花生果种皮特异表达基因AhPSG13的克隆和表达研究

为了克隆在花生果种皮中特异表达的基因,本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出一个277bp的EST序列并进行研究,通过构建花生果皮全长cDNA文库,获得此目的基因G13的全长为1369bp,开放阅读框从第28个碱基始至1122个碱基止,预测分子量为39865.59,等电点5.73。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有4个跨膜结构域和多个活性位点,可能与细胞内DNA转录有关;该蛋白与多种豆科作物的半胱氨酸蛋白酶具有较高同源性,推测为花生半胱氨酸蛋白酶相关基因;RT-PCR研究该基因表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,于30d果皮中表达量最大。本研究克隆的AhPSG13基因序列已经登陆到GenBank,登录号为FJ475061。     

应用抑制消减杂交技术 构建花生果皮差异表达文库

为构建花生果皮差异表达基因消减文库，分离花生果皮差异表达cDNA片段，本研究采用抑制消减杂交技术，以花生种仁cDNA为Driver，果皮cDNA为Tester，进行两次消减杂交和两次抑制性PCR，将第二次PCR产物与pGEM-T easy 载体相连，电击转化大肠杆菌，成功构建果皮差异表达cDNA文库。所长出菌落中89.2%为白色克隆。采用PCR法对重组子进行鉴定，发现其中单一扩增条带的克隆约占83.5%， 片段大小集中分布于250～750bp之间。     

块根特异启动的木薯SBE Ⅰ、SBE Ⅱ基因RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

块根特异启动的木薯SBE I、SBE Ⅱ基因 RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

花生PEPC基因反义表达载体构建及对花生的遗传转化

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是控制花生蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶.本研究利用PCR方法扩增出了PEPC基因片段,并将其克隆到pMD18-T Simple载体,序列分析表明克隆片段的长度为728bp.将该PEPC基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S双元表达载体,构建了带PEPC反义基因的双元载体并进行花生的转化,目前已获得转基因植株,收获T1代种子.     

花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA,应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段,分别命名为FAD2-1和FAD2-2,将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连,在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因,进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,酶切鉴定后进行测序,结果表明,所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列,FAD2-2的长度为593bps,与引用序列的同源性达到97%,包含一个起始密码子;FAD2-1的长度为1175bp,与引用序列的同源性达到99%,包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

花生种皮抗黄曲霉相关基因PnLOX2的表达分析

以高抗黄曲霉品种J11和高感品种金花1012黄曲霉处理的三个不同时期为材料,利用荧光定量PCR对种皮PnLOX2基因进行相对定量.结果表明:Real time PCR作为一种简单有效的定量方法,可快速检测待测基因的表达量差异;高抗黄曲霉品种J11在黄曲霉侵染过程中PnLOX2基因表达量变化显著,而金花1012的表达量变化较小,表明PnLOX2基因在花生种皮中存在并且可能与抗黄曲霉相关.     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA，应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段，分另4命名为FAD2-1和FA192-2，将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连，在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因，进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中，酶切鉴定后进行测序，结果表明，所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列，FAD2-2的长度为593bps，与引用序列的同源性达到97％，包含一个起始密码子；FAD2—1的长度为1175bp，与引用序列的同源性达到99％，包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

抗黄曲霉毒素单链抗体在毕赤酵母X-33中的表达

为降低黄曲霉毒素单链抗体制备成本,提高单链抗体表达活性,利用获得的含抗黄曲霉毒素scFv基因的重组质粒pCANTAB 5E-scFv1A7,克隆出了scFv基因片段,并构建了酵母表达载体pPICZαA-scFv1A7,利用SacⅠ酶将重组载体线性化后插入到毕赤酵母X-33染色体基因组中,构建了pPICZαA-scFv1A7 X-33重组酵母,用0.8%甲醇诱导其分泌表达成功。间接竞争ELISA方法检测到该scFv对黄曲霉毒素B1的抑制率(IC50)值为4.5ng/m L,表明重组酵母表达产物scFv具有很好的抗原结合活性,可用于黄曲霉毒素的检测。     

