橡胶树蛋白激酶HbBIN2基因的克隆、蛋白表达纯化及酶活分析

橡胶树是天然橡胶的唯一材料来源。寒害是橡胶树面临的主要自然灾害之一,严重限制了橡胶树的生长发育和种植区域分布,克隆和鉴定橡胶树低温应答基因尤为重要。蛋白激酶BIN2（brassinosteroid insensitive 2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在调控植物应对低温胁迫中发挥重要作用,但橡胶树蛋白激酶HbBIN2还未被克隆与鉴定。本研究从橡胶树cDNA中成功克隆出HbBIN2,序列分析表明：HbBIN2的开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸,蛋白的分子量为42.9 kDa,理论等电点为8.74,是亲水性蛋白且无跨膜结构域。将HbBIN2构建到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株,摸索合适的诱导条件后成功诱导表达出HbBIN2蛋白。比较HbBIN2在不同的诱导温度（16、28、37℃）、诱导时间（3、6、12 h）和IPTG浓度（0.1、0.3、0.5 mmol/L）下的表达量,结果表明,HbBIN2在37℃,0.3 mmol/L IPTG诱导12 h的表达量最大。对HbBIN2蛋白体外纯化条件进行探索,结果表明,100 mmol/L咪唑能将目的蛋白完全洗脱。纯化HbBIN2蛋白并进行激酶活性鉴定,结果表明,该蛋白具有激酶活性。该研究为后续HbBIN2蛋白功能分析和橡胶树应对低温胁迫的调控机制研究提供参考,为橡胶树耐寒品种分子育种提供重要的基因资源。     

奇兰秋季红茶加工过程主要生化成分变化及相关酶基因表达

以武夷名丛奇兰秋季鲜叶为原料,按传统红茶加工工艺制成红茶,并探明其加工过程中主要生化成分含量、多酚氧化酶（PPO）活性及相关酶基因表达的变化规律,以期为秋季红茶品质改良和工艺改进提供一定参考。结果表明：从鲜叶（XY）至发酵结束（FJ8）,茶多酚、儿茶素、水浸出物、咖啡碱分别下降6.13%、15.66%、10.64%、0.10%;黄酮、茶黄素、茶红素、茶褐素、游离氨基酸分别上升4.98 mg/g、7.45 mg/g、2.03%、5.58%、0.14%,其中咖啡碱变化幅度最小。茶黄素、茶红素、茶褐素与儿茶素呈极显著负相关,相关系数分别为：-0.991、-0.969、-0.972。PPO活性呈波动变化,萎凋阶段先上升后下降,揉捻时达到峰值,为458.83 U/g,约为XY的1.67倍;发酵阶段快速下降,FJ8时,PPO酶活显著低于XY,约为XY的0.89。多酚氧化酶基因CsPPO1、CsPPO2表达变化规律一致：先上升后下降,相对表达量在萎凋15 h（WD15）最高,分别为XY的11.2、12.8倍,揉捻时开始下降,发酵阶段表达量与鲜叶无显著差异。儿茶素类代谢相关酶基因PAL、CHS、C4H、CHI、F3H、F3°5°H、FLS、DFR、LAR、ANR的表达在加工过程中均受不同程度抑制,相对表达量显著低于XY,除与CG（儿茶素没食子酸酯）呈负相关外,与儿茶素其他组分均呈正相关,但不显著,相关系数在0.130~0.750之间。     

海南广藿香内生真菌分离鉴定及拮抗菌株筛选

本研究从海南广藿香的根、茎、叶和花等组织中分离获得61株内生真菌,采用显微形态观察和ITS序列分析鉴定为15个属,其中优势菌群为炭疽菌属（Colletotrichum）和干酪酵母菌属（Meyerozyma）。以澳洲坚果叶枯病菌（Pestalotiopsis microspora）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）和火龙果溃疡病菌（Neoscytalidium dimidiatum）为指示菌,采用平板对峙法进行拮抗菌株筛选,发现镰刀菌属（Fusarium）菌株PfuJ20、PfuG16和PfuG5对澳洲坚果叶枯病菌的抑制效果最好,棒孢属（Corynespora）菌株PfuH2对西瓜枯萎病菌抑菌效果较好。采用滤纸片扩散法进行各菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌等动植物病原细菌的抑菌作用评价,发现镰刀菌属PfuJ20、PfuG16对各细菌均有较强抑制效果,而链格孢属（Alternaria） PfuH1对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果相对最强。结果表明,海南广藿香内生真菌具有一定的生物多样性,部分内生真菌菌株具有较强的抑菌活性。     

