茶树多酚氧化酶成熟蛋白的原核表达

茶树多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）对茶产品的品质形成具有重要作用,一直是人们研究的重点,但至今未见体外表达茶树PPO的报道。笔者在原核中表达纯化获得具有催化活性宜红早PPO的基础上,成功表达纯化获得切除转移肽的宜红早PPO成熟蛋白,该蛋白的比活力比全蛋白高约3倍,并发现转移肽对PPO活性具有抑制作用,这为茶树高活性PPO工程蛋白在体外大量制备及应用提供了基础。     

抑制尖孢镰刀菌人工肽适体的筛选和鉴定

香蕉枯萎病严重危害香蕉产业的发展。本研究从肽适体文库中筛选获得对香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌有抑制作用的人工肽适体SNP-D4。通过构建人工肽适体体外重组表达载体,获得SNP-D4体外重组蛋白。结果表明,通过抑菌活性检测表达人工肽适体SNP-D4的大肠杆菌全蛋白提取液,能够特异性抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发,使其萌发率降低至19.60%。本研究筛选得到的人工肽适体SNP-D4可应用于研发环境友好型特异抗真菌生物制剂,为香蕉枯萎病防治提供新的技术手段。     

丰水梨多酚氧化酶基因的克隆与原核表达

通过PCR方法克隆丰水梨PPO基因全长,并将其登录Genebank,登录号JQ861265。基因全长1782 bp,无内含子,编码的PPO属于亲水性蛋白质,无跨膜结构,含有593个氨基酸,分子量约为65.8 k Da,理论等电点为8.4。N端含有一段由47个氨基酸组成的转运肽。去除转运肽的成熟PPO分子量为60.8 k Da,理论等电点为6.69。PPO中含有两个铜离子结合区,主要位于PPO二级结构中的α-螺旋区域中。原核诱导目的蛋白在诱导3~6 h后积累量较大。诱导蛋白(PPO前体和成熟PPO)均能氧化儿茶素形成茶黄素。     

橄榄多酚氧化酶基因(PPO)克隆及其试管苗离体保存过程中的表达分析

以来源于橄榄成熟胚的橄榄试管苗为材料,进行PPO基因克隆,比较试管苗不同保存阶段PPO基因转录水平和PPO酶活性的变化。结果表明:克隆获得1个PPO基因全长cDNA序列,命名为PPO2,GenBank登录号为JQ319005,cDNA全长序列为1 934 bp,推测出橄榄PPO开放阅读框(ORF)1 818 bp,编码606个氨基酸。橄榄PPO2属于碱性、亲水、非分泌蛋白,可能定位于线粒体基质空间,具有3个典型的保守结构域,丝氨酸磷酸化占主导地位,并且二级结构以不规则卷曲为主。而三级结构预测表明,橄榄试管苗PPO2蛋白主要由α螺旋和不规则卷曲组成;进化树分析显示橄榄PPO蛋白与胡杨PPO关系最近,而与葡萄和莲的亲缘关系较远;qPCR分析显示,PPO2基因在橄榄试管苗不同保存阶段都有表达,但在橄榄试管苗保存1个月幼叶比较多时PPO2基因的表达量最高;而橄榄试管苗在分别保存1、2、3、4、5个月时PPO活性变化趋势不明显,当保存时间到6、7、8个月时PPO活性急剧增加。因此,PPO基因可能与幼嫩组织的启动分化有关,并在橄榄试管苗生长发育过程中发挥重要作用。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。     

香蕉β-淀粉酶基因家族的系统进化分析

β-淀粉酶(beta-amylase,Bmy)是一类关键的淀粉水解酶,在香蕉果实成熟淀粉降解转化为可溶性糖的过程中发挥着重要的作用。为了全面了解Bmy基因在香蕉基因组中的特征,研究基于香蕉基因组数据,通过生物信息学的方法对香蕉Bmy基本理化性质、二级结构预测、亚细胞定位、内含子和外显子结构和保守结构域进行初步的预测与分析,并构建系统发育树。结果表明:编码香蕉β-淀粉酶的基因有15个,根据在染色体的位置命名为Ma Bmy1~15,Ma Bmy基因家族编码的氨基酸范围在68~1 453 aa,编码的蛋白相对分子量介于7.8~162.6 ku之间,15个Ma Bmy蛋白中有10个偏酸性,5个偏碱性。不稳定指数分析发现6个Ma Bmy蛋白为稳定蛋白;疏水性分析表明,所有的Ma Bmy蛋白为亲水性蛋白;香蕉Ma Bmy家族内含子最少含有2个,最多的含有10个;进化分析表明,Ma Bmy家族分4个亚家族,且与水稻的亲缘关系较近。研究结果为深入探讨Ma Bmy基因的功能及调控香蕉果实成熟的应用奠定基础。     

