巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌Hog1同源基因的克隆和序列分析

为了解MAPK信号途径中hog1基因在多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)侵染橡胶树过程中的作用,根据几种丝状真菌的hog1基因设计简并引物,采用PCR和RT-PCR的方法扩增巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CC01的hog1基因,并对其扩增产物进行测序,同时还对该基因编码的蛋白进行氨基酸序列比对和系统发育分析.结果表明:该基因开放阅读框架为915 bp,编码304个氨基酸残基,包含6个内含子;该基因的氨基酸序列与小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophora tritici)MAPK HOG1(XP_001935555.1)、谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)MAP kinase ClK1(AFJ42499.1)等高度同源.     

国内橡胶树多主棒孢Cassiicolin毒素多样性及致病性分析

由多主棒孢引起的棒孢霉落叶病是橡胶树的主要叶部病害,cassiicolin毒素是病菌的主要致病因子。本研究通过ITS序列分析对供试多主棒孢菌株进行了准确鉴定,利用cassiicolin毒素不同亚型编码基因特异引物对不同地理来源和寄主来源的49个多主棒孢菌株毒素类型进行了分析,并利用生物萎蔫法对不同亚型毒素进行了致病性分析。结果显示,78%供试菌株含有cassiicolin基因,其中Cas2亚型有10个菌株,Cas5亚型有28个菌株,其它为Cas0型(未检测到cassiicolin毒素基因)。含有Cas5亚型的菌株均来源于橡胶树,并且为橡胶树上的优势群体;Cas2亚型菌株则来源于橡胶树、黄瓜、番木瓜和木薯等不同作物;Cas2和Cas5毒素对不同橡胶树品种的致病性存在明显差异。     

巴西橡胶树主要种质对棒孢霉落叶病抗性评价

由多主棒孢(Corynespora cassiicola)引起的橡胶树棒孢霉落叶病已成为影响天然橡胶产量的主要限制因素。本实验对从我国海南、云南和广西等地分离得到的17个橡胶树多主棒孢病菌菌株进行了致病性测定,获得强致病力菌株HC-10。分别用该菌株菌丝体接种鉴定、粗毒素叶片穿刺接种和叶片萎蔫生物鉴定等3种方法对我国选育的45个巴西橡胶树品种进行抗病性评价。结果表明,不同橡胶树品种对棒孢霉落叶病的抗性水平存在明显差异。在供试的45个品种中,不同抗性评价方法的鉴定结果基本一致,抗病品种占13.3%~17.8%;轻感病品种占66.7%~73.4%;易感病品种占11.1%~17.8%。     

借助ITS序列用GFP标记巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌

由多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)侵染引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是影响橡胶树产胶量的主要病害之一。为了开展该病原菌在活体叶片中的病理学研究,本实验将绿色荧光蛋白gfp基因表达盒插入了多主棒孢菌经定点突变后的ITS序列中,构建了重组质粒p ITGH,并经PEG介导转化了原生质体,获得了GFP标记的多主棒孢菌转化子,所获得的转化子经过连续7次转接培养后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌丝中稳定地发出强烈的绿色荧光,其生长特性和致病性与野生菌株无明显差异。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌Slt2类MAPK同源基因CMP1的克隆与序列分析

根据几种丝状真菌Slt2类MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei]中扩增出MAPK同源基因的部分片段,再利用染色体步移法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为CMP1(GenBank Accession No.GU321364)。序列分析表明,该基因含有5个外显子和4个内含子,编码417个氨基酸的多肽,推测分子量为47.5 ku,等电点为5.57。CMP1含有一个参与双重磷酸化作用的MAPK蛋白激活域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的MAPK,AAslt2和MAP-kinase等高度同源。系统聚类结果显示,该基因与白菜黑斑病菌(Alternaria brassicicola)、细交链格孢菌(A.alternata)和玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)的Slt2类MAPK基因具有较高的同源性。Southern杂交分析表明,CMP1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌基因组中以单拷贝形式存在。     

香蕉枯萎病菌fga1基因的克隆与序列分析

为了解fga1基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的fga1基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析.研究结果表明2个生理小种fga1基因开放阅读框均为1 062 bp,编码353个氨基酸,基因同源性为99.5%,氨基酸序列相同.推测fga1基因可能与香蕉枯萎病菌自身繁殖和附着胞的形成有关.从fga1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与fga1基因并无明显对应关系,这为进一步研究fga1基因功能奠定了基础.     