一株高产谷氨酰胺酶菌株的鉴定和酶活特性的研究

对筛选得到一株高产谷氨酰胺酶菌株进行了初步鉴定并对酶活特性做了研究.通过生理生化实验并结合菌体形态特性,结果发现该菌株可以确定该菌属于柠檬酸细菌属(Citrobacter).通过单因素试验,考察了温度、pH、NaCl和产物谷氨酸对该菌株产生的谷氨酰胺酶的影响.结果发现菌株产生的谷氨酰胺酶的最佳反应pH为6.2,酶最适反应温度为50℃.酶最稳定的pH为6.2,温度低于40℃,酶具有较高的稳定性.高浓度的NaCl对谷氨酰胺酶活性基本无影响.谷氨酸对酶也没有明显的抑制作用.     

云南景迈山不同生境茶园根际土壤微生物群落多样性初步研究

为了探究景迈山普洱茶区不同生境茶园根际土壤微生物群落结构多样性和差异性,对景迈山普洱茶区的微生物进行溯源,更好地保证景迈山原产地生产的普洱茶微生物的一致性。采用平板涂布分离技术,对从3个有机台地茶园（TS-A、TS-B、TS-C）和景迈山古茶园（GS-D）采集的根际土壤微生物进行培养,并利用分子生物学技术鉴定其种类。在茶园根际土壤微生物中经分离纯化共得到417株细菌和143株真菌,分别归类于27个细菌属和18个真菌属,4个茶园根际微生物多样性不同,细菌多样性和真菌多样性的排序分别为：GS-D>TS-A>TS-C>TS-B和TS-A>TS-B>TS-C>GS-D。4个茶园的微生物群落均含有节细菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、杆菌属（Lysinibacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、曲霉属（Aspergillus）和青霉菌属（Penicillium）,其中芽孢杆菌属（Bacillus）和青霉菌属（Penicillium）为优势菌属。结果表明,景迈山不同生境下的根际土壤微生物群落组成有差异性,3个有机台地茶园的细菌多样性低于古茶园,但真菌多样性高于古茶园。3个有机台地茶园的规律如下：茶树品种一样,套种品种多的茶园的细菌和真菌多样性都高于套种品种少的茶园,套种品种相似的茶园,茶树品种越多,细菌的多样性更高,而真菌多样性更低。     

青砖茶渥堆发酵中嗜热细菌筛选、鉴定及产酶特性研究

渥堆发酵是青砖茶独特品质形成的关键技术环节。对来自青砖茶渥堆发酵样品中的细菌进行高温筛选和鉴定。结果表明,通过筛选得到20株能在高温条件下良好生长的细菌,其中15株菌株能够在含茶汤的培养基中生长。3株菌株的最适生长温度为55℃,为嗜热细菌。结合嗜热菌株的形态特征和16 S rDNA基因序列分析,确定1株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,2株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。经嗜热细菌发酵晒青毛茶的产酶试验可知,嗜热菌株在发酵茶叶时能够产生纤维素酶、淀粉酶和单宁酶,其酶活力分别可达215.69、259.28、4.85 U。     

春季油樟可培养内生真菌多样性及产黄酮功能初筛

为开发油樟内生菌资源并发现潜在活性成分,本研究以春季油樟健康植株的根、茎、叶为材料,采用组织培养法分离纯化可培养内生真菌,结合ITS序列和系统发育树分析菌株多样性,筛选具有产黄酮功能菌株,设计单因素和正交试验优化产黄酮效果最佳菌株的发酵条件。结果表明：从油樟中共分离到62株可培养内生真菌,划分为3门、7纲、14目、22科、28属、54种。其中优势门为子囊菌门（Ascomycota,RF为88.71%）,优势纲为座囊菌纲（Dothideomycetes,RF为45.16%）,优势目为格孢腔菌目（Pleosporales,RF为37.10%）,优势科为格孢菌科（Pleosporineae,RF为14.52%）、亚隔孢壳科（Didymellaceae,RF为12.90%）,优势属为链格孢属（Alternaria,RF为12.90%）、附球菌属（Epicoccum,RF为11.29%）。以纲为类群单位,根组织分离的16属20种21株真菌的系统发育可分为7个类群,茎分离的13属24种30株真菌则分为2个类群,叶的8属10种11株真菌则分为3个类群。多样性指数和均匀度系数结果表明,油樟根部内生真菌种群多样性相对较丰富,群落分布相对均匀。10株内生真菌具有产黄酮功能,5株来自根部,5株来自于茎部,隶属2门3纲5目8科9属,其中YZ-29菌株产黄酮能力相对较强。YZ-29菌株最优发酵条件为初始pH 7、时间7 d、温度30℃、转速175 r/min、装液量80 mL/150 mL。综上结果显示,内生真菌在油樟不同组织数量、种群及组成上存在差异,分离得到的功能性菌株值得深入挖掘和开发利用,为开展内生真菌在油樟抗氧化成分的生物合成机制方面的研究奠定基础。     

