福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）CHUP1基因克隆及其生物信息学分析

CHUP1(chloroplast unusual positioning 1)参与了叶绿体移动信号转导过程,对植物避免光伤害及提高光合效率方面具有重要作用,并且与植物抗寒性有密切关系.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,分离出CHUP1基因cDNA和DNA序列,GenBank登录号分别为JX123753、JX880084,命名为Mu-CHUP1.Mu-CHUP1 cDNA全长3232 bp,ORF 2931 bp,编码976个氨基酸.福州宦溪野生蕉Mu-CHUP1 cDNA序列与小果野蕉(M.acuminata,AA Group)全基因组测序中的CHUP1 cDNA序列的相似性为84.71％;福州宦溪野生蕉Mu-CHUP10RF的DNA序列含8个内含子、9个外显子,而小果野蕉全基因组测序中的CHUP1基因组DNA序列则有11个内含子、12个外显子,两者相差较大.生物信息学预测分析表明,Mu-CHUP1磷酸化位点多达62个,并且含有3个保守结构域,可能与其行使多样性的功能有关.     

香蕉叶片颗粒结合性淀粉合成酶Ⅰ和可溶性淀粉合成酶Ⅲ基因的克隆与序列分析

以香蕉栽培品种“天宝蕉”（Musa spp. cv. Tianbao）的叶片为材料,采用同源克隆法结合RT-PCR和RACE法,首次从香蕉中获得颗粒结合性淀粉合成酶Ⅰ（Granule-Bound Starch SynthaseⅠ, GBSSⅠ）基因的cDNA全长片段和可溶性淀粉合成酶Ⅲ（Soluble Starch Synthase Ⅲ, SSⅢ）基因的ORF, 并分别对其核酸序列及其推导的氨基酸序列进行了生物信息学分析。香蕉叶片GBSSⅠ基因全长2 277 bp, 编码616个氨基酸; SSⅢ基因ORF长3 009 bp, 编码1 054个氨基酸。 GBSSⅠ和SSⅢ的克隆为从分子生物学水平上研究香蕉叶片中参与淀粉合成的关键酶的表达与调控奠定重要基础。     

福州旗山野生蕉(Musa spp.,AB Group)试管苗Mn-SOD基因克隆及生物信息学分析

以旗山野生蕉(Musa spp.,AB group)试管苗幼嫩叶片为材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得野生蕉试管苗Mn-SOD基因c DNA序列。结果表明:旗山野生蕉Mn-SOD的c DNA全长序列共831 bp,其中5′UTR为137 bp,3′UTR为151 bp,3′端含有17个poly(A)尾。开放阅读框(ORF)共有543个碱基组成,编码181个氨基酸。蛋白理化性质预测结果显示:Mn-SOD蛋白分子量为20 108.8 u,等电点7.92,属于碱性蛋白。     

三明野生蕉β-1,3-葡聚糖酶Mugsp7基因克隆及其在低温处理下的表达分析

以三明野生蕉组培苗为材料,通过RT-PCR技术克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因Mugsp7（β-1,3-glucanase）的 cDNA 和 gDNA 序列,并对该基因进行生物信息学分析和不同低温下的实时荧光定量PCR表达分析,并进一步测定8 ℃处理1、2、3、4和5 d后三明野生蕉叶片β-1,3-葡聚糖酶活性。结果表明：Mugsp7的 gDNA 长 1132 bp,开放阅读框（ORF）长984 bp,具有一个148 bp的内含子,共编码 327 个氨基酸。cDNA、gDNA 的登录号分别为 KU363808和KU363809。生物信息学分析表明,Mugsp7 属于酸性、亲水、稳定性蛋白,不具有信号肽,与小果野蕉、大叶藻、玉米、大麦、水稻等位于同一分支,与小果野蕉亲缘关系较近分为一类。实时荧光定量PCR表明,不同低温处理和8 ℃低温不同时间处理下,Mugsp7 呈现不同表达模式,且三明野生蕉叶片β-1,3-葡聚糖酶活性的测定分析也进一步表明,Mugsp7 能进一步响应低温胁迫。因此,推测 Mugsp7 在三明野生蕉抗寒响应中发挥重要作用。     