橡胶树抗病相关基因HbNPR1的克隆及其表达分析

前期利用cDNA-AFLP技术分离获得了一个与橡胶树抗棒孢霉落叶病反应相关的差异表达基因片段EST-IAN-188,通过Blast比对分析发现,该基因片段与植物抗病相关NPR基因家族中的NPR1具有高度的同源性。将该片段与橡胶树基因组序列进行比对,设计引物进行PCR扩增,得到了一个橡胶树NPR1基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNPR1基因。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)1 374 nt,含有两个外显子和一个内含子,编码457个氨基酸,蛋白分子量为51.0 ku,等电点5.82,具有BTB/POZ、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域。qRT-PCR定量分析发现,HbNPR1基因在橡胶叶片中的表达丰度最高,特别是古铜期叶片;多主棒孢病菌(Corynespora cassiicola)诱导下HbNPR1基因在抗病品种(IAN873)的表达丰度明显高于感病品种(PR107);另外,SA、MeJA、ET处理下均能诱导HbNPR1基因的表达,SA处理后的表达量丰度最高。本研究初步表明,HbNPR1基因可能参与橡胶树抗病信号途径的调控和寄主对病原菌侵染的防御反应。     

我国热带作物多主棒孢种群多样性及致病力分化分析

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一种全球分布的重要植物病原真菌,寄主范围十分广泛。近年来,该病原菌侵染危害多种热带作物,并在局部地区大面积暴发流行,造成巨大的经济损失。本研究利用核糖体转录间隔区（Internal transcribed spacer, ITS）、翻译延伸因子（translation elongation factor 1 alpha, EF-1α）、β微管蛋白（β-Tubulin, TUB）,对来自橡胶树、木薯、番木瓜和瓜菜等多种热带作物的70株多主棒孢进行种群多样性分析。结果发现,利用最大似然法,在相似系数为0.97时可将供试菌株划分为两大遗传类群：类群Ⅰ为国内和一些国外橡胶树的多主棒孢;类群Ⅱ为其他寄主多主棒孢,遗传类群与寄主来源具有显著的相关性。致病力测定表明,多主棒孢种内致病力分化明显,类群Ⅰ的橡胶树多主棒孢仅能侵染橡胶树,不能侵染其他寄主,具有明显的寄主专化性,且不同地理来源的菌株致病力差异不显著。类群Ⅱ的多主棒孢在不同寄主间可以相互侵染,但菌株在致病力和发病症状上存在一定差异,表现出对其原寄主的高度致病力。多基因序列聚类分析与致病力分化分析结果具有较好的一致性,这为研究我国热带作物多主棒孢的种群结构、主要致病型以及为多主棒孢病害的发生、流行和防治提供了理论依据。     

橡胶树HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2的表达分析

植物营养储藏蛋白VSP2是HAD家族蛋白(haloalcanoic acid dehalogenase super family,HAD)的主要成员之一。该蛋白具有酸性磷酸化酶的功能,在橡胶树氮素储存和植物凝集素防御胁迫中发挥着重要的作用。在前期研究中,利用c DNA-AFLP获得了1条与橡胶树棒孢霉落叶病抗病性相关的差异表达片段EST-IAN-24,通过Blast比对分析,发现该基因片段与其他物种的VSP2基因具有较高同源性。采用PCR和RT-PCR技术,克隆获得了一个橡胶树VSP2基因的c DNA和基因组序列,并将该基因命名为Hb VSP2。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)975 bp,含有4个内含子和5个外显子,编码324个氨基酸,推测该蛋白的分子质量为30.01 ku,等电点为4.80。该基因蛋白是HAD家族蛋白中的酸性磷酸酶,具有DXDXT基序特征。q RT-PCR定量分析发现,受多主棒孢病菌侵染后,Hb VSP2基因在橡胶树抗、感品种中的表达量存在着明显的差异,抗病品种(IAN873)的表达量显著高于感病品种(PR107),且在接种12 h达到了峰值;此外,该基因在水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯的处理下均能诱导其表达,对茉莉酸甲酯的敏感性明显高于其他2个激素。本研究初步表明,Hb VSP2基因可能参与橡胶树与多主棒孢病菌的互作并且与抗病性相关。     

橡胶树多主棒孢菌rDNA–ITS区的分子鉴定及检测

以来自国内外的18个多主棒孢病菌[Corynespora cassiicola(Ber.&Curt.)]菌株为研究材料,提取其基因组DNA进行rDNA-ITS区序列扩增,并进行了5.8S rDNA及其两侧ITS序列分析.序列分析结果表明,种内各菌株间ITS序列同源性高达99.9%以上,部分菌株间出现个别碱基的差异.根据ITS区序列设计的一对特异引物(CorP1/CorP2)可以在供试的多主棒孢病菌中扩增出1条约277 bp的特异谱带,其余18个参试菌株和橡胶树叶片组织未能扩增出该特异谱带,检测灵敏度可达浓度为0.1 pg的目标DNA.     

