苏云金芽孢杆菌chi36基因的克隆、表达和酶活性分析

通过PCR方法从苏云金芽孢杆菌010菌株克隆出几丁质酶基因chi36,该基因开放阅读框(ORF)的长度为1 083bp,编码360个氨基酸。氨基酸序列分析表明:Bt 010的Chi36与Bt15A3、Bc28-9、Bc6E1的Chi36相似性分别为99%、99%和96%,其N-端具有27个氨基酸的信号肽序列。该蛋白归类为18家族几丁质酶,属于一种胞外酶。将chi36基因插入到PGEX-KG原核表达载体的表达框中,构建成原核表达载体并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达,酶活性测定结果表明,表达产物对几丁质有降解作用,在pH值为5.0、温度为55℃时酶活性最高。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶基因(chiD)的克隆与原核表达

以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。     

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1的克隆与表达分析

以甘蔗(Saccharum spp.hybrid)抗黑穗病基因型崖城05-179为材料,采用同源克隆法获得了1个几丁质酶基因全长cDNA序列(GenBank登录号为KF279661),命名为ScChiⅦ1,序列长907 bp,编码299个氨基酸,属于糖苷水解酶第19家族,预测为胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚类分析显示,该基因与其他植物ClassⅦ几丁质酶基因聚为一类。基因组序列(GenBank登录号为KF279662)分析显示,该基因含有2个长度分别为615 bp和86 bp的内含子。实时荧光定量分析结果表明,甘蔗黑穗病菌胁迫下,ScChiⅦ1在抗病(崖城05-179)和感病基因型(柳城03-182)中差异表达,推测ScChiⅦ1可能参与黑穗病菌胁迫的防御反应。组织特异性表达分析结果显示,ScChiⅦ1在甘蔗叶、芽、皮、肉、根中均有表达,但在芽中表达量最高,推测与该病原从蔗芽侵入有关。研究结果为进一步研究甘蔗几丁质酶基因功能及甘蔗与黑穗病菌互作机制提供了有益的信息。     

碎米荠CarKCS基因全长CDS克隆、序列分析及表达载体构建

根据KCS基因的保守性设计引物,以高神经酸含量的碎米荠叶片DNA为模板(KCS基因无内含子),克隆碎米荠超长链脂肪酸合成的限速酶β-酮脂酰- CoA合酶(KCS)基因全长CDS序列,命名为CarKCS.Blast 比对及序列分析表明,目的片段序列和GenBank上报道的拟南芥KCS18序列同源性达到87％.CarKCS全长1518bp,不含内含子,编码505个氨基酸.生物信息学分析表明,所有的酶功能活性位点的氨基酸都存在,在N端都有两个,C端有一个高度疏水的跨膜结构域;CarKCS与KCS18同属于KCS基因家族的FAE1 - like亚家族.将目的片段连接到pFCC -5941.nap表达载体,经PCR和酶切检测,证明已成功构建了pNapin- CarKCS载体.     

大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85.37%～95.31%,氨基酸的同源性为90.87%～96.47%。将该基因与表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10%SDS-PAGE分析,结果显示：诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。     

野生香蕉几丁质酶基因的克隆与序列分析

以野生香蕉叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得野生香蕉几丁质酶基因全长序列,并在GenBank登录(登录号为:FJ858155)。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)全长1115bp,包含924bp的ORF、14bp的5'非编码区、177bp的3'非编码区及17bp3'poly(A)尾。该基因开放阅读框编码307个氨基酸,分子量为32424.1u,预测的理论等电点为6.28,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区。蛋白结构分析结果表明,该基因编码蛋白为跨膜蛋白,存在于胞外。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)属于酸性几丁质酶classⅠb,与大蕉几丁质酶classⅠb相似性仅为59.4%。结构分析结果表明,该基因可能具有几丁质酶/溶菌酶特点,且在过敏反应中起重要作用。     

节瓜抗镰刀菌酸突变体内切几丁质酶基因的克隆与植物表达载体构建

根据节瓜与枯萎病菌互作构建抑制消减文库获得的内切几丁质酶基因EST序列,以节瓜抗镰刀菌酸突变体"LT3"为试材,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,获得了该基因全长c DNA序列,命名为Cq Chi I。序列测定和生物信息学分析结果表明,该基因c DNA序列全长1 139 bp,编码区在38~982 bp之间,编码314个氨基酸,蛋白质分子量为33.94 ku,等电点为8.43,具有chitinase_gluco_hydro_19及lysozome_like superfamily功能域,推测该蛋白可能兼具几丁质酶与溶菌酶活性。结构分析表明,该蛋白二级结构中α螺旋、延伸链、β转角与无规则卷曲分别占24.20%、18.15%、7.96%和49.68%,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白,1~23氨基酸预测为信号肽。其三级结构高度保守,为class I碱性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,为分泌细胞外蛋白。序列比对与系统进化分析结果显示,Cq Chi I与黄瓜、甜瓜、葫芦、苦瓜等植物几丁质酶基因亲缘关系紧密,与黄瓜碱性内切几丁质酶(XP004134833)相似性最高为85%。进一步构建了植物表达载体p Cambia1300并转化农杆菌EHA105,通过蘸花法转化拟南芥,为后续开展基因功能研究奠定基础。     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

