杧果炭疽病菌漆酶基因Cglac3序列特征及其在两个侵染相关基因突变体中的表达分析

本研究运用同源克隆技术克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因,并采用实时荧光定量PCR分析了该基因在侵染过程、漆酶基因LAC1突变体、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突变体中的差异表达情况。结果表明,杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小为1842 bp,含3个内含子,大小分别为56、51、58 bp。Cglac3开放读码框编码558个氨基酸,蛋白分子量为61.38 kDa,等电点（PI）为4.50。与未侵染对照0 h的表达量相比,Cglac3在6 h孢子萌发形成附着胞时表达量迅速升高,在12 h侵入寄主后达到最高,之后在菌丝扩展、叶片显症过程中出现波动,但均远高于0 h的表达量,显示Cglac3在侵染的不同阶段均发挥着重要的作用,可能是胶孢炭疽菌的重要致病因子之一。与野生型相比,Cglac3表达量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突变体中下降了74%,在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突变体中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突变体中,LAC1的表达下降了68%,与Cglac3的表现趋势一致,说明Cglac3的表达受LAC1调控,外切葡聚糖酶基因CgCBH1也会影响Cglac3和LAC1的表达。     

OsLOX10正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性

【目的】由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病和由水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白叶枯病严重影响水稻的产量和品质。创制转OsLOX10基因水稻材料，进行稻瘟菌和白叶枯菌的抗病性分析，有助于揭示其调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性机制。【方法】采用CRISPR/Cas9系统构建OsLOX10的敲除载体，利用限制性内切酶XcmⅠ线性化pCXUN-HA，TA连接构建OsLOX10的过表达载体，遗传转化获得OsLOX10转基因水稻，筛选过表达株系和纯合敲除株系进行真菌和细菌的抗病性分析。在稻瘟菌（Guy11）侵染水稻后，对水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）途径的标志基因进行qRT-PCR分析;在几丁质（chitin）和flg22诱导下，观测水稻活性氧（reactive oxygen species，ROS）的暴发情况。【结果】 qRT-PCR分析表明，接种稻瘟菌和白叶枯菌24 h后，OsLOX10表达量上调;OsLOX10的纯合敲除和过表达水稻转基因株系接种稻瘟病菌Guy11孢子悬浮液，与野生型（日本晴）相比，OsLOX10敲除株系更易感病，过表达株系则无典型的病斑症状;接种 6、12、24和36 h时，3个病程相关蛋白基因OsPBZ1、OsPR1a、OsPR1b和SA通路基因OsPAL1，以及JA合成通路上的2个基因OsAOS2、OsLOX5的转录水平在敲除转基因株系中显著下调，而在过表达转基因株系中显著上调。对转OsLOX10基因水稻接种白叶枯菌（PXO99A），发现敲除OsLOX10的转基因水稻对白叶枯菌更易感病。qRT-PCR分析OsPR1b和OsPAL1以及JA合成通路上的3个基因OsAOS2、OsAOC和OsJAZ在OsLOX10过表达基因水稻中表达量明显上调，而在敲除OsLOX10的转基因水稻中却保持在较低水平，在接种7 d后表现出显著性差异。在几丁质和flg22诱导下，OsLOX10敲除株系的ROS水平显著性降低，而且在几丁质诱导下，ROS的起峰时间推迟。【结论】稻瘟病菌和白叶枯病菌能够诱导OsLOX10的表达，OsLOX10通过病原菌分子模式触发的免疫途径（PTI）参与抗病反应，其在水稻抵御稻瘟病和白叶枯病中起着正调控作用。同时，OsLOX10可能通过调节SA和JA介导的信号通路来正调控水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性。     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶基因(chiD)的克隆与原核表达

以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。     

番木瓜干旱胁迫相关CpDHN基因的克隆与原核表达

本研究基于转录组获得的CpDHN转录本序列,以番木瓜‘台农二号’组培苗叶片为材料,采用RT-PCR技术克隆了该基因包含完整ORF在内的425 bp cDNA序列。序列分析表明,CpDHN预测编码93个氨基酸,其理论分子量为10.50 kDa、等电点为6.62、总平均疏水指数为-1.984、核定位。除保守的K片段外,蛋白还含有1个S片段,可归为KS型脱水素。在拟南芥中的10个脱水素中,CpDHN与AtLEA8的亲缘关系最近,相似性为53.3%。值得注意的是,虽然CpDHN的编码区不存在内含子,但其3°UTR含有1个与AtLEA8类似的内含子。表达谱分析显示,该基因在根和叶片中均受干旱胁迫诱导。此外,还构建了CpDHN的原核表达载体,SDS-PAGE分析显示,该蛋白在大肠杆菌中可高效表达。这些结果为下一步的功能鉴定奠定了坚实的基础。     