低温-干旱交叉胁迫对东农冬麦1号地下茎蛋白表达的影响

为给寒地冬小麦抗逆性的分子育种提供依据,采用蛋白质双向电泳及质谱技术,对不同低温-干旱交叉胁迫下抗寒品种东农冬麦1号地下茎的蛋白质表达进行了比较分析。结果表明,在pH 4~7范围内,在东农冬麦1号地下茎蛋白表达图谱中发现25个蛋白点在低温-干旱交叉作用下的表达量与单独低温胁迫下有明显差异,其中9个蛋白点在干旱-低温交叉作用下表达量上调,16个下调。对差异蛋白点进行质谱分析,并通过数据库检索进行蛋白质鉴定,得到完整的肽指纹图谱,其中逆境诱导蛋白占26%,代谢相关蛋白占38%。     

香蕉果实的1个14-3-3蛋白同源基因的克隆及序列分析(简报)

根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的1个14-3-3蛋白基因片段,采用PCR和RACE相结合的方法从香蕉(Musa acuminate L.AAA group cv.Brazilian)cDNA文库中筛选到其全长cDNA序列.序列测定和Blastx比对分析结果表明,该cDNA全长1 037 bp,含有1个完整的阅读框,其编码区编码261个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的保守结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的同源性,将其命名为Ma-14-3-36(Musa acuminate 14-3-3).采用遗传进化系统发育树的分析结果表明,Ma-14-3-36与来源于单子叶植物的多数14-3-3蛋白基因序列在同一个进化枝上.采用RT-PCR对其在香蕉果实发育不同时期的表达进行分析结果表明,在香蕉果实发育的不同时期差异表达,推测其可能在果实的发育中起作用.     

香蕉TGA转录因子家族的鉴定及枯萎病菌胁迫下的表达分析

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense, Foc）引起的香蕉枯萎病是我国香蕉的主要病害之一,严重影响香蕉的产量和品质。TGA防御反应基因在香蕉应对尖孢镰刀菌胁迫的应答转录调控过程中至关重要。本研究以拟南芥TGA转录因子家族成员蛋白为查询序列,在香蕉基因组数据库中Blast筛选出TGA转录因子家族成员,并对该家族成员进行生物信息学分析。共鉴定得到9个香蕉TGA家族成员,分别命名为MaTGA1~MaTGA9;香蕉TGA家族蛋白富含酸性氨基酸,大部分蛋白以α螺旋为主;亚细胞定位主要在细胞核内。进化树分析表明,香蕉MaTGA转录因子家族的9个成员可分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类,基因结构及功能结构域的分布情况也呈现出高度一致。进一步通过RT-qPCR分析发现,MaTGA2、MaTGA3和MaTGA8在香蕉枯萎病菌侵染后的‘威廉斯’（易感病）及‘南天黄’（抗病）中均显著下调表达,MaTGA1、MaTGA6、MaTGA7和MaTGA9均呈现先下降后上升的趋势;然而MaTGA4和MaTGA5仅在‘威廉斯’中上调表达,以上结果表明MaTGA2、MaTGA3和MaTGA8在香蕉抗枯萎病中发挥重要的生物学功能。本研究结果为香蕉TGA转录因子功能挖掘奠定理论基础。     

香蕉中 8 个 WRKY 转录因子的克隆及表达分析

WRKY 转录因子在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为了解香蕉 WRKY 转录因子的功能,本研究 在香蕉根系中克隆了 8 个 WRKY 家族基因,与香蕉基因组数据库比对后,将其分别命名为 MaWRKY2、MaWRKY21、 MaWRKY44、MaWRKY47、MaWRKY125、MaWRKY136、MaWRKY139 和 MaWRKY147。序列分析和遗传进化树结果表 明,MaWRKY2 和 MaWRKY47 属于第 I 类家族,其余 6 个属于第 II 类家族。对 8 个基因在香蕉的根、球茎、假茎、 叶、花和果中的表达进行分析,结果表明,这 8 个基因在所有的器官中均表达,说明这些基因在香蕉的生长发育过程 中起作用。对 8 个基因在盐、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸、ABA、乙烯和香蕉尖孢镰刀菌生理 4 号小种胁迫处理的 香蕉苗根系中的表达进行分析,结果表明 8 个基因对这些胁迫均有响应,说明香蕉中的这 8 个 WRKY 基因参与了生物 胁迫、非生物胁迫和激素信号途径。     

香蕉MaTPS4基因序列及表达特性分析

通过随机克隆测序法从香蕉根系c DNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS4,全长c DNA序列为2 930 bp,含一个完整的开放阅读框2 574 bp,编码857个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS4蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,pI5.59,结构域TPS和TPP。序列预测分析表明,MaTPS4蛋白定位于细胞质中,具有3个跨膜区域,不存在信号肽。与其他已知植物TPS氨基酸序列同源比对,同源性达到84.90%;进化关系分析表明,香蕉MaTPS4氨基酸与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)聚为一类,二者亲缘关系较近,同源性为99%。器官特异性分析表明,MaTPS4在香蕉根系、球茎、假茎、叶、花、果实各器官中均有表达,其中球茎、假茎、叶片和花中表达量较大,根及果实中表达量极少。q RT-PCR分析表明,MaTPS4在根系中的表达经干旱、盐胁迫后均增强,其中盐胁迫24 h时MaTPS4表达量较0 h时高5倍;冷胁迫下,MaTPS4表达量增加,并随时间延长下降,在6 h达到最大;ABA胁迫下,MaTPS4表达量增加,为0 h的5倍;在ACC和Foc TR4胁迫下,MaTPS4表达无变化。因此,MaTPS4可能通过依赖ABA途径调控抗逆胁迫相关基因表达,提高植株对非生物胁迫的抗逆性。     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。     