花生iso-ARah3基因克隆及多克隆抗体制备

类花生致敏原3(iso-ARah3)是花生致敏原3的同系物,其表达活性与干旱及黄曲霉侵染相关。本研究通过RT-PCR技术从花生种子cDNA文库中克隆获得iso-ARah3的开放阅读框(ORF),全长1533bp,编码510个氨基酸,N端预测有20个氨基酸的信号肽序列。通过序列比对发现,该克隆序列有1处缺失突变,其N端210个氨基酸序列与胰蛋白酶抑制因子的同源性较高,达83.60%。通过构建原核表达载体pET28a-isoARah3,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,融合蛋白His-isoARah3获得高效表达,分子量约54kD。His-isoARah3经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的iso-ARah3多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比(1∶512000)很好的抗体。通过对融合蛋白的诱导前和纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示仅在纯化样品相应位置(54kD)有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性。本研究结果为深入研究花生iso-ARah3基因的功能奠定了基础。     

拟南芥防御素基因PDF1.2启动子与GUS重组载体的构建与转化

PDF1.2基因在植物的防御系统中扮演着重要的角色,其编码产生的植物防御素参与了植物对真菌入侵、病毒感染、不良环境等逆境胁迫的防御反应。试验利用从拟南芥中通过PCR扩增和克隆的该基因启动子构建GUS报告基因的表达载体,通过根癌农杆菌浸渍转化法将表达报告基因转入拟南芥中,筛选获得了转化植株。获得以下主要结果:(1)成功克隆了拟南芥PDF1.2基因的启动子并将其与带GUS标记基因的载体进行了融合,得到了重组的融合载体;(2)成功的将带GUS标记基因的拟南芥PDF1.2基因启动子融合载体转入到拟南芥植株中并利用其自带抗性标记筛选到了抗性植株;(3)利用GUS染色技术检测了转基因植株中PDF1.2基因启动子的表达情况。     

花生MAPK13基因的克隆及表达分析研究

为了挖掘花生抗果腐病相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,从花生果腐病转录组文库中筛选出促丝裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)基因编码区序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMAPK 13基因°结果表明AhMAPK 13基因序列全长1818 bp,含有/非编码区593 bp,5非编码区122 bp,开放阅读框全长1104 bp,编码1条含有368个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为42. 5kDa,含有MAPK家族典型的11个结构域,属于MAPK基因家族B组成员。亚细胞定位显示AhMAPK13定位于细胞质和细胞核中° RT-qPCR分析发现AhMAPK 13基因在茎中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMAPK 13基因受干旱、低温、NaCl(ABA诱导时表达量上升,说明该基因可能广泛参与植物非生物胁迫响应过程;AhMAPK 13基因受JA、GA、ET、SA诱导时表达量上调,说明该基因可能参与到这些激素介导的抗逆信号转导途径。本研究结果为花生抗果腐病育种研究提供了新的基因资源。     

亚麻AtCesA1基因过表达载体的构建

为开展纤维素合成酶基因导入亚麻的基因工程研究,以拟南芥为材料克隆了纤维素合成酶基因AtCesA1,序列长为3912 bp,其中编码区在277~3523碱基之间,共3246 bp,推测其编码了1082个氨基酸。通过同义突变将全长基因克隆到植物表达载体pBI1301中,构建出植物表达载体pCAMBIA1301-AtCesA1,经酶切和PCR鉴定确认目的基因已经正确地插入到载体上,为下一步AtCesA1遗传转化亚麻功能研究打下了基础。     

香蕉NPR1基因的克隆及植物表达载体构建

病程相关基因非表达子(NPR1)是植物抗病信号传导的关键基因。以香蕉抗病香蕉品种为材料,根据NPR1基因序列在保守区设计引物,从香蕉cDNA中克隆获得NPR1基因片段,以RACE的方法克隆获得香蕉NPR1基因的全长,并命名为GCT119-NPR1。香蕉GCT119-NPR1基因最大阅读框(ORF)为1 707 bp。生物信息学分析结果表明,该基因含有ANK和BTB两个结构域,其中ANK结构域是NPR1基因中非常重要的结构域,在蛋白质相互作用中起着至关重要的作用。同源性分析表明,该基因与已克隆发表的NPR1基因氨基酸序列同源性为67%~82%。将其构建植物表达载体,为下一步转化工作奠定基础。     