芒果无机焦磷酸酶基因的克隆及其表达载体构建

无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase,PPase）催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi）,是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物,采用3′ RACE和5′ RACE方法,从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因,将其命名为MiPPase,其全长cDNA序列为1014 bp,开放阅读框为837 bp,编码278个氨基酸,分子量为30.85 ku,等电点为4.68。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系。为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用,本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体,为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。     

木薯MeLHCB4基因的克隆及表达分析

本研究采用RT-PCR技术克隆了木薯叶绿素a/b结合蛋白基因MeLHCB4编码区序列。通过生物信息学对其基因结构、基因编码蛋白的理化性质等进行分析,并对不同物种的LHCB4氨基酸序列进行比对和构建进化树。结果表明,木薯MeLHCB4基因的CDs序列全长858 bp,编码285个氨基酸,蛋白理论相对分子质量约为30.9 kDa,理论等电点为5.47,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,预测该蛋白可能定位于细胞核或细胞质中。实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式发现,MeLHCB4基因主要在木薯叶片和茎中表达,受到茉莉酸甲酯（JA）、水杨酸（SA）和乙烯前体（ACC）等激素的诱导表达,推测其可能参与了JA、SA、ACC信号途径。细菌性枯萎病病原菌侵染木薯叶片12 h后,MeLHCB4的表达量显著提高,表明MeLHCB4参与了木薯对病原菌的响应过程。     

球孢白僵菌Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在侵染宿主过程中的不同作用

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）在宿主昆虫体壁穿透和体内定植过程中分泌了Bbchitinase 1和Bbchitinase 2两种胞外几丁质酶,但二者的作用分工尚不明确。本文通过菌株胞外总几丁质酶活性与侵染毒力的相关性分析,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因表达水平与侵染毒力的相关性分析,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2的生物信息学分析以及在侵染过程中的表达模式分析,以期明晰Bbchitinase 1和Bbchitinase 2在菌株侵染宿主过程中的作用分工。结果表明,菌株胞外几丁质酶活性与侵染毒力呈正相关,但Bbchitinase 1和Bbchitinase 2表达水平不同。菌株间Bbchitinase 1表达水平与菌株侵染毒力（MMT和LT₅₀）呈显著正相关,而Bbchitinase 2表达水平却与侵染毒力不相关。生物信息学分析结果显示,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2具有显著的结构和功能差异,可能结合不同的配体蛋白,参与不同的代谢过程。表达模式分析结果表明,Bbchitinase 1和Bbchitinase 2基因在侵染宿主过程中均上调表达;但Bbchitinase 1仅在侵染家蚕的体壁穿透阶段显著上调表达,而Bbchitinase 2在芽生孢子生成阶段和菌丝大量增殖阶段显著上调表达。以上研究结果说明,Bbchitinase 1可能参与菌株侵染早期的侵入钉形成和体壁穿透过程,与侵染毒力呈正相关;而Bbchitinase 2可能参与侵染过程中的芽生孢子发育和菌丝大量增殖代谢调控。本研究明晰了球孢白僵菌不同几丁质酶在侵染过程中的作用分工,建立了以Bbchitinase 1基因表达水平判定菌株毒力的数学模型,为高毒、高稳定性球孢白僵菌生防菌株的筛选提供重要科学依据,对提升绿色生态防治应用效果具有重要意义。     

芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制,本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因,将其命名为MinMYB10,其全长cDNA序列为1021 bp,开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基,分子重量为31.60 ku,等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10,以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。     

Dickeya sp. DCE-01关键脱胶酶基因克隆及表达

根据全基因组测序注释结果设计特异引物,从DCE-01菌株克隆关键脱胶酶基因:果胶酶基因(pel E)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man),重组到表达载体p ET-28a中,导入E.coli BL21中进行诱导表达。结果表明:pel E核酸序列长1185 bp,编码395个氨基酸,蛋白分子量为44 kDa;xyn核酸序列长1251 bp,编码416个氨基酸,蛋白分子量45.74 kDa;man核酸序列长1137 bp,编码379个氨基酸,蛋白分子量41.85 kDa。果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶的酶活力分别为471.97、64.32、16882.86 U/mL。该研究为进一步发掘DCE-01菌株基因资源及开发高效工业酶制剂提供了科学依据。     

向日葵柄锈菌效应子P2的定位及功能研究

由向日葵柄锈菌（Puccinia helianthi Schw.）引起的向日葵锈病严重威胁着向日葵的安全生产。效应子是一类病原菌侵染过程中分泌的蛋白，促进病原菌侵染或触发寄主免疫。为明确向日葵锈菌效应子P2在锈菌侵染过程中发挥的作用，对该基因序列进行了生物信息学分析；以向日葵锈菌夏孢子cDNA为模板，克隆了P2基因的编码序列，利用qRT-PCR技术分析了该基因在侵染过程中的表达特性；采用农杆菌瞬时表达系统在烟草上验证了P2的毒性功能，并在烟草上瞬时表达对其进行了亚细胞定位。研究结果表明，P2编码58个氨基酸，N端含24氨基酸的信号肽，无核定位信号及跨膜结构域，并在向日葵锈菌侵染早期上调表达。在本氏烟中瞬时表达P2可以抑制BAX诱导的细胞坏死，亚细胞定位结果表明P2定位在细胞膜及细胞核。     

