾脏、肌肉、肾脏和肠道中也有少量表达,但未在性腺和肝脏中表达。在胚胎发育过程中,Dmrt1基因在受精卵的表达水平最高,而在原肠胚至心跳期表达量较低。Dmrt1可能在调控泰国斗鱼的雄性个体的生殖发育过程中发挥着重要作用。     

圆斑星鲽sox9基因的克隆与表达

本研究筛选到圆斑星鲽(Verasper variegatus)的性别相关基因sox9,并通过RACE技术获得了全长序列,基因全长为3287 bp,包括1431 bp的ORF,编码477个氨基酸,368 bp的5¢ UTR和1488 bp的3¢ UTR。在3¢ UTR中有多聚腺苷酸尾和加尾信号AATAAA。通过荧光定量PCR测定了sox9基因在圆斑星鲽成鱼不同组织中的表达水平,发现sox9基因在圆斑星鲽的脑、眼、鳃、心、肝、胆、肠、精巢、卵巢、肾和肌肉等各个组织中都有不同程度的表达。在鳃、脑和精巢组织中检测到较高水平的sox9转录,其中精巢中的转录水平显著高于其他组织,sox9基因在性腺中的表达显示出性别两相性差异。其在精巢中的表达水平要显著高于卵巢,说明sox9基因与雄性性腺发育相关。通过测定sox9基因在圆斑星鲽幼鱼不同发育时期(20、30、40、50、60、70和80日龄)的表达水平,发现其在20~50日龄表达量逐渐下降,在60日龄时表达量上升,推测表达量上升可能与幼鱼性腺分化相关。     

Effects of synthetic kisspeptin peptides and GnRH analogue on oocyte growth and circulating sex steroids in prepubertal female chub mackerel (Scomber japonicus)

In recent years, kisspeptin peptides, encoded by kiss genes have been used to manipulate reproductive processes in farmed animals, including fish. Our previous studies demonstrated that the chub mackerel brain expresses kiss1 and kiss2 and intramuscular injection of synthetic Kiss1 pentadecapeptide (Kiss1‐15) but not Kiss2 dodecapeptide (Kiss2‐12) accelerates spermatogenesis in prepubertal male chub mackerel (Scomber japonicus). In the present study, we evaluated their effects in prepubertal female chub mackerel. The gonadosomatic index (GSI) values of experimental fish did not show any significant changes. Condition factor (CF) values increased significantly in Kiss1‐15 treated fish, in comparison with control and GnRH analogue (GnRHa) injected fish. Histologically, only perinucleolar oocytes were found in all experimental fish. However, Kiss and GnRHa treated fish showed a significant increase in the perinucleolar oocyte diameter, in comparison with the control fish. Gene expression analyses revealed decreased expression of gnrh1 in the telencephalon‐preoptic region of the brain of Kiss2‐12 and GnRHa injected fish, in comparison with control fish. In contrast, GnRHa injected fish exhibited higher levels of fshβ in the pituitary, with no changes in the levels of lhβ among different treatments. Levels of circulating sex steroids, testosterone, and estradiol‐17β were significantly higher in Kiss1‐15 injected fish, in comparison with control fish. These results indicate that synthetic kisspeptin peptides and GnRHa can induce oocyte growth in prepubertal female chub mackerel.     

马氏珠母贝Bcl-2-like基因克隆及其功能初探

B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma, Bcl-2)基因作为一种重要的细胞凋亡调控基因,在内源性细胞凋亡通路中发挥着重要的调控作用。实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmBcl-2-like基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析了PmBcl-2-like在马氏珠母贝不同组织、不同发育时期以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmBcl-2-like cDNA全长为2 180 bp,开放阅读框长度为1 650 bp,共编码549个氨基酸,分子量为21.62 ku;结构域预测分析表明PmBcl-2-like含有Bcl-2家族典型的BH1-4结构域;多序列比对以及进化树构建结果表明,PmBcl-2-like与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明PmBcl-2-like在马氏珠母贝8个组织中均有表达,在鳃中表达量最高,其次为性腺,表达量最低为中央膜区;在胚胎期表达量较高,受精卵时期表达量最高。机体受到脂多糖(LPS)刺激后,相对表达量在24 h达到最高,72 h降到最低,最高约为最低的2.5倍;肽聚糖(PGN)刺激后,相对表达量在6 h达到最高,48 h降到最低,最高约为最低的7.28倍;聚肌胞苷酸(Poly:IC)刺激后,相对表达量在3 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的6.49倍。研究表明,PmBcl-2-like可能在马氏珠母贝发育和免疫防御反应中担任着重要的角色。     