大豆GmNCED1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84%以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

大豆Glyma.18G261700基因生物学分析及功能初探

MYB是参与花青素合成的重要调控基因，数量众多且功能多样。为分析大豆中与花生黑色种皮调控基因AhTc1(MYB家族)同源基因的功能，本研究根据AhTc1基因序列信息，同源克隆大豆MYB家族基因Glyma.18G261700,对其进行生物信息学分析，并检测不同种皮颜色大豆苗期不同部位花青素和基因表达量。结果显示：Glyma.18G261700全长1 572 bp,编码189个氨基酸，属于R2R3型MYB。AhTc1编码的蛋白为疏水性蛋白，而Glyma.18G261700与之不同，编码的蛋白为亲水性蛋白。三级结构中Glyma.18G261700与AhTc1尾部有所区别，在调控种皮颜色中可能具有不同功能。不同种皮颜色大豆幼苗根部花青素含量较低，而Glyma.18G261700基因的表达量较高，表明在大豆幼苗期该基因的大量表达可能抑制根部花青素的合成，但对种皮颜色的调控还需进一步探索。     

花生AhMAPK14基因的克隆及表达分析研究

环境胁迫严重影响花生的产量和品质.筛选并研究花生中胁迫响应相关基因,对深入解析花生响应胁迫的分子机理具有重要意义.本研究从花生果腐病转录组文库中筛选并克隆得到花生基因AhMAPK14,对其进行了生物信息学分析及亚细胞定位,并利用qRT-PCR技术分析了其组织表达特异性及在不同处理下的表达模式.结果表明,AhMAPK14...     

无机焦磷酸化酶基因的克隆与植物表达载体的构建

提取面包酵母基因组DNA,用无机焦磷酸化酶(PPase)基因特异引物通过PCR扩增出864bp的片段,并将该片段克隆至pMD18-T上。序列分析结果表明,该克隆序列与GeneBank上的PPase基因序列同源性达到100%。进一步将叶肉细胞特异性启动子rbcS和PPase基因克隆至植物表达载体pCBI上,构建了由rbcS启动子调控的PPase基因植物表达载体pCBIPR。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,为农杆菌介导的PPase基因对植物的遗传转化奠定基础。     

青稞F7-OMT基因的克隆及原核表达分析

类黄酮7-O-甲基转移酶(F7-OMT)具有甲基转移酶功能,能催化底物类黄酮甲基化产生植物抗毒素,提高植物的抗菌性。为了给进一步研究该酶蛋白的功能奠定基础,以青稞"94-19-1"为材料,采用同源克隆方法得到青稞F7-OMT基因编码片段。生物信息学分析表明,青稞F7-OMT开放阅读框(ORF)全长为1173bp,编码390个氨基酸,蛋白分子质量为42 207.8Da,等电点pI为5.36,无信号肽序列,具有甲基转移酶2(Methyltransf_2,pfam00891)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域。通过亚克隆将F7-OMT连接到表达载体pET-32a上,构建pET-32a-F7-OMT融合表达载体,在E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达,并采用亲和层析纯化法得到纯化蛋白。     

光叶花生两个重要基因片段的克隆和序列测定

从不亲和野生花生Arachis glabrata Benth中提取DNA，在多重序列比对的基础上设计PCR引物，成功扩增出约350、750bp的两个片段，与DES和RS基因片段预期分子量相符。PCR产物与T栽体连接，转化受体菌XL1-Blue，获得了白色菌落，挑取白色菌落在液体培养基中过夜培养，经TTE溶液和热处理后进行PCR扩增，获得了载有目的基因片段的阳性重组子，测序和序列比对分子的结果说明，DES和RS基因片段克隆成功。这是首次从不亲和野生花生A.glabrata Benth中克隆出的基因片段，该片段可用作探针克隆相关基因全编码区。