普通小麦几丁质酶基因的克隆与表达分析

几丁质酶是植物重要的防卫因子之一,与植物抗病性密切相关。为深入了解几丁质酶基因表达及功能,先利用引物ChiF/ChiR从10份具有不同抗病性的小麦中克隆出几丁质酶基因后对其进行序列分析及原核表达分析,再利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析小麦根、茎和叶不同组织中几丁质酶基因的表达情况,并选取在小麦根、茎和叶中表达量最高的几丁质酶基因进行真菌性病害的抗性反应试验。结果表明,从10份具有不同抗病性的小麦中克隆得到5条长度约960bp的几丁质酶基因序列,其中1条序列与已公布的Chi-3基因序列(序列登录号为KJ507387)一致,其余序列命名为Cht1~Cht4(GenBank登录号为KR049247~KR049250)。序列分析表明,克隆所得序列无内含子,编码的几丁质酶属于ClassⅠb类型,也属于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。SDS-PAGE分析表明,重组质粒pE-Chi能在BL21(DE3)中表达一个33kDa左右的特异蛋白。qRT-PCR分析表明,这5种几丁质酶基因在小麦根、茎和叶中均有表达,但在不同器官中表达量差异较大,其中,叶中表达量最高,根中次之,茎中最低;同时,这5种几丁质酶基因在同一器官中表达量大小具体表现为Cht4Cht2Cht3Cht1Chi-3。选取相对表达量最高的Cht4基因验证其对真菌性病害的抗性反应,结果表明,在条锈菌胁迫下,Cht4基因在抗病材料92R137中的表达量显著高于感病材料铭贤169,并且均高于同等条件下接ddH2O的表达量。本研究扩增到的几丁质酶基因在小麦中组成型表达,说明其参与了小麦的正常生长发育过程;Cht4基因的表达受条锈菌诱导,推测其可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。     

豫麦34低分子量谷蛋白亚基一个新基因的克隆

为了解强筋优质小麦品种豫麦34的低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的基因构成,利用普通小麦LMW-GS基因特异引物,采用PCR扩增技术从中克隆得到一个LMW-GS新基因LMWY34(GenBank No.GU183486)。该基因具有LMW-GS基因的典型结构特征,编码区全长906 bp,编码302个氨基酸。推导氨基酸序列显示,LMWY34的编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,与已报道的GluD3-4位点编码的LMW-GS基因序列有很高的一致性(98.68%)。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及其亚细胞定位

以热带玉米自交系CML288为供试材料,根据拟南芥ELF4基因保守序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆了ELF4在玉米上同源基因的全长cDNA序列(GenBank上的登录号为HQ009862)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长683 bp,开放阅读框为432 bp,编码了144个氨基酸,与拟南芥、水稻的氨基酸序列同源性分别高达62%和75%,此外它们还共同包含一个高度保守的DUF1313未知功能结构域。利用基因重组技术分别构建了能够高效表达的过量表达载体pBI-ZmELF4和带有GFP标记的融合表达载体pGIT-ZmELF4-GFP,利用融合表达载体进行洋葱表皮瞬时表达实验,结果将ZmELF4定位于细胞核内,说明该基因在细胞核内起作用。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化

以黑曲霉基因组DNA为模板, 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序。DNA序列分析表明：克隆片段长为1 340 bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%。将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子。     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.     

茶树多酚氧化酶基因的生物信息学分析及原核表达

通过PCR方法扩增出迎霜品种茶多酚氧化酶（PPO）的编码区序列,并将其登录于GenBank,注册号为GQ214317。生物信息学分析表明,该基因编码区全长1800bp,编码599个氨基酸,分子式为C₃₀₀₈H₄₆₇₇N₈₁₃O₉₀₀S₁₈,存在两个铜离子结合域,没有跨膜区;进化树分析表明,茶与毛叶茶亲缘关系最近。成功构建了原核表达载体pET-ppo,并转化E. coli BL21（DE3）,实现了PPO的原核表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,在71KD处有一条特异蛋白条带,与预测大小相符。     

枇杷胚性培养物ACC氧化酶基因的克隆及序列分析

以枇杷胚性培养物（Eriobotrya japonica embryonic cultures）为材料,采用同源克隆方法,从其mRNA中分离得到ACC氧化酶（ACO）基因EjACO-1,在GenBank中登录号为GQ377219。结果表明：EjACO-1大小为 1 160 bp,编码322个氨基酸。枇杷EjACO-1与苹果、桃和梨等蔷薇科植物同源性较高,而与水稻、石斛兰等单子叶植物距离较远。此外,从枇杷基因组DNA中分离了转录为EjACO-1 mRNA的基因gACO,大小为1 517 bp,在GenBank中的登录号为GU233743。生物信息学分析显示,gACO基因中含有3个内含子,大小分别为114、240、194 bp,均符合真核生物内含子通用的GT-AG法则。EjACO基因的克隆为以后研究乙烯在枇杷中的功能奠定基础。     

甜菜抗草甘膦除草剂基因的克隆

常规甜菜对除草剂表现为高度敏感。为了获得抗草甘膦除草剂转基因甜菜材料,通过RT-PCR技术,对草甘膦靶基因AtEPSPs（GenBank No.NM₂02267.1）的功能域进行克隆。将扩增后的片段连接到测序载体pMD 18-T,进行酶切和测序鉴定。结果表明,AtEPSPs基因的核苷酸长度为1470 bp,推断编码490个氨基酸,确认获得了抗草甘膦除草剂基因功能片段。     

小麦品种“陕253”PDI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

为进一步研究控制小麦蛋白二硫键形成的关键蛋白即蛋白质二硫键异构酶（PDI）,运用RT-PCR方法克隆出小麦品种＂陕253＂PDI基因的cDNA序列,基因登陆号为HQ911363。序列分析表明,HQ911363全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,含有PDI典型的异构酶活性的催化位点-CGHC-和内质网驻留信号肽-KDEL-。构建该基因的原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21（DE3）中经IPTG诱导表达融合蛋白,并对表达蛋白进行了纯化。SDS-PAGE及Western-blot检测证实融合蛋白诱导表达并纯化成功。