团头鲂促肾上腺皮质激素释放激素受体基因序列特征及表达分析

促肾上腺皮质激素释放激素受体(corticotropin-releasing hormone receptor,CRHR)是鱼类下丘脑–垂体–头肾调控轴上的重要应激调节因子。本研究通过c DNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆出团头鲂(Megalobrama amblycephala)CRHR1 m RNA全长序列,应用生物信息学方法对其序列特征进行解析;同时采用荧光定量PCR技术分析了团头鲂CRHR1的组织分布图谱及外源性皮质醇注射模拟应激处理下团头鲂CRHR1 m RNA的表达变化。研究结果表明,CRHR1 m RNA序列开放阅读框(open reading frame,ORF)为1290 bp,编码429个氨基酸。团头鲂CRHR1氨基酸序列与鲤科鱼类的CRHR1氨基酸序列同源性最高;该受体具有7次横跨膜结构和氨基端激素受体结构域。CRHR1在垂体中表达量最高,其次为下丘脑,在心脏、肝、脾等组织中表达丰度较低。经外源性皮质醇注射后,实验组血糖和血清皮质醇显著高于对照组,在处理2 h后达到峰值;实验组血清ACTH水平与对照组差异总体不显著,但呈现先升高后下降。应激处理后,CRHR1转录水平在4种组织中的表达变化存在差异;垂体中CRHR1在早期出现明显的表达抑制,在下丘脑中则呈现先缓慢升高后缓慢下降的趋势,而心脏和头肾中CRHR1在早期则表现出表达迅速上调而后缓慢下降的趋势。本研究进一步丰富了CRHR在鱼类研究方面的基础资料,为鱼类应激调控提供了理论基础。     

海藻酸钠-HCG制剂对雌性金鱼(Carassius auratus)生殖激素水平的影响

采用海藻酸钠(Na Alg)-HCG缓释制剂进行激素埋植实验。实验开始时,雌性金鱼(Carassius auratus)卵母细胞处于Ⅲ期。实验期间记录雌性金鱼性腺发育、放免(RIA)法测定血清性激素含量并且通过RT-PCR检测激素相关基因表达。结果表明,埋植Na Alg-HCG缓释激素后,雌性金鱼性成熟系数(GSI)在6-21 d显著高于对照组,血清睾酮(T)和雌二醇(E2)水平在6-30 d显著高于对照组;性腺芳香化酶基因(CYP19A基因)和雌激素受体基因(ERα基因)m RNA相对表达量分别在2-21 d、14-30 d内显著高于对照组,其性腺GH基因m RNA相对表达量变化不显著。研究结果显示,一次性埋植Na Alg-HCG缓释制剂,与雌性金鱼繁殖相关的生物学指标、激素水平、基因表达量较对照组产生明显变化,同时这种缓释制剂可以作为埋植激素的载体。     

WD Repeat‐containing Protein 73, A Novel Gene Correlated with Gonad Development in Large Yellow Croaker,Larimichthys crocea

The genome of Larimichthys crocea harbors more than 200 putative WD40 proteins. Yet, the function of these WD40 proteins remains unknown. Here a WD40 gene, wd73, was cloned and characterized in L. crocea (named as Lcwdr73). The cDNA is 1706 bp, including a 5′ untranslated region (UTR) of 51 bp, a 3′ UTR of 509 bp, and an open reading frame of 1146 bp encoding 381 amino acid residues. The putative LcWDR73 protein contains three WD40 domain motifs. The tissue expression profiles of both sexes revealed that Lcwdr73 was extremely highly expressed in testis and ovary, moderate in kidney and brain, and low in the other tissues by quantitative polymerase chain reaction analysis. Based on histology, the gonad development of L. crocea was divided into four phases: proliferative stage (Phase I), small developmental stage (Phase II), grand developmental stage (Phase III), and mature stage (Phase IV). With the gonad development, Lcwdr73 mRNA increased and reached a peak in Phase IV, and the expression in testes is significantly higher than that in ovaries, especially from Phase II to Phase IV, indicating that Lcwdr73 may play an important role during gonad development in L. crocea. The resutlts lay a foundation to control precocious puberty of L. crocea.     