茶叶多酚氧化酶的序列分析与结构预测

调用生物信息学方法对已在国际互联网上的生物数据库(DDBJ、Uni-Prot)注册的茶树多酚氧化酶基因的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓扑结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构进行预测与推断。结果表明:茶多酚氧化酶不具有信号肽,存在卷曲螺旋,为位于细胞质中的无跨膜的亲水性不稳定蛋白,无规则卷曲是其蛋白质结构的主要结构元件,α-螺旋与β-折叠分散于整个多肽链中,并存在2个结构功能域。     

香蕉后熟果皮差异蛋白分析及其基因克隆的研究

提取乙烯诱导香蕉后熟初期的果皮总蛋白和对照果皮总蛋白,进行双向电泳实验,利用ImageMaster软件找出乙烯诱导的香蕉果皮中的差异蛋白点,并且对差异蛋白进行质谱分析,选取一个可能为Ⅲ类酸性几丁质酶(MaCHⅢ)的蛋白进行后续研究.利用MaCHⅢ的肽段信息在NCBI上比对后找到与该蛋白相应的核酸信息,设计PCR反应引物,扩增MaCHⅢ基因,得到DNA全长序列.结果表明,该基因与Ⅲ类酸性几丁质酶的同源性为99％,可以初步确定这个基因为Ⅲ类酸性几丁质酶基因.     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

红肉蜜柚 PDR 型转运蛋白基因的发掘及 CmPDR11-2 表达与耐草甘膦初步分析

基于红肉蜜柚 RNA-seq 数据库,筛选出 50 个 ABC 转运蛋白家族基因,其中包含 11 条 PDR 型基因。对11 条柚 PDR 基因进行命名和生物信息学分析。同源性分析结果表明：CmPDR11-2 编码的氨基酸序列与拟南芥中转运百草枯除草剂的 AtPDR11 基因同源性最高,达 69.25%,利用 RT-PCR 技术克隆得到 CmPDR11-2 的 ORF 序列。该序列长度为 4 371 bp,编码一个含有 1 456 个氨基酸的蛋白质,分子量 165.138 03 ku,该蛋白属于稳定的亲水性蛋白,无信号肽,具有 12 个跨膜结构,定位于细胞膜。实时荧光定量 PCR 结果表明,草甘膦除草剂胁迫处理条件下,1~15 d 处理组柚叶的 CmPDR11-2 基因相对表达量呈整体上升趋势,且均高于对照组,反应迅速且持久,这表明 CmPDR11-2 基因表达与红肉蜜柚耐草甘膦有关。     

木薯MADS-box基因克隆及其响应乙烯信号的表达模式分析

利用电子克隆技术从木薯基因组DNA中获得1个MADS-box基因，对其理化性质进行分析，并对该蛋白响应激素信号进行研究。结果表明：该基因含有全长为687 bp的ORF，编码229个氨基酸。通过对该蛋白进行ProtScale程序预测表明，该蛋白可能为亲水性蛋白；理化性质分析表明，该蛋白相对分子量为26.103 7 ku，等电点为6.87；跨膜结构域预测表明，该蛋白为非分泌型蛋白；亚细胞定位分析该蛋白可能定位于细胞核；磷酸化位点分析表明该蛋白能被丝氨酸激酶所磷酸化。运用定量PCR对该基因响应乙烯信号的表达模式进行分析，结果表明，该基因能够响应乙烯信号，并在外施乙烯12 h时具有最高的表达量。本研究为进一步研究该基因响应乙烯信号影响木薯叶片的生长发育提供研究基础。     

矮化大豆GmEXPA5基因的克隆与表达分析

以矮化大豆HK808的顶芽cDNA为模板，根据植物α-膨胀素基因保守区设计简并引物，并克隆保守区片段，结合RACE 技术克隆得到一个新的膨胀素全长基因，将其命名为GmEXPA5（登录号为JN207916.1），该基因全长1 233bp，其中开放阅读框636bp，编码211个氨基酸；推导的氨基酸序列经分析发现，该序列含有两个膨胀素保守域domain1（expansin EG45）和domain2（expansin CBD），无明显的信号肽序列，属于α膨胀素亚家族。构建pEASY-Blunt E1-GmEXPA5重组质粒，获得稳定的原核表达体系，IPTG 诱导后SDS-PAGE 结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。实时荧光定量PCR（real-time PCR）表达分析表明GmEXPA5基因在矮化大豆HK808与野生型大豆东农42两种材料的不同器官中均有表达，而在野生型茎尖及茎部的表达量显著高于矮化大豆，推测该基因与大豆矮化性状的形成可能有一定的关系。