小麦BAC shotgun测序文库的构建

为给小麦基因组中某一基因区域的测序与分析奠定基础,以小麦7B和7D染色体上的10个BAC克隆为材料,运用Large-Construct Kit和TOPO TA cloning kit两个商品化的试剂盒及HydroShearDNA剪切仪建立了BAC shotgun文库构建的技术体系,即利用该体系可以获得高纯度的BAC 20-50μg以及DNA 3-5 kb的目标小片段,5-20 min即可完成连接,一次转化可获得2000个重组克隆。利用这一方法,现已构建了10个小麦BAC shotgun文库,这些文库可为小麦基因组特定区段的研究奠定基础。     

小麦UROS基因的可变剪接

可变剪接是一种重要的基因表达调控机制,对植物的发育、生理、代谢、信号转导以及外界逆境的响应等多个过程都有调控。为进一步探讨小麦基因的可变剪接机制以及深入研究小麦UROS基因的功能,以返白系、矮变1号和中国春三个普通六倍体小麦品种为材料,克隆了尿卟啉原Ⅲ合成酶基因(UROS)的gDNA和cDNA序列,并利用生物信息学技术研究了小麦叶片中UROS基因的可变剪接方式。结果表明,根据在线小麦基因组数据库,将克隆到的UROS基因组DNA序列分别定位在4BL和4DL两个基因位点,命名为UROS-4B和UROS-4D。从三个品种中克隆得到大约50个不同的UROS基因cDNA序列,通过在线预测和与基因组序列比对,发现UROS基因存在可变剪接,并鉴定出两个UROS基因位点各有一个标准剪接转录本和两个非标准剪接转录本。可变剪接方式以内含子保留为主,还有可变的供体剪接位点和可变的受体剪接位点,品种间的剪接方式不完全相同。由不同转录本预测编码的多肽氨基酸序列也存在差异,两个基因位点选取的六个转录本所编码的多肽有12个氨基酸位点的变异。     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数.PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPC cDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株.初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料.     

小麦Mlo基因的克隆及白粉病菌诱导下的表达模式分析

为了研究Mlo基因在感、抗小麦品种中的表达情况,根据小麦基因芯片的Mlo探针序列,利用电子克隆与RT-PCR方法在感病小麦品种豫麦13和抗病品种红蚰麦中分别克隆到Mlo基因的同源序列。两条核苷酸序列全长均为1 605 bp,都含有一个完整的ORF(Open reading frame)。核苷酸序列分析显示二者的DNA序列只有一个核苷酸的差异,与大麦Mlo的相似性均为90%。编码的氨基酸序列包含有7个跨膜结构域,前18个氨基酸是信号肽序列,第414~435位是编码蛋白的活性中心,第451、459、462、475、483位点上有糖基化位点,细胞定位分析将其定位在膜上。从头建模分析构建的二者三维结构有明显差异。利用定量PCR对该基因在白粉菌诱导早期的表达模式进行分析,结果两基因的表达都受白粉菌的诱导,但在红蚰麦中的表达高峰出现在18 h,豫麦13中的表达高峰出现在72 h,表达时间的差异可能决定了两者对白粉菌的不同抗性反应。     

石麦15细菌人工染色体文库构建与鉴定

为给小麦功能基因研究提供参考信息,以冬小麦栽培品种石麦15(Triticum aestivum L.)为试材,从暗培养7~10d的黄化幼苗地上部提取高分子量基因组DNA,使用载体pCC1BAC的HindⅢ位点构建了六倍体小麦细菌人工染色体文库。该文库由1 000 000个以上克隆组成,保存在1 020个混合池中,克隆插入片段平均大小为85kb,空载率为2.5%;覆盖小麦基因组5倍以上;挑取7个克隆培养5d后,经HindⅢ完全酶切检测,其指纹图谱稳定一致。石麦15细菌人工染色体文库的构建为小麦基因克隆、调控序列克隆以及比较基因组学研究奠定了基础。     

黑麦在小麦改良中的应用研究进展

黑麦属(Secale cereale)是小麦的近缘植物,是改良小麦抗病性、品质和产量等性状的重要外源基因供体,通过染色体工程方法结合常规育种可以将黑麦基因导入小麦,丰富小麦的遗传变异。为了了解目前黑麦在小麦育种中应用的现状,总结论述了黑麦基因向小麦转移的不同方式、黑麦遗传物质的鉴定方法,并对黑麦在小麦育种中的应用前景进行了展望．以期促进黑麦有益基因向小麦的转移,进一步扩大黑麦优良基因在小麦育种和生产中的利用价值。     

