华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)LMW-GS基因的克隆和序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)的优良基因,应用PCR技术对华山新麦草低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因进行了分子克隆和序列分析.结果表明,华山新麦草LMW-GS基因( HS-LMW-1)长度为866 bp,通过提交NCBI进行同源性比较, HS-LMW-1与小麦属LMW-GS基因序列的同源性在83％以上,其中与Thinopyrum intermedium的LMW-GS基因序列(GenBank登录号:AY214454)相似性达92%,进一步将其翻译为氨基酸序列,分析结果显示它具有小麦属LMW-GS序列的典型特征,具有完整的编码区,能够编码274个氨基酸的成熟蛋白,与小麦属Glu-B3和Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性,表明 HS-LMW-1基因可能由华山新麦草的Glu-Ns3位点编码.     

小麦“陕253”低分子量谷蛋白基因的克隆与序列分析

为了挖掘和有效利用陕253中的优良基因,根据LMW-GS编码基因5′和3′端的保守序列设计引物,采用PCR方法以陕253的基因组DNA为模板进行扩增,分别回收并克隆到载体上,测序后得到11个新LMW-GS基因。GenBank登录号分别为GQ892576~GQ892580和GQ892583~GQ892588,其长度为903~1 081 bp。其中,GQ892576、GQ892585、GQ892586、GQ892587和GQ892588具有完整编码区,可分别编码305、351、298、351和307个氨基酸残基的成熟蛋白。而GQ892577、GQ892578、GQ892579、GQ892580、GQ892583和GQ892584由于在编码区内出现提前终止密码子,推测为假基因。推导的氨基酸序列结果显示:它们都具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型结构特征。     

长发带芒草y型高分子量谷蛋白亚基的鉴定与分析

为了证实长发带芒草中的y型高分子量谷蛋白亚基的存在,利用SDS-PAGE分析了3份长发带芒草的高分子量谷蛋白亚基组成,发现其y亚基的迁移率均较普通小麦中迁移率最快的D y12亚基迁移率更快,应用PCR扩增、序列测定及基因编码区体外表达等方法研究了1份材料中的y亚基,确认了长发带芒草比普通小麦中迁移率最快的D y12亚基迁移率更快的T ay亚基的真实存在及表达。研究结果证实带芒草属具有与普通小麦中相类似的y型高分子量谷蛋白亚基。     

麦胚乳贮藏蛋白组分遗传研究进展

从本世纪５０年代至今,小麦及其近缘属物种的胚乳贮藏蛋白组分的遗传及生化研究已经取得长足的进步,并已被国外许多实验室用于小麦品质改良的实践,取得了一定的成绩。全面了解麦胚乳贮藏蛋白各组分的遗传及生化研究必然有助于小麦品种改良的研究。本文就麦胚乳贮藏蛋白的主要组成部分,即麦高分子量谷蛋白、麦醇溶蛋白、麦低分子量谷蛋白等。从小麦及其近缘属物中各组分亚基编码基因的染色体定位及多态性变化,各组分亚基编码基因     

利用HPCE构建小麦LMW-GS标准图谱初探

为给不同小麦品种低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）的鉴定、品质预测提供快速、准确的方法,以黄淮麦区14个普通小麦品种为材料,首先利用SDS-PAGE和分子标记确定LMW-GS组成,然后采用改进的HPCE体系分离LMW-GS,最后通过控制变量法比对小麦品种间相同亚基以判断各LMW-GS亚基在图谱中对应的峰。结果表明,采用SDS-PAGE和分子标记相结合的方法可以更加准确地鉴定小麦LMW-GS;利用HPCE体系获得的小麦LMW-GS图谱具有很高的重复性,重复试验所得小麦LMW-GS图谱中各个峰迁移时间的相对标准偏差均在0.30%以下;通过控制变量法所建立的小麦LMW-GS图谱可以实现Glu-A3a、Glu-A3c、Glu-A3d、Glu-B3a、Glu-B3d、Glu-B3h的快速鉴定。     