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)LH β基因克隆及其在卵巢不同发育期的表达特征

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDNA序列全长597 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长438 bp,编码145个氨基酸,LHβ亚基mRNA具有广泛的组织分布特性。与肝脏和卵巢相比,垂体中LHβ亚基mRNA表达水平在卵巢发育各个阶段都有较高表达水平,在IV期表达水平迅速升高至较高水平并保持至VI期。卵巢中LHβmRNA表达水平在V期达到峰值,而肝脏中LHβmRNA表达水平在II期时达到峰值,在V期也有相对较高的表达水平。血浆LH和E2表达水平在卵巢发育周期中均呈现趋势一致的规律性变化。研究结果可为认识漠斑牙鲆生殖调控机制提供基础资料。     

团头鲂Hox基因家族的鉴定、进化与表达分析

Hox基因家族在调控动物早期胚胎发育、组织和器官生长起重要作用,因此这类基因家族被广泛应用到物种进化和发育调控的研究中。为了探究Hox基因在团头鲂中分布,进化及表达调控作用,同时为了探究Hox基因与团头鲂肌间刺发育的关系,研究基于团头鲂全基因组数据,结合生物信息学分析方法对其Hox基因家族进行鉴定、染色体分布、系统进化和表达模式分析。结果显示,在团头鲂基因组中共鉴定出49个Hox基因,根据系统进化分析分为5个亚类;其中49个Hox基因不均匀的分布在5条染色体上,并分为7个基因连锁群（HoxAa、HoxAb、HoxBa、HoxBb、HoxCa、HoxCb和HoxDa）;表达模式分析结果表明,团头鲂Hox基因家族成员具有不同的表达模式;团头鲂和斑马鱼所有Hox基因在肌肉中的表达水平存在显著差异。此外,团头鲂不同发育阶段及不同组织转录组结果显示,HoxA基因群集中,HoxA2a、HoxA3a在幼鱼阶段高表达,其他基因在肌肉、肌间刺及结缔组织中表达量低甚至不表达;HoxB基因群集中,HoxB9a、HoxB3a、HoxB8a、HoxB1b、HoxB5a、HoxB5b在幼鱼阶段高表达;HoxB7a、HoxB10a、HoxB9a在成鱼肌肉、结缔组织及肌间刺中高表达;HoxC基因群集中,HoxC3a、HoxC4a在幼鱼阶段高表达,HoxC3a、HoxC8a在成鱼的3个组织都有表达;HoxD基因群集中,HoxD9a、HoxD10a和HoxD11a在胚胎S2期表达量较高。研究表明,Hox基因在团头鲂早期胚胎时期和肌间刺的形成中有表达,提示团头鲂肌间刺的形成可能受Hox基因家族调控。     

团头鲂Toll样受体Ⅱ基因的克隆与表达分析

为了研究团头鲂(Megalobrama amblycephala)TLR2(ma TLR2)在抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染中的作用,本实验克隆了ma TLR2基因的c DNA全长。结果显示:ma TLR2基因c DNA的全长包括2923 bp,编码792个氨基酸。预测得到的ma TLR2的结构域包括一个信号肽、氨基端的亮氨酸重复基序(LRRs)、跨膜结构域(TM)和一个胞内的Toll/白介素(IL)-1受体区(TIR)。在嗜水气单胞菌感染后,团头鲂头肾中,TLR2的表达量在6 h时显著升高。TLR2下游相关的炎症细胞因子TNF-α的表达量也显著上调。结果表明ma TLR2在嗜水气单胞菌感染团头鲂后的免疫应答中起到了重要作用。     

克氏原螯虾卵黄蛋白原受体cDNA部分序列的克隆及mRNA表达量的相对定量

从成熟的克氏原螯虾卵巢中提取总RNA,通过同源克隆得到了卵黄蛋白原受体c DNA部分序列,长度为506 bp,在NCBI网站上进行比对后发现,其与斑节对虾、短沟对虾、罗氏沼虾的卵黄蛋白原受体(Vg R)c DNA序列有较高的相似性。采用实时荧光定量PCR方法,测定了卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺两个组织中卵黄蛋白原受体m RNA的相对表达水平。结果显示,卵巢是卵黄蛋白原受体基因表达的主要部位,而肝胰腺只能检测到少量表达,卵黄蛋白原受体基因在卵巢的卵原细胞增殖期相对表达量最高,随后下降,成熟期达到最低值,恢复期开始回升。结合卵巢不同发育阶段卵巢质量的变化计算表达总量,结果发现,卵黄蛋白原受体基因的表达总量在卵原细胞增殖期为最低,随后持续升高并至成熟期达到峰值,恢复期急剧下降,但仍略高于卵原细胞增殖期的表达量。此外,运用所构建的系统进化树比较了克氏原螯虾Vg R m RNA与其他物种间的遗传距离。