毒死蜱降解细菌WJl-063的鉴定及酶促降解特性

从海南某农药厂地土壤中分离到1株能很好降解毒死蜱的菌株WJI-063,经形态特征、生理生化及16s rDNA序列分析,将该菌株初步鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus).降解酶降解性能研究表明,该菌株能以毒死蜱作为唯一碳源生长,并且对毒死蜱起主要降解作用的是胞内酶,其传代降解代谢活性稳定.以牛血清白蛋白为标准蛋白,测得粗提酶中可溶性蛋白含量为0.044 mg/mL;在pH5.0～8.0范围内,酶活力表现稳定,通过双曲线法认为该酶降解毒死蜱的最适pH值为8.0;毒死蜱降解酶热稳定性差,最适温度为25℃;该酶与毒死蜱底物结合力强,对毒死蜱具有较好的降解效果,米氏常数Km为201.92nmol/L,最大降解速率为399.36nmol/mg·min.     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶基因(chiD)的克隆与原核表达

以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。     

斑兰叶叶部病害病原菌的分离鉴定

斑兰叶作为一种新兴的食品香料备受消费者喜爱,其主要食用部位为叶片,但叶部病害成为影响斑兰叶产业发展的首要制约因素。目前,国内外关于斑兰叶叶部病害的研究鲜有报道,为了对斑兰叶叶部病害开展有针对性的防治工作,本研究通过调查斑兰叶叶部病害发生流行规律,明确叶部病害主要发病时期及病害种类,并对叶部不同病害病原菌进行分离鉴定,为推动斑兰产业发展提供技术支撑。结果表明,斑兰叶叶部病害的发生主要从每年11月中下旬开始到翌年4月结束,对这个时期的不同病害通过病原菌的菌落形态、孢子显微结构观察、真菌通用引物ITS1/ITS4鉴定和致病性测定,采用离体叶片和活体盆栽苗2种方式测定分离的28株菌株的致病性,通过柯赫氏法则验证,最终得到9株致病菌BDC4121、BDC11221、BDC4112、BDC21112、XYS211、LSS112、LSS214、LSS213、LSS221。通过产孢培养基筛选发现致病菌BDC11221在绿豆液体培养基、摇床培养5~7 d产孢,LSS214在PDA培养基28℃下恒温培养30 d左右产孢,BDC4121、BDC4112、XYS211、LSS112、LSS221、LSS213在PDA培养基28℃下恒温培养7~10 d产孢;并结合ITS1/ITS4鉴定和孢子显微结构观察,确定9株致病菌主要分布在篮状菌属（Talaromyces）、镰刀菌属（Fusarium）、炭疽菌属（Colletotrichum）、附球菌属（Epicoccum）、拟盘多毛孢菌属（Pestalotiopsis）、拟茎点霉属（Phomopsis）、链格孢属（Alternaria）及Acrocalymma属。下一步将结合多基因组测序技术对致病菌进行分子鉴定研究。     

球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在侵染宿主过程中的不同作用

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）在宿主昆虫体壁穿透和体内定植过程中分泌了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2两种胞外几丁质酶,但二者的作用分工尚不明确。本文通过菌株胞外总几丁质酶活性与侵染毒力的相关性分析,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因表达水平与侵染毒力的相关性分析,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的生物信息学分析以及在侵染过程中的表达模式分析,以期明晰Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在菌株侵染宿主过程中的作用分工。结果表明,菌株胞外几丁质酶活性与侵染毒力呈正相关,但Bbchitinase 1和Bbchitinase 2表达水平不同。菌株间Bbchitinase 1表达水平与菌株侵染毒力（MMT和LT₅₀）呈显著正相关,而Bbchitinase 2表达水平却与侵染毒力不相关。生物信息学分析结果显示,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2具有显著的结构和功能差异,可能结合不同的配体蛋白,参与不同的代谢过程。表达模式分析结果表明,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因在侵染宿主过程中均上调表达;但Bbchitinase 1仅在侵染家蚕的体壁穿透阶段显著上调表达,而Bbchitinase 2在芽生孢子生成阶段和菌丝大量增殖阶段显著上调表达。以上研究结果说明,Bbchitinase 1可能参与菌株侵染早期的侵入钉形成和体壁穿透过程,与侵染毒力呈正相关;而Bbchitinase 2可能参与侵染过程中的芽生孢子发育和菌丝大量增殖代谢调控。本研究明晰了球孢白僵菌不同几丁质酶在侵染过程中的作用分工,建立了以Bbchitinase 1基因表达水平判定菌株毒力的数学模型,为高毒、高稳定性球孢白僵菌生防菌株的筛选提供重要科学依据,对提升绿色生态防治应用效果具有重要意义。     