杜鹃红山茶离体快速繁殖

以杜鹃红山茶实生小苗为试验材料,探讨离体快速繁殖的方法。结果表明:茎段外植体在MS+BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L+GA3 10 mg/L的培养基上培养60 d,侧芽萌发率高达68%;将这些萌发的侧芽连同原来的茎段外植体移至添加BA 0.2～0.4 mg/L的培养基培养1个月,74%的侧芽能够继续生长并形成丛生芽;再将丛生芽移至1/2 MS+IBA 4 mg/L+0.1%活性炭的培养基上培养1个月,得到大量伸长的芽条;将芽条切离母体后插植于1/2 MS+IBA 8 mg/L的培养基,60 d后生根率达到90%。通过以上过程繁殖得到的小苗质量良好,移栽1个月后的成活率可达90%。     

山蒟对椰心叶甲的生物活性研究

研究了山蒟对椰心叶甲不同虫态的杀虫活性,旨在丰富防治椰心叶甲的植物源农药。采用胃毒法测定山蒟石油醚提取物对椰心叶甲5龄幼虫及成虫的生物活性。结果表明,山蒟对椰心叶甲5龄幼虫LC50为3.871 0 mg/mL;对成虫为11.496 5 mg/mL;采用触杀法测定山蒟对椰心叶甲卵的毒杀活性,对卵孵化抑制LC50为4.768 5 mg/mL,山蒟抑制卵发育到1龄末幼虫的LC50为3.766 7 mg/mL。     

Screening of Natural Plant Volatiles to Control the Potato ( Solanum tuberosum ) Pathogens Helminthosporium solani , Fusarium solani , Phoma foveata and Rhizoctonia solani

The potential utility of natural volatiles in various essential oils (EOs) from plants as fumigants to control potato tuber (Solanum tuberosum L.) pathogens was assessed. The antifungal effects of the volatiles at various concentrations were studied at 10 °C both in vitro using conidial suspensions of Helminthosporium solani, Fusarium solani var. coeruleum and Phoma foveata plated on agar, and in vivo by inoculating potato tubers. The effects of the volatiles on the mycelial growth of Rhizoctonia solani were also studied, but only in vitro. Vapours of many of the EOs tested exhibited some fungicidal activity but volatiles of garlic, Allium sativum, were, with few exceptions, most effective on all four pathogens in all experiments. An exposure time of at least 2 weeks was usually required for good control of disease development in vivo. Vapours of A. sativum never stimulated conidial germination, as was observed with some other oils, or damaged tubers, but those of Armoracia rusticana caused tuber collapse. Volatiles from thyme (Thymus vulgaris) EO showed antifungal activity in vitro on all four pathogens, but did not control F. solani, P. foveata or H. solani in vivo. In contrast, sage (Salvia officinalis) EO was ineffective against P. foveata and H. solani in the in vitro system, but controlled disease development in vivo at similar doses. The sometimes conflicting results obtained in the two test systems show that screening in vitro only is insufficient for evaluation of potent antifungal substances to be used in practice.     

Prior weakening of Macrophomina phaseolina and Fusarium propagules for enhancing efficiency of Brassica amendments

In a two year field study, the effect of varying intensities of sub-lethal heating on the efficiency of Brassica amendments in controlling viable populations of Macrophomina phaseolina and Fusarium oxysporum f sp. cumini was determined in an arid region of India. After 30 d of dry summer exposure of pathogen infested soil, incorporation of mustard residues and oil cake (0.18% and 0.04% w/w) and then applying one irrigation caused significant reduction by 75.3–81.3% in viable counts of M. phaseolina that causes dry root rot of legumes and by 93.9% in counts of F.o. f. sp. cumini causing wilt of cumin (Cuminum cyminum L.) at 0–15 and 16–30 cm depths. Increasing duration of summer exposure to 60 d improved the reductions in viable propagules of M. phaseolina by 83.6–90.4% and in F.o. f. sp. cumini by 78.2–94.8% at same soil depths. At certain heat levels, reduction in viable population of Fusarium due to amendments and irrigation was greater than that recorded in Macrophomina. Significantly low levels of reduction in pathogenic propagules of Macrophomina (63.9–71.4%) and Fusarium (48.0–57.2%) under shade compared to unshaded conditions indicated that mild heating did not cause discernible weakening effect. In second season also, 89.2–91.5% and 78.5–95.8% reduction in counts of Macrophomina and Fusarium, respectively was achieved by the application of amendments after 60 d of summer exposure at 0–30 cm soil depth. These results suggested a new approach to improve the control of soil-borne plant pathogens in hot arid regions by combining prolonged sub-lethal heating, effective naturally available on-farm wastes as soil amendments and one summer irrigation.     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