小麦基因转化研究进展

为了给小麦遗传转化研究提供参考,总结和分析了小麦基因转化的最新研究进展,并针对存在的主要问题提出了今后的研究方向.目前在小麦表达载体构建中普遍采用Ubi和在35S基础上改造而来的启动子序列,使用的报告基因主要有gus、uidA、gfp和Cl/LC等,选择基因主要有bar、nptⅡ、manA(pmi)、Cah、gst27、mopat、popat、CP4和GOX,筛选剂一般选用Bialaphos、Glufosinate、G418和Glyphosate等.小麦基因转化的主要受体为幼胚及其愈伤组织,转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法和农杆菌介导法.受体类型、表达载体序列组成和基因转化方法是影响小麦基因转化效率的主要因素.     

小麦SGT1基因的克隆与表达特性分析

为了研究SGT1基因在不同小麦抗病反应中的表达特性,采用RT-PCR和RACE方法,从小麦cDNA中分离出包含SGT1基因全长cDNA序列.该基因编码具有377个氨基酸的蛋白,具有已知SGT1蛋白典型的5个功能域,即TPR区、VR1区、CS区、VR2区和SGS区.小麦SGT1蛋白与大麦SGT1蛋白的氨基酸序列具有97%的相似性.Southern杂交结果显示,SGT1基因在小麦基因组中有3个拷贝.分析结果表明,大麦黄矮病毒、白粉病菌、纹枯病菌和赤霉病菌侵染小麦均可诱导小麦SGT1基因转录水平上调,说明SGT1可能参与了小麦不同抗病反应.     

普通小麦花发育基因 TriFVE 的克隆与染色体定位

植物自主开花途径花发育基因FVE对植物营养生长向生殖生长的转变起重要的调控作用。为了进一步研究该基因在小麦中的调控功能,利用小麦基因组数据和二穗短柄草基因组数据,通过RT-PCR和PCR技术对小麦花发育基因FVE的DNA序列和cDNA序列进行了克隆和序列分析,分别获得了7 034bp(TriFVE1,Gene Bank JQ317687)和6 910bp(TriFVE2,Gene Bank JQ317688)的两个FVE基因序列。基因结构分析表明,FVE基因由15个外显子和14个内含子组成,TriFVE1和TriFVE2基因的内含子序列存在大片段的插入/缺失,同源性仅为79.87%。TriFVE1和TriFVE2的cDNA编码区序列均为1 368bp,存在4个SNP位点,编码455个氨基酸的FVE蛋白序列完全一致。利用"中国春"和21个缺四体将TriFVE1和TriFVE2分别定位于小麦3A和3D染色体上。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了FVE基因在单棱期、二棱期和穗分化时期的小麦茎尖组织表达模式,发现二棱期和穗分化期TriFVE的转录水平显著高于单棱期,表明FVE在小麦花发育由营养生长到生殖生长过程中起重要作用。基于FVE蛋白序列的系统进化树分析表明,苔藓植物、单子叶和双子叶植物被明显分为不同类群,该基因随着物种的进化而进化,可以为研究植物分子进化关系提供参考。     

将黑麦基因导入小麦的途径

在小麦产量、品质和适应性改良方面,黑麦具有许多可供利用的优良性状基因.虽然黑麦与小麦染色体组之间有部分同源关系,但由于它们的染色体难以配对,使得利用黑麦与小麦杂交直接将黑麦基因导入小麦有一定的困难.有些染色体操作方法可将黑麦基因导入小麦,例如部分同源染色体配对抑制基因(Ph)的利用.试验证明,六倍体小黑麦与普通小麦杂交是将黑麦基因或染色质片段导入小麦的一种很有潜力的方法.通过这条途径已经把黑麦的抗腥黑穗病、条锈及叶锈病,抗旱、长粒和致密腊质层基因或载有这些基因的小染色质片段导入了小麦,有些带有黑麦性状的品系还表现出高产潜力.     