小麦贮藏蛋白特性及其遗传转化

小麦籽粒贮藏蛋白由醇溶蛋白和谷蛋白组成。醇溶蛋白在组成上以单体形式存在 ,具有高度的异质性和复杂性。它决定小麦面筋的粘性。谷蛋白是由多个亚基组成的高分子聚合体 ,决定面筋的弹性。它可分为低分子量谷蛋白亚基和高分子量谷蛋白亚基 (HMW- GS)。HMW- GS具有相似的分子结构 ,即由中央重复序列、无重复的 N端和 C端组成。HMW- GS对小麦烘烤品质起着决定性作用 ,但因 HMW- GS类型不同而对加工品质的贡献大小各异。许多 HMW- GS基因已被揭示。实践证明 ,利用基因枪法 ,将 HMW- GS基因导入普通小麦的细胞核内 ,能够达到改良小麦烘焙品质的目的。随着分子生物学技术的不断发展 ,可望从营养和加工角度来改良小麦品质的特性     

节节麦的一种y-型HMW-GS的鉴定、克隆及系统进化分析

为了克隆节节麦中的HMW-GS基因,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了节节麦的HMW-GS,发现1种编码序列未知的y-型亚基,即Dy8.1t亚基。通过对目的片段的AS-PCR扩增、克隆、测序和氨基酸序列推导,发现这种未知序列具有典型HMW-GS的序列结构特征。通过与已知亚基序列比较发现,Dy8.1t与Dy10t、Dy10.4t、Dy10.5t和Dy12t在N-端序列有一个氨基酸差别(R-G)。与已知氨基酸序列的HMW-GS多序列比对和系统进化关系分析,证实Dy8.1t亚基是D基因组编码的高分子量谷蛋白y-型亚基家族的新成员。     

簇毛麦新型低分子量谷蛋白亚基的分子克隆与序列分析

为发掘低分子量谷蛋白亚基（LMWGS）新的变异类型,通过设计引物和特异PCR扩增,从簇毛麦TA2127基因组DNA中得到14个LMWGS基因,GenBank登录号分别为HQ615147～HQ615160。序列分析表明,所有基因具有完整编码区,长度为831 bp和846 bp,可编码277和282个氨基酸残基,推导的氨基酸序列分析显示,14个基因编码的蛋白序列都缺少一段N端保守区,且N端序列是一种新的类型;在14个LMWGS基因中检测到19个SNPs和1个16 bp 的缺失。系统进化分析表明,簇毛麦LMWGS与ω醇溶蛋白和HMWGS亲缘关系相对较远,与普通小麦 Glu3的低分子谷蛋白基因进化关系相对较近。     

小麦高分子量谷蛋白亚基一级结构分析

为从一级结构水平揭示小麦高分子量麦谷蛋白亚基的结构、功能及其进化上的关系,利用生物信息学软件(DNAMAN)对已在GenBank数据库中登录的22个小麦高分子量麦谷蛋白亚基序列进行了分析.结果表明,这些高分子量谷蛋白亚基平均含氮量为16.186%;其各种氨基酸含量基本恒定,其中谷氨酰胺含量最高(33.74%),且主要以QQ形式连接在一起,这种结构特点可能影响小麦面粉的加工品质;同时在一级结构序列上还发现有232个保守的氨基酸位点(56个单个氨基酸座位和一些长短不同的氨基酸片段),较大的保守性氨基酸片段主要为AEGEAS-QLQCER/HEL,GSFY PG/SETTP-QQLQQ,YYPGQAS/FP/SQQ/RP/SGQG/RQQ,PGQGQQ/PG/A/YYPTS-QQ等;分别有6组共13个序列相似度均达到100%,推测这些高分子量谷蛋白亚基在进化上具有较强的保守性.     

黑龙江省春小麦主要品质性状和慢锈抗病基因的分子标记检测

1B·1R易位系、高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)活性、黄色素含量等因素都对小麦加工品质有重要影响,慢锈基因Lr34既抗叶锈,又抗条锈、白粉和秆锈病.为了明确这些基因在黑龙江小麦品种中的分布,并为优质抗病小麦分子标记辅助育种提供材料和方法,本研究利用高分子量谷蛋白亚基Dx5 、By8、1B·1R易住系、PPO、PSY基因和Lr34位点的特异性分子标记对黑龙江省不同地区的169份小麦品种进行鉴定.结果表明,Dx5亚基的频率为43.2％,By8亚基的频率为30.8％,1B·1R易位系的频率为4.7％,Ppo-A1b的频率为33.1％,Psy-A1b的频率为33.7％,含Lr34位点的频率为24.9％;不含1B·1R易位系、同时又具有Dx5和By8、Ppo-A1b、Psy-A1b及Lr34位点的品种只有2份,占1.2％.     