引发小麦赤霉病和茎基腐病禾谷镰孢菌的生物防治初探

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是小麦上的重要病原真菌。通过致病性测定从江苏小麦茎基腐病病害样本分离菌中筛选到了对小麦赤霉病和茎基腐病都有强致病力的F.graminearum菌株GF1117。为了对F.graminearum进行生物防治,利用稀释涂布平板法和平板对峙法从小麦不同生境中分离筛选到35株对GF1117具有明显拮抗效果的细菌菌株,分别在田间和温室进行了小麦赤霉病和茎基腐病的生物防治试验。结果表明,35株拮抗细菌对小麦赤霉病均有一定的防治效果,且在小麦感病品种和中抗品种上对茎基腐病的防效不同;菌株1-8对两种病害的防效都在45%以上。     

拮抗香蕉枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离筛选

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的,目前尚缺乏有效的防治方法,木霉菌是重要的植物病害防治菌,广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性,能杀伤多种重要的植物病原菌且作用机制多种多样。笔者从广东湛江、海南儋州等地152份土样中分离出330株木霉,通过对峙法对木霉菌进行体外拮抗作用测定及评价,选出10株对尖孢镰刀菌有较好拮抗效果的木霉菌;并测定无菌土中木霉与病原菌的种群动态变化,结果表明木霉在土壤中对病原菌有一定的抑制作用。     

新疆杂草黑麦染色体核型分析

为了对新疆杂草黑麦的种质鉴定、起源分析、良种培育和遗传多样性研究提供依据,采用常规压片法制片结合显微摄影技术,分析了3个新疆杂草黑麦居群和1个栽培黑麦品种的核型并比较他们的异同点.结果表明,四种黑麦材料的染色体均为二倍体,染色体数目为14,不同材料之间染色体形态具有丰富的多态性.新疆杂草黑麦居群89R4的染色体核型公式为2n=2x=14=12m+ 2sm,除第7对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型不对称系数为61.70％,核型类型为1A型,属于基本对称型.新疆杂草黑麦居群89R14的核型公式为2n=2x=14=8m+ 6sm(2sat),除第5、6、7对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,其第7对染色体具有随体,核型不对称系数为60.88％,核型类型为2A型,属于基本对称型.新疆杂草黑麦居群89R60的核型公式为2n=2x=14=14m(2sat),其全部染色体均为中间着丝粒染色体,第3对染色体具有随体,核型不对称系数为60.47％,核型类型为1A型,属于基本对称型.栽培黑麦材料H36的染色体核型公式为2n=2x=14=10m+ 4sm,除第5、6对为近中着丝粒染色体外,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型不对称系数为61.20％,核型类型为1A型,属于基本对称型.     

玉蜀黍尾孢菌CzVelB基因功能分析

以获得的野生型和CzVelB敲除突变体菌株为供试菌株，分别对其进行生物学及致病力测定，在此基础上分析毒素和细胞壁降解酶的活性。结果表明，与野生型相比，敲除CzVelB后菌丝生长速率及颜色无明显差异，但产孢量下降56.6%，且孢子萌发率下降，萌发过程滞后1 h。致病性分析发现，敲除CzVelB后菌株致病性明显下降，病情指数、病斑大小，突变体均低于野生型。分析毒素对叶片的致病性发现，突变体所产生的毒素低于野生型产生的毒素。敲除突变体菌株ΔCzVelB及野生型菌株在活体内外均能产生5种细胞壁降解酶，其中敲除CzVelB后，5种离体病原菌细胞壁降解酶活性明显下降。分析侵染过程中5种细胞壁降解酶发现，CzVelB主要通过影响CX和PMG在接种前期12 h内起重要作用；在接种后期(72～96 h),CzVelB主要通过影响PGTE的活性调控玉蜀黍尾孢菌致病力。     

巴西橡胶树AnnHb1基因的克隆及表达分析

根据一个从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码annexin的cDNA,命名为AnnHb1。序列分析表明,AnnHb1长为1 198 bp,含有945 bp的阅读框,62 bp的5'-UTR和191 bp的3'-UTR,编码314个氨基酸,分子量为35.99 ku,等电点为8.18。该氨基酸序列与蓖麻、麻疯树、棉花、苜蓿、烟草和拟南芥中的annexin的同源性分别为82%、72%、72%、64%、60%和60%。半定量RT-PCR分析结果表明AnnHb1基因在愈伤、花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在愈伤组织中表达量最低,树皮中表达量最高。