野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与分析

RNA编辑是高等植物叶绿体基因转录后表达调控的一种重要方式。为了解野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑的组成及其与其他麦类作物的异同,通过生物信息学预测结合RT-PCR的方法,对野生二粒小麦叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测和鉴定。生物信息学预测共发现了分布于15个基因上的35个编辑位点,均为C到U的转换,其中ndhB基因包含的编辑位点数量最多,达9个;在此基础上,随机选取5个基因对其编辑位点进行了测序验证,结果共鉴定了18个C→U的编辑位点;进一步对编辑后编码蛋白的二级结构和跨膜结构域进行了预测,发现编辑后所有基因均发生了二级结构的改变,但只有ndhB基因的跨膜结构域发生了改变;最后,将确定的野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑位点与7个禾本科物种的RNA编辑位点进行比较,共发现17个编辑位点在这些种间具有保守性,相比于其他物种,野生二粒小麦与普通小麦和粗山羊草具有更相似的编辑位点组成。     

小麦高分子量谷蛋白亚基基因分子育种研究进展

为给小麦品质改良工作者提供通过分子生物技术优化HMW-GS组成方面的全面信息,综述了HMW-GS的基因克隆、分子标记以及基因工程改良三个方面近年来的国内外研究进展.迄今为止, 被克隆和测序的HMW-GS基因已有20多个,即1Ax1、1Ax2*、1Ax2*B、1Ay1、1Bx7、1Bx9、1Bx17、1Dx2、1Dx5、1Bx20、1By8、1By9、1Dy10、1Dy12、1AxNull、1Bx14、 1Bx23、1Dx2.2、1Dx2.1、1Dy10.1、1Dy12t等,还不断有新的基因被发现和克隆.克隆方法可概括为两种:一种是以HMW-GS克隆作为探针筛选cDNA或基因组DNA文库, 从而获得所需的靶基因序列, 然后再选择合适的载体进行克隆测序;另一种则是采用PCR技术.HMW-GS基因的分子标记方法主要有RFLP法、PCR法和SNP(单核苷酸多态性)法.目前已有研究者通过基因工程方法将部分外源HMW-GS基因导入小麦,有效地改善了受体品种的加工品质.     

小麦分蘖性状分子遗传研究进展

小麦分蘖性状是重要的株型性状,决定小麦的最终产量。对小麦分蘖性状进行遗传研究,挖掘调控小麦分蘖性状的重要基因并进行功能分析,有助于了解小麦分蘖性状的分子遗传机制及培育高产小麦新品种。本文针对目前小麦分蘖性状遗传研究所取得的进展进行总结,对已定位到的、参与调控小麦分蘖数目和分蘖角度的重要QTL位点进行分析,并对部分已经克隆的分蘖性状相关基因及其作用机理进行阐述,以期为小麦分蘖性状相关基因的克隆、分子机制解析和分子育种提供参考信息。     

小麦铁结合蛋白基因的同源克隆

为了寻找一种简捷的克隆同源基因的途径,以小麦铁蛋白基因的同源克隆为例,利用玉米的铁结合蛋白基因序列比对小麦的EST库,在网上进行电子延伸后以起始密码子为起点,终止密码子为终点设计特异性强的引物进行基因克隆,经过引物O1和Fcds扩增片段的测序及Blast比对,证实本试验已成功地从小麦的基因组和cDNA中克隆出铁结合蛋白基因。最后对基于同源序列克隆基因的策略及引物设计技巧进行了探讨。     

细菌人工染色体(BAC)文库及其在小麦中的应用

细菌人工染色体（BAC）具有容量大、遗传稳定、易于操作等优点，在基因组研究和基因功能分析等方面得到了广泛应用。对BAC文库克隆载体的类型、小麦BAC文库的构建及其应用进行了综述，并对其前景进行了展望。细菌人工染色体载体是由大肠杆菌的F-因子发展而来，第一代BAC克隆载体pBAC1081能容纳300kb的片段，但它只具有转化选择标记．没有重组选择标记。第二代载体是将LacZ基因插入到多克隆位点中形成具有重组选择标记类型的载体如pBeloBACll，在该载体的基础上经过改造和改进又发展了一些特殊用途的载体，如富集基因类型和遗传转化类型的载体。近年来利用这些载体构建了小麦二倍体、四倍体、六倍体基因组BAC文库以及小麦特定染色体BAC文库，井以单克隆或混合池的形式保存。这些小麦BAC文库对于小麦基因克隆、基因组及基因区物理图谱的构建以及比较基因组学等方面的研究具有重要的意义。     