福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）2个PSAG成员的克隆及生物信息学分析

植物光系统Ⅰ反应中心亚基V (photosystem Ⅰ reaction center subunit V,简称PSAG或PS Ⅰ-G)是光合系统Ⅰ的主要组件.具有维持PSⅠ复合体稳定性的重要作用,并与抗盐密切相关.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,首次分离到PSAG基因的2个成员:PSAG1、PSAG2(GenBank登录号分别为JX317082、JX317083),分别为800、827 bp,分别编码150、160个氨基酸;PSAG1、PSAG2的基因组序列分析表明2个成员均没有内含子.生物信息学分析表明:PSAG1、PSAG2具有PSⅠ的X亚基超家族(photosystem Ⅰ reaction center subunitX psaK)保守结构域,是不具有信号肽的跨膜蛋白,具有亲水性:PSAG1、PSAG2均有4个位点发生磷酸化.宦溪野生蕉PSAG在进化过程中形成了特殊的结构特征,即PSAG1和PSAG2没有内含子,并且在不同物种间保守区具有高度的一致性,为保持PSAG功能的稳定性提供了重要保证.     

菠萝NAC转录因子基因AcoNAC1生物信息学及表达分析

NAC转录因子作为植物中数量最大的转录因子家族之一,在植物生长发育及各种逆境胁迫中发挥非常重要的调控作用。本研究以菠萝为试验材料,采用RT-PCR技术克隆得到基因AcoNAC1（GenBank登录号：XM_020225830）,对其进行生物信息学及表达分析。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列全长1723 bp,ORF为1062 bp,编码353个氨基酸,相对分子量为38.34 kDa,理论等电点为8.88;其编码蛋白的二级结构由20.40%的α-螺旋（H）和15.30%的β-折叠（E）以及59.21%的无规则卷曲（C）组成,具有NAC典型结构保守域。基因表达分析表明,AcoNAC1基因的表达受低温和干旱胁迫诱导,低温胁迫24 h和干旱胁迫12 h时的表达量最高;在不同成熟期品种中表现出持续的诱导表达,但诱导强度逐渐下降,其中早熟品种谢花后20~50 d及晚熟品种谢花后20~60 d基因表达量均处于较高水平。因此,推测AcoNAC1基因可能参与菠萝逆境胁迫响应以及果实发育与成熟的调控。     

三明野生蕉Whirly转录因子的克隆及其在低温胁迫下的定量表达分析

以三明野生蕉叶片为材料,通过克隆获得Whirly基因的ORF,并研究Whirly基因在不同温度处理下的转录水平。结果表明:采用PT-PCR结合RACE技术,克隆得到三明野生蕉Whirly基因,其在GenBank的登录号为KC127691。Whirly的开放阅读框为738 bp,编码245个氨基酸。生物信息学分析显示,Whirly蛋白属于亲水蛋白,不具有信号肽,二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成,保守结构域预测显示该基因属于植物Whirly转录因子基因家族。实时荧光定量PCR分析显示,Whirly转录因子在不同低温胁迫下表达水平有较大差异,随着温度的降低,相对表达量呈"M"型变化模式,在20℃和4℃时达到较高的转录水平,结合前人研究结果可知,三明野生蕉Whirly转录因子可能参与了包括抗寒等多个抗逆途径的调控。     

Cloning and Sequence Analysis of GBSS Ⅰ and SSⅢ from the Leaves in Musa spp.