橡胶树2个胶乳转化酶基因的原核表达

转化酶是控制橡胶树胶乳蔗糖代谢和影响胶乳(橡胶)产量的关键酶。将已克隆的2个橡胶树胶乳转化酶基因(HbNIN1、HbNIN2)的编码区插入到原核表达载体pET28a上,经酶切和测序鉴定,成功获得了读框准确的转化酶表达载体(pET-HbNIN1和pET-HbNIN2);再将表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),对其培养温度、IPTG诱导浓度和培养时间进行优化表达。结果表明,携带2个转化酶基因表达载体(pET-HbNIN1和pET-HbNIN2)的大肠杆菌转化子分别在28℃和37℃条件下,经浓度1.0 mmol/L IPTG诱导6 h实现了目标蛋白(HbNIN1和HbNIN2)的原核高效表达,表达量大于菌体总蛋白的20%,目标蛋白主要以包涵体形式存在。该结果为进一步研究这2种转化酶蛋白的分子特性和抗体制备奠定基础。     

芋ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）基因家族的克隆、生物信息学及表达分析

芋（Colocasia esculenta）为天南星科芋属成员,在世界范围内广泛种植,其球茎主要贮藏物质为淀粉。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成的第一个关键酶和限速酶,在植物淀粉合成中发挥关键作用,但目前关于芋AGPase基因家族的分子结构特征和表达模式还不清楚。本研究以芋新品种‘荔浦芋1号'为试材,从全长转录组注释信息中筛选到6个AGPase基因家族成员,利用RT-PCR技术克隆了6个基因的编码区,利用生物信息学对其理化性质、进化关系和保守motif进行分析;同时利用转录组学和荧光定量RT-PCR技术对6个基因在不同组织和球茎不同发育阶段的表达模式进行分析。结果表明：克隆获得6个芋AGPase基因编码区的cDNA序列,序列长度为1398~2028 bp,编码的蛋白大小为350~543 aa,其中4个基因（CeAGPL1~CeAGPL4）编码AGPase的大亚基,2个基因（CeAGPS1,CeAGPS2）编码AGPase的小亚基。系统进化分析显示,所有的AGPase分成了大亚基和小亚基2个群组,4个大亚基分在了大亚基组,2个小亚基分在了小亚基组。CeAGP家族蛋白分子质量范围为38 753.22~59 743.05 kDa,等电点范围为5.64~8.82,亚细胞定位为叶绿体、淀粉体和细胞质等。蛋白的保守motif分析发现,CeAGP家族蛋白共预测到11个保守motif,6个motif功能注释为NTP_transferase,除CeAGPS2外,另外5个CeAGP蛋白均包含11个motif。在不同组织中,6个CeAGP基因均能在所有组织中表达,其中CeAGPL3和CeAGPS1基因在叶片和叶柄中高表达,CeAGPL1和CeAGPS1基因在球茎中高表达,6个CeAGP基因在根的表达量均较低。在球茎不同发育阶段中,CeAGPL1和CeAGPS1高表达且均表现先升高后降低的趋势,2个基因分别在4月龄和5月龄阶段的表达量最高。该研究结果为后续阐明芋淀粉合成的分子机制提供依据。     

一株木薯生淀粉糖化酶菌株的分离及酶学性质研究

从腐烂的木薯中分离得到1株降解生淀粉能力较强的菌株ITBB FC2,经形态学鉴定和18S rDNA序列分析,初步鉴定属于黑曲霉（Aspergillus niger）。该菌株用2％生木薯粉培养基摇瓶,37 ℃,200 r/min培养3 d后,发酵液葡萄糖含量为970 mg/L,生淀粉酶活力为495.04 U/mL。采用固体产酶培养基（麸皮 ∶ 水=1 ∶ 1）培养,所得酶活力为6 330 U/g。酶反应最适pH为4.0~5.0。Ca2+对酶活力有一定的促进作用。     