小麦籽粒脂肪氧化酶研究进展

小麦面粉或面制品的色泽是评价小麦品质性状的主要指标。小麦籽粒脂肪氧化酶(LOX)是影响面粉及面制品颜色发生褐变的主要因素之一,且与小麦加工品质、储藏品质密切相关。目前,分光光度法和氧化电极法是测定小麦籽粒LOX活性最为常用的方法。小麦籽粒LOX活性是一个受多基因控制的复杂数量性状,基因型和环境对其均有显著影响,但基因型是最为主要的决定因素。控制小麦籽粒LOX活性的主效基因被定位在4A、4B、4D和5D染色体上,目前已有多个控制LOX活性的分子标记被开发,可直接用于小麦脂肪氧化酶活性的分子标记辅助选择。本文综述了小麦籽粒脂肪氧化酶测定方法及其影响因素,阐述了小麦籽粒脂肪氧化酶的基因定位、克隆、等位变异类型以及功能标记的开发和利用情况,并系统地阐明了脂肪氧化酶与小麦品质性状的关系。     

小麦禾谷孢囊线虫及抗线虫性基因研究进展

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的病原线虫，培育和推广禾谷孢囊线虫抗性品种是最经济、安全、有效的防治途径。我国自1989年首次有该病的报道以来，目前在河北、河南等省、市区均有发现，而且危害面积呈正扩大趋势。根据禾谷孢囊线虫对抗病基因的毒性差异表现，可将其分为13个致病类型，但仍有效的致病类型被发现。在小麦中已鉴定出十多个小麦禾谷孢囊线虫抗性基因位点，这些抗性基因多为显性基因，针对不同的禾谷孢囊线虫致病类型，其抗性水平表现也不相同。利用分子标记技术可对抗性基因进行快速定位，从而为抗虫能种创造条件。同时，基因克隆技术使抗源得到进一步拓展，为小麦禾谷孢囊线虫抗性基因创制提供了一条简捷、有效的途径。     

分子生物学技术在普通小麦谷蛋白研究中的应用

小麦谷蛋白是面筋的主要成分之一，对小麦食品的加工品质起着重要作用。本文从基因序列、分子结构、多态性、遗传转化、QTL研究和MAS等方面综述了国内外有关麦谷蛋白亚基的研究进展。这些研究结果表明，麦谷蛋白的等位基因变异十分丰富，多态性高．序列之间存在很高的同源性。麦谷蛋白的基因结构分为三部分：无重复结构的N-末端和C-末端以及中部重复区域，等位基因的变异主要由基因中部重复区域的序列大小、重复次数及该区域内DNA序列的插入或缺失所造成；Cys-残基的数目和位置影响麦谷蛋白聚合体内亚基间的相互作用，是影响亚基生化特性的重要因素；应用转基因技术已将HMW-GS基因(1Ax1、1Dx5和1Dy10)导入普通小麦中，有助于进行品质改良和麦谷蛋白结构与功能的深入研究。此外，对面筋强度性状的QTL分析和分子标记辅助育种也进行了阐述。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)研究进展

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（SKTI）是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，主要集中在大豆的子叶中，近60年来，对其生化特性及结构已有较多研究，通常认为这种蛋白酶抑制剂具有贮藏，调节内源蛋白酶活性及植物防御等作用，研究表明，这种蛋白酶抑制剂抗虫谱广，能显著抑制幼虫的生长发育不易产生抗性，对人畜无害，因此对其进行研究及开发利用具有重要的经济和社会效益。迄今为止，至少已有4种基因被克隆，通过转基因技术在烟草，水稻，小麦等作物获得了抗性植株，本文从SKTI的类型，基因克隆及生理功能等方面作一简单综述。     

麦类等主要作物的miRNA研究进展

microRNA(miRNA)是一类小分子的非编码RNA,可通过对其靶基因mRNA的降解或翻译抑制调控基因表达。目前除对拟南芥、水稻和杨树等模式植物已进行研究之外,对麦类作物的miRNA也进行了初步研究。利用生物信息学预测和小分子RNA测序的方法,目前已克隆了一系列小麦和大麦miRNA,包括物种保守的miRNA及麦类特有的miRNA。靶基因预测及miRNA表达谱分析显示这些麦类miRNA的表达具有时空特异性,可能参与生长发育及胁迫应答的调控。这些数据为进一步研究植物miRNA的进化及麦类miR-NA参与的特异调控功能提供了线索及依据。