西农538 LMW-GS基因的克隆、原核表达及功能鉴定

为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。     

伊斯帕汗小麦NAM-B1基因序列与蛋白质含量变异的分析

野生二粒小麦(Triticum dicoccoides Krn.,AABB,2n=4x=28)NAM-B1基因的表达可以加速植株衰老,促进叶片营养向籽粒转移,提高籽粒蛋白质、铁、锌等物质含量。本研究采用同源克隆方法从6份伊斯帕汗小麦(T.ispahanicum Heslot,AABB,2n=4x=28)中克隆得到5个NAM-B1基因。它们具有典型的NAM基因核苷酸结构特点,均含有3个外显子和2个内含子。与已报道的NAM-B1基因比对分析发现,居群PI330548中的NAM-B1基因因核苷酸序列上第11位点T的插入而引起移码突变,具有无功能型基因的结构特征,其他4个则具有功能类型基因的结构特征。4个功能类型NAM-B1基因的推导氨基酸序列一致性高达99.7%,它们之间仅有5个氨基酸的变异。供试的6份伊斯帕汗小麦之间籽粒蛋白质含量(GPC)存在显著差异。与高GPC材料PI346782相比,低GPC材料PI572904的NAM-B1基因编码氨基酸序列中存在2个位点的变异,分别为NAC域内的C亚区第88位Q→R和TAR区域第364位P→R的替换。推测伊斯帕汗小麦GPC的变异与其NAM-B1基因的这些突变存在一定关系。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

小麦NAC转录因子的基因克隆与序列分析

为了深入研究小麦中NAC家族转录因子基因,针对NAC基因家族成员,设计了覆盖其全长编码区的1对特异引物,从陕253小麦品种中克隆了2条大小分别为1 463、1 549 bp的片段,命名为TaNAC2、TaNAC4( GenBank登录号为HQ872050HQ872051)。序列分析表明,这2个序列包含典型NAC的完整编码序列,包括两个内含子,具有完整的开放阅读框;推导的氨基酸序列分别为383、405个,这2个基因在N端均具有NAC基因的典型DNA结合结构域,即 NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的 A、B、C、D、E 5个亚区高度保守,仅在C亚区出现一个氨基酸的差异LM,而且在CD区出现罕见的半胱氨酸变异,此发现对于小麦品质的研究非常重要。同时发现这 2个NAC类转录因子都不含有核定位信号（NLS）,但是有相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,证实克隆序列属于NAC基因家族成员,并且发现的TaNAC4属于NAC转录因子家族的NAM亚组,TaNAC2属于NAC转录因子家族的CUC亚组。     

剑麻AsLEC基因克隆及生物信息学分析

单子叶甘露糖结合植物凝集素基因能够有效抑制具有刺吸式口器的同翅目害虫的生长与繁殖,它被证实在掌叶半夏、小麦、烟草、棉花等单子叶和双子叶植物中均具有较好的抗虫效果,但其在剑麻中的功能尚缺乏深入研究。本研究以剑麻为材料,利用RT-PCR技术成功克隆剑麻lectin基因,命名为AsLEC,并对其进行生物信息学分析。结果表明:该基因CDS序列全长为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质分子量预测为19.97 ku,理论等电点为4.96,为疏水性蛋白;同源氨基酸序列比对结果表明剑麻lectin基因与火烧兰、雪花莲、君子兰与菠萝等植物的单子叶甘露糖结合凝集素基因同源性较高,氨基酸匹配度达到48%以上,系统进化树分析表明AsLEC基因与火烧兰亲缘关系更近;对AsLEC基因进行功能结构域分析表明其具有B-lectin基因家族典型特征,属于B-lectin基因家族成员;功能预测发现其具有一段33个氨基酸残基的信号肽,同时在N端第5~27位置处存在一个跨膜α螺旋,表明AsLEC蛋白为分泌型蛋白质,这与B-lectin蛋白的功能特点相吻合;AsLEC蛋白二级结构包含11个β折叠,3个α螺旋;亚细胞定位预测该基因很有可能定位在细胞膜上。剑麻AsLEC基因的克隆对于研究其在剑麻中的抗虫功能具有重要意义,同时丰富了单子叶植物中植物凝集素的相关研究成果。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。