以香蕉栽培品种“天宝蕉”(Musa spp.cv.Tianbao)的叶片为材料,采用同源克隆法结合RT-PCR和RACE法,首次从香蕉中获得颗粒结合性淀粉合成酶Ⅰ (Granule-Bound Starch SynthaseⅠ,GBSS Ⅰ)基因的cDNA全长片段和可溶性淀粉合成酶Ⅲ(Soluble Starch SynthaseⅢ,SSⅢ)基因的ORF,并分别对其核酸序列及其推导的氨基酸序列进行了生物信息学分析.香蕉叶片GBSS Ⅰ基因全长2 277 bp,编码616个氨基酸；SSⅢ基因ORF长3009bp,编码1 054个氨基酸.GBSSⅠ和SSⅢ的克隆为从分子生物学水平上研究香蕉叶片中参与淀粉合成的关键酶的表达与调控奠定重要基础.     

卡特兰ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表达分析

以卡特兰紫色花品种‘粉女郎’（Cattleya hybrid‘Pink Lady’）为材料,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中分离得到了一个查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）和一个二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase, DFR）同源基因的cDNA全长,分别命名为ChCHS1和ChDFR1,GenBank登录号分别为KP171693和KP171694。序列分析结果发现：ChCHS1的cDNA全长1 508 bp ,编码394个氨基酸;ChDFR1基因的cDNA全长1 250 bp,编码350个氨基酸。同源性检索和生物信息学分析表明,这2个基因编码的蛋白都具有各自的功能位点和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比对与系统进化树分析显示,ChCHS1、ChDFR1基因在兰科中与蕙兰、石斛兰关系最近,与百合科关系较近。相对实时荧光定量PCR结果表明,ChCHS1 和ChDFR1都在蕾期表达量最低,伴随花朵的开放,表达量逐渐上升,最终分别在花朵盛开期和接近开放时达到最高。     

天宝野生蕉植物学特性观测

初步观测福建省漳州天宝野生蕉（Musa spp.）的分布及其植物学特征,为开发利用该资源提供依据。     

香蕉MaSULTR3家族成员的全基因组鉴定与不同温度下表达模式分析

利用生物信息学分析法对香蕉MaSULTR3基因家族成员进行全基因组鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、启动子顺式作用元件分析以及低温胁迫下叶片转录组的FPKM值分析;其后,利用基因组数据结合RT-PCR方法克隆了‘天宝蕉’（Musa spp., AAA Group）组培苗MaSULTR3.1-2基因的ORF序列;最后,利用qPCR技术分析了该基因在低温胁迫下的表达模式。结果表明,香蕉MaSULTR3家族有12个成员;MaSULTR3启动子区域含有光响应、激素响应、低温、干旱等逆境胁迫相关的响应元件;分子进化树分析表明MaSULTR3家族成员可分为4类：Class Ⅰ包含2个MaSULTR3成员（MaSULTR3.3-2、MaSULTR3.3-1）,与单子叶植物香蕉和水稻的SULTR3.3聚在一起;Class Ⅱ包含3个MaSULTR3成员（MaSULTR3.4-2、MaSULTR3.4-1的2个不同转录本）,与大部分物种的SULTR3.4和拟南芥的SULTR3.3/4聚在一起;Class Ⅲ包含4个MaSULTR3成员（MaSULTR3.1-6、MaSULTR3.1-2、MaSULTR3.5-1、MaSULTR3.5-2）,与香蕉和水稻的SULTR3.5聚在一起;Class Ⅳ包含4个MaSULTR3成员（MaSULTR3.1-4、MaSULTR3.1-3、MaSULTR3.1-5、MaSULTR3.1-1）,拟南芥、水稻和香蕉的SULTR3.1/2聚在一起。不同温度下叶片转录组的FPKM值分析表明：MaSULTR3在低温下整体呈上调趋势,在13 ℃处理下表达量最高,且MaSULTR3不同成员在应对低温胁迫下有不同的分工。天宝蕉MaSULTR3.1-2基因的ORF序列包含1959 bp的完整开放阅读框,编码652个氨基酸残基,属于SULTR3基因家族,不含信号肽,具有双向跨膜,为疏水性蛋白,PI为8.55,含有55个蛋白磷酸化位点,三级结构中α-螺旋和无规则卷曲占比较大。亚细胞定位预测结果显示MaSULTR3.1-2可能定位于细胞质。qRT-PCR结果显示,‘天宝蕉’MaSULTR3.1-2基因在所有检测组织部位均有表达,其中在叶片的表达量最高,并且在叶片表达量为随温度下降,表达量先下降后上升,在28 ℃表达量最高。本研究结果表明MaSULTR3.1-2基因可能参与低温胁迫下香蕉的抗寒响应。     