一个调控大豆根瘤数量的GmWUS2基因功能研究

豆科植物的结瘤固氮作用在农业上具有减肥增效、改良土壤等重大意义.WUS基因在植物分生组织中具有重要作用.基于已公布的大豆基因组数据对该基因进行生物信息学分析,表明大豆WUS基因(GmWUS)和模式植物拟南芥WUS基因(AtWUS)的编码蛋白在氨基酸序列上相似度较高,但在酸性区域存在较大差异.从大豆品种天隆1号基因组中扩...     

蝴蝶兰PhPP2Aa基因作为低温胁迫内参基因的研究

实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其具有简单灵敏、准确高效等诸多优点,成为目的基因表达水平研究最常用的技术手段。而结果的可靠性取决于很多因素,其中使用合适的内参基因是qPCR技术最基本的应用前提。许多研究表明没有一种内参基因可以在任何条件下都能稳定地表达。目前尚未见到关于蝴蝶兰低温生长条件下最佳内参基因选择的有关报道。蛋白磷酸酶2A（PP2A）是真核生物体内一种主要的细胞内源丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。本研究根据蝴蝶兰低温转录组测序结果克隆得到1个PP2A的A亚基基因,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为1764 bp,编码1个含有587个氨基酸的蛋白,将该基因命名为PhPP2Aa,GenBank登录号为MW847782。序列分析结果表明,该基因与其他植物PP2A核苷酸序列相似性均在80%以上,氨基酸序列与小兰屿蝴蝶兰PP2A序列相似性为99.66%。基于氨基酸序列进化分析结果表明,蝴蝶兰PhPP2Aa与小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的亲缘关系最近。将蝴蝶兰PP2A与其他7种候选内参基因（TUA、TUB、ACTIN、F-box、RPL19、RPL36及RPL41）进行实时荧光定量PCR,用3种常用内参基因分析软件对各个基因Ct值进行稳定性分析,结果表明蝴蝶兰8个候选内参基因在低温胁迫条件下表达水平最稳定的内参基因为PP2A,其次为ACTIN;最不稳定的基因为F-box,其次为TUA。以蝴蝶兰PP2A作为内参基因探讨低温胁迫响应基因PhNAC1的表达情况,结果显示蝴蝶兰PhNAC1的表达模式符合低温胁迫条件下的表达特性。该结果表明蝴蝶兰PhPP2Aa基因可作为低温胁迫条件下目的基因转录水平研究的内参基因。     

扁核木属植物叶绿体基因组特征分析

扁核木属（Prinsepia）植物在中国分布有4个种,均具有极高的食用和药用价值。为解析扁核木属植物的叶绿体基因组特征,基于现已发表的扁核木属植物叶绿体基因组,利用相关生物信息学手段进行其叶绿体基因结构、SSR、密码子偏好性和序列变异情况分析,并构建系统发育树。结果表明,2种扁核木属植物叶绿体基因组大小介于159 179~ 168 206 bp之间,平均GC含量为37.3%,从编码基因数目来看,仅相差2个tRNA,而蛋白编码基因和rRNA数目均一致,种间具有较高的保守性;在扁核木和蕤核叶绿体全基因组序列中各检测出分散重复49个,其中以正向重复和回文重复为主,占比达73%~82%,而串联重复数目分别为49个和58个,经简单重复序列SSR分析,分别在2种植物叶绿体基因组序列中分别筛选出100个和84个SSR位点,且多是以A/T碱基为主的单核苷酸重复类型;扁核木属植物叶绿体基因组密码子偏好性分析发现GC3的碱基含量显著低于GC1和GC2,说明密码子偏好以A、U结尾,ENC取值均大于48%,表明其密码子偏性较弱,中性绘图和PR2-plot分析发现自然选择是影响扁核木属植物密码子使用偏好性的主要原因,通过建立高、低基因表达库,以RSCU值为参考,确定了6个扁核木属最优密码子。经叶绿体基因组序列变异分析,根据核苷酸多态性指数Pi>0.015筛选出trnH-GUG-psbA,psbZ-trnG-UCC-trnfM-CAU-rps14和psaJ-rpl33-rps18等3个高变区,以蕤核叶绿体基因组为参考,在扁核木叶绿体基因组编码区发现存在大量的插入、缺失和SNP突变位点,并在蕤核叶绿体基因组中发现了多个该物种的特有基因。基于叶绿体基因组的trnS-trnG间隔区构建的系统发育树显示,4种扁核木属植物可分为南系（扁核木、台湾扁核木）和北系（蕤核、东北扁核木）两类。研究结果可为扁核木属植物的系统发育、分类鉴定及其资源的开发利用等相关研究提供理论基础。     