柱花草甲壳质酶基因SgGH19-1的克隆表达及酶学性质分析

甲壳质是真菌细胞壁、昆虫外骨骼和甲壳类动物外壳的主要成分。甲壳质的降解主要依赖甲壳质酶的水解作用。诱导PR-3类甲壳质酶蛋白积累是植物增强对真菌性病害抗性的适应性机制。柱花草是一种重要的热带豆科牧草,由胶孢炭疽菌引起的炭疽病是危及柱花草生产的主要真菌性病害。但柱花草甲壳质酶对炭疽菌侵染的响应仍不清楚。本研究旨在鉴定柱花草PR-3类甲壳质酶基因,并对其表达模式、编码蛋白的生化酶学性质进行分析。结果表明：通过同源克隆获得了1个柱花草PR-3类甲壳质酶基因,其编码区序列全长984 bp,属于糖苷水解酶19家族的ClassⅠ亚族,将其命名为SgGH19-1。荧光定量PCR分析表明,接种炭疽菌诱导SgGH19-1在柱花草叶片中显著增强表达,并伴随着甲壳质酶活性的提高。随后,在大肠杆菌中表达纯化了SgGH19-1重组蛋白,生化酶学性质表明,SgGH19-1蛋白兼具甲壳质内切酶与外切酶活性,但内切酶活性比外切酶活性高9.1倍。SgGH19-1的最适pH为5.0,最适温度为40 ℃。综上所述,SgGH19-1基因参与柱花草对炭疽菌侵染的响应,其编码的蛋白具有甲壳质酶活性,可作为柱花草抗炭疽病育种的分子标记。     

产多酚氧化酶茶树内生真菌的筛选及产酶条件优化

以愈创木酚、α-萘酚、没食子酸、L-酪氨酸和单宁酸等5种酚类物质为底物,采用鉴别培养基筛选法从14株茶树内生真菌中初筛获得4株产多酚氧化酶的真菌。根据变色圈的大小、颜色深浅和摇瓶发酵的结果复筛获得产多酚氧化酶能力较强的菌株CSN-13。对菌株CSN-13产酶营养条件进行初步分析,结果表明,在供试的6种碳源物质中,以麸皮对菌株CSN-13产多酚氧化酶的促进作用最为明显;供试的5种氮源物质中,以硝酸铵的促进作用最为明显;在发酵培养基中添加茶水,对产酶有明显的促进作用。采用正交设计对CSN-13产酶发酵培养基进行初步优化,优化后的培养基配方为：麸皮（40βg·L^-1）、硝酸铵（15βg·L^-1）、茶水（4βg·L^-1）、KH₂PO₄（2βg·L^-1）、MgSO₄·7H₂O（0.5βg·L^-1）、无水CaCl₂（0.075βg·L^-1）、CuSO₄·5H₂O（0.01βg·L^-1）。采用优化后的培养基,菌株CSN-13在28℃下培养5βd,酶活力达到241βU·mL^-1·min^-1,比优化前提高8.5倍。茶树内生真菌菌株CSN-13及其发酵产酶培养基的研究为多酚氧化酶的进一步开发打下了基础。     

促生细菌Bacillus sp. QN2MO-1的鉴定及对番茄生长的影响

为分离和鉴定具有促生作用的内生菌,开发潜在功能的微生物菌株,本研究以诺尼（Morinda citrifolia L.）为研究对象,从植株不同组织中共分离得到621株内生细菌,经复筛得到具有促生和解磷作用的菌株,命名为QN₂MO-1。基于菌株的生理生化分析和16S rDNA的序列比对,该内生细菌与Bacillus siamensis KCTC 13613^T（AJVF01000043）具有99.04%的同源性。药敏性分析显示,该菌对青霉素、硫酸链霉素和氨苄西林具有明显的抗性。QN₂MO-1可促进番茄种子的萌发;与对照相比,5%菌体发酵液处理能显著提高植株的生长。     

杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。     

芒果无机焦磷酸酶基因的克隆及其表达载体构建

无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase,PPase）催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi）,是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物,采用3′ RACE和5′ RACE方法,从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因,将其命名为MiPPase,其全长cDNA序列为1014 bp,开放阅读框为837 bp,编码278个氨基酸,分子量为30.85 ku,等电点为4.68。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系。为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用,本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体,为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1（FoSTIP1）基因的克隆及表达分析

本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4）转录因子FoSkn7一个候选的下游基因,结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt,编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白进行了结构域和进化分析,结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白（stress-in-ducible protein-1, STI1）结构域和多个三角形4肽重复序列结构域（tetratricopeptide repeat, TPR）。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）亲缘关系最近,因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoSTIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H₂O₂诱导情况下的表达变化,也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H₂O₂诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H₂O₂诱导情况下,B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调,而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H₂O₂诱导,其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoSkn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。