菠萝MYB基因AcoMYB1的克隆与表达分析

根据菠萝转录组的测序结果克隆到1个MYB转录因子基因,命名为AcoMYB1,GenBank登录号为XM_020230319。该基因cDNA全长1221 bp,开放阅读框（ORF）为747 bp,编码一个含有248个氨基酸的蛋白。序列分析表明,AcoMYB1氨基酸序列N端具有2个保守的SANT结构域,属于R2R3类MYB转录因子。生物信息学分析表明,AcoMYB1是不稳定的亲水蛋白,不具有跨膜结构和信号肽,可能定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。实时荧光定量PCR分析表明,AcoMYB1在菠萝干旱、低温逆境胁迫处理下受诱导表达,整体上表现出“先升后降”的趋势;在早熟品种和晚熟品种的果实发育过程中也被诱导表达,表现为“升-降-升”的趋势,特别是在果实发育早期和果实成熟后期受诱导表达的强度较为突出。由此推测AcoMYB1作为正调控因子参与菠萝冷害、干旱逆境胁迫的响应过程,并在菠萝果实早期发育及后期成熟发挥调控作用。     

香蕉MaPIP2-2基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

水通道蛋白（AQPs）是细胞间和细胞内水分运输的主要通道, 对于植物细胞的水分稳态和胁迫响应具有重要作用。本研究从香蕉中克隆了一个水通道蛋白基因MaPIP2-2。序列分析结果表明,该基因的开放阅读框（ORF）为846 bp,编码281个氨基酸。多序列比对和进化树分析结果表明,该基因编码的蛋白与其它植物中水通道蛋白具有较高的一致性,并且与拟南芥AtPIP2-2和AtPIP2-3的亲缘关系最近。亚细胞定位表明该基因定位在细胞膜上。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因能够在转录水平响应甘露醇、低温、NaCl胁迫和ABA信号。这些结果表明MaPIP2-2可能参与了非生物逆境胁迫应答,为进一步研究MaPIP2-2基因的功能鉴定了基础。     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

龙眼GPX基因的克隆、原核表达及其在体胚发生过程中的表达分析

采用RT-PCR 与RACE相结合的方法,从龙眼胚性愈伤组织中克隆了长947 bp含有完整开放阅读框的龙眼DlGPX cDNA序列（GenBank登录号为EU364813）和长度为1 736 bp的DNA序列（GenBank登录号为EU680970）。其编码1个含有168个氨基酸的蛋白质。DlGPX基因中含有5个内含子,均符合真核生物内含子通用的GT-AG 法则。生物信息学分析显示：该蛋白为亲水的酸性蛋白质,定位于叶绿体;与其他植物的GPX有较高的同源性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了１个分子量约为23 ku的蛋白。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术研究该基因在龙眼体胚发生发育过程中的表达情况,结果显示,从松散型胚性愈伤组织到不完全胚性紧实球形结构阶段,DlGPX mRNA的转录水平逐渐升高,在胚性紧实球形结构阶段降到最低水平,子叶形胚阶段又上升到与不完全胚性紧实球形结构阶段相当的水平。     