巴西橡胶树HbGRF基因的克隆、物理定位及表达分析

生长调控因子（growth-regulating factors,GRF）是植物特有的一类转录因子,该转录因子家族成员数目较多,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以巴西橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为材料,通过RT-PCR方法进行HbGRF基因的克隆;利用生物信息学的方法对其蛋白序列、理化性质、基因结构、进化关系进行分析;利用IS-PCR技术和FISH技术对其进行物理定位分析;采用qRT-PCR对橡胶树中HbGRF基因的表达模式进行研究。结果表明：在橡胶树雌花中克隆到3个GRF基因,分别命名为HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3,分子量分别为65.663、41.188、52.858 kDa,其编码的蛋白长度分别为609、384、494 aa,均为不稳定蛋白;3个基因均具有GRF完整的特征结构域WRC和QLQ,分别属于3个不同亚族。基因物理定位结果表明,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因分别位于橡胶树染色体的第11号长臂、第5号短臂和第9号长臂上,基因到着丝粒的平均百分距离是77.65、42.66和65.27。表达结果显示,橡胶树3个HbGRF基因在茎尖、雌花等生长旺盛的组织中表达量较高,用外源赤霉素和脱落酸处理后,发现表达量呈上升趋势,经过48 h后表达量和初始值基本持平,3个基因在茎尖、雌花中有明显的表达特异性,可能在橡胶树花芽分化及雌花的发育过程中起到了重要作用。该结果为研究橡胶树HbGRF基因的功能及作用机制奠定了理论基础,为橡胶树精准育种提供了分子细胞学依据。     

巨尾桉EuGR1基因的克隆及其低温胁迫下的表达特性分析

本研究通过反转录PCR方法克隆了巨尾桉谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,简称GR）基因,该基因定位于巨尾桉细胞质、长度为1485 bp,在NCBI申请基因注册（GenBank Accession Number KU904639）。构建了pET-EuGR1原核表达载体,酶活检测表明转化菌株GR活性较高。利用实时定量 PCR分析巨尾桉EuGR1的时空表达特性,结果表明：EuGR1的表达量随着巨尾桉叶片的成熟而降低,在幼叶中表达量最大,近根部的叶片表达量最低;在巨尾桉组培苗中,EuGR1在茎中表达量最大,叶中表达量较低,根中表达量最低。通过转基因抗寒巨尾桉温室苗研究EuGR1基因在低温胁迫下的表达模式,发现常温和低温胁迫下耐寒性强的株系其EuGR1的表达量较高（如P40、P41、P52）,耐寒性弱的株系其EuGR1的表达量较低（如P36、F44、F76）,说明巨尾桉EuGR1的表达量与植株的抗寒能力具有相关性。随着低温胁迫时间的延长,EuGR1的表达量在36 h后出现降低趋势,表明EuGR1在桉树耐低温胁迫的前期发挥作用较大。     

胡椒PnCAD基因的克隆和表达分析

木质素在植物体中具有运输水分、支撑植株和加强植物体免受侵害等功能，是苯丙烷代谢途径的重要产物之一。其中肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是该途径中重要的限速酶。本研究在胡椒转录组测序的基础上，用RACE法进行克隆，对PnCAD基因全长进行生物信息学分析，并对其蛋白进行理化性质、亚细胞定位和系统进化树等分析；最后运用实时荧光定量PCR进行分析。结果表明：克隆得到CAD基因的全长cDNA，长度为1364 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为1071 bp，编码356个氨基酸，预测相对分子量为3.879 kDa，等电点为6.27，属于亲水性蛋白；含有3个N-糖基化特征序列和9个磷酸化位点，可能处于细胞质内。结构域分析发现，胡椒CAD蛋白含有NAD(P)结合位点、多个催化锌和结构锌结合位点。系统进化树分析表明，胡椒CAD与细辛CAD6亲缘关系最近，胡椒和细辛的同源性最高为76%，均隶属于比较原始的双子叶植物。通过荧光定量分析发现，黄花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表达量升高，在8 h达到最高值，约为对照的10倍；之后在24 h时出现小幅度升高，约为对照组的6倍，之后下降。‘热引1号’胡椒的表达量在侵染8 h时达到最低，之后缓慢上升。总体来说，所有时间下黄花胡椒基因表达量均高于‘热引1号’胡椒，且差异显著。本研究结果可为今后研究胡椒抗非生物胁迫功能提供参考，为PnCAD基因的功能研究提供理论依据。