茶树CsSnRK2.1、CsSnRK2.2基因的克隆及在非生物胁迫中的响应

蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRK）是一类广泛存在于植物体内的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,其中SnRK2家族在植物非生物胁迫响应过程中起着十分重要的作用。为了探究茶树SnRK2家族基因响应逆境的分子机制,本研究克隆了两个茶树SnRK2家族基因,并分别命名为CsSnRK2.1（GenBank登录号：MG026837）和CsSnRK2.2（GenBank登录号：MF662805）,生物信息学分析表明CsSnRK2.1和CsSnRK2.2分别编码358个和337个氨基酸,与拟南芥和玉米SnRK2蛋白激酶的同源性很高,均具有保守的ATP结合位点和Ser/Thr激酶活性结构域。在高盐、干旱和ABA胁迫下,CsSnRK2.1均能被诱导表达,且呈现先升后降趋势,而在低温和高温胁迫下表达量变化不大;CsSnRK2.2能强烈响应高盐胁迫,也能被高温诱导上调表达;表明它们可能与茶树抗逆密切相关。     

橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1（GenBank登录号：KC333454）。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。     

龙眼胚性愈伤组织DlHOS1基因克隆与表达分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR和RACE-PCR技术对植物抗寒重要调控因子HOS1(DlHOS1)进行克隆,并进行密码子使用偏爱性、生物信息学和低温胁迫下表达等方面的分析。结果表明:DlHOS1基因序列全长3 577 bp,包含ORF 3 000 bp,编码999个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别162 bp和415 bp(GenBank登录号:KY990404);密码子使用偏爱性分析表明,DlHOS1密码子的选择偏爱性较弱,偏爱以A/T结尾;生物信息学分析结果表明,DlHOS1编码的蛋白属于不稳定的疏水性跨膜蛋白,不含信号肽,定位于细胞质和细胞核,二级结构富含α螺旋,与柑橘的亲缘关系较近;qPCR结果发现,DlHOS1能够响应低温胁迫诱导,总体上低温下其表达水平上升。研究结果认为,DlHOS1参与龙眼抗寒和低温胁迫过程。      

橡胶树HbRAN1基因的克隆与表达分析

利用本课题组获得的二代测序(FLX454)转录组数据库,筛选并克隆获得到1条969 bp的核苷酸序列,该序列编码1个由221个氨基酸组成的25.11 ku蛋白,氨基酸同源性分析发现,此氨基酸序列具有GTPase活性区域,属于小G蛋白RAN亚家族,且与蓖麻、烟草、水稻、小麦等的RA N1基因序列高度同源,命名为HbRA N1(GenBank登录号:KC577150).实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因受割胶、伤害、高温、低温、干旱及乙烯利等因素调控,同时其表达模式与橡胶树死皮程度相关,但对SA、GA、JA、ABA、CTK、2,4-D等激素处理应答不明显.结果表明,HbRA N1基因编码1个典型的RAN蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因.     

文心兰生物钟相关基因 PRR7 克隆与表达分析

利用转录组文库中的 PRR7 基因序列,从文心兰盛开期花瓣中扩增得到文心兰 PRR7 基因的 2 个成员,分别命名为 OnPRR7-1（GenBank 登录号：MG543993）和 OnPRR7-2（GenBank 登录号：MG543994）。OnPRR7-1和 OnPRR7-2 基因全长分别为 2 091 bp 和 2 154 bp,分别编码 696 和 717 个氨基酸大小的蛋白质序列。蛋白质二级结构分析表明,OnPRR7-1 和 OnPRR7-2 均为疏水性蛋白。BlastX 比对和系统发育分析表明,OnPRR7-1 和OnPRR7-2 基因和铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的 PRR 基因同源性比较高。实时荧光定量 PCR 分析结果表明,OnPRR7-1和 OnPRR7-2 基因均呈现昼夜节律性表达格式,并且在正午 12 点时表达量达到峰值;在花发育和衰老过程中,OnPRR7-1 和 OnPRR7-2 基因在花瓣中的表达量均在绽口期和衰老初期达到峰值,表明其有可能在花发育的开花和花衰老的过程中发挥作用。