茶树CsGPX基因全基因组鉴定和表达分析

为明确茶树谷胱甘肽过氧化物酶(CsGPX)基因与非生物胁迫的关系,本研究利用生物信息学手段在茶树基因组中筛选得到3条CsGPX基因,对其编码蛋白理化性质、基因结构、系统进化树、顺式作用元件进行了分析。结果表明,CsGPX包含完整GPX结构域和3段保守序列,都具6个外显子。预测启动子上有参与植物激素和非生物胁迫响应的顺式作用元件。使用实时荧光定量PCR测定该基因的表达谱,发现它们在不同组织中的表达有显著差异。进一步分析表明,CsGPX被低温、ABA、盐以及干旱处理上调表达,但CsGPX2和CsGPX3的表达受低温抑制。本研究为茶树CsGPX家族基因克隆和功能验证提供基础。     

向日葵谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆及抗病功能研究

为探讨谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因在向日葵抗病机制中的作用,在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆了1个GST的c DNA序列,并进行了表达和功能分析。结果表明:该基因开放阅读框为675bp,编码224个氨基酸残基,分子量为55.45k D,等电点为5.16,命名为Ha GSTU1(Gen Bank登录号为KR071872);Ha GSTU1蛋白属于GST的Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;Ha GSTU1与一个橡胶树GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为72%。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在叶中表达量最高,其次是花、根、种子和茎,在盘中的表达量最低;干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均能诱导向日葵Ha GSTU1基因的表达量出现显著变化。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因烟草叶片对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草GST和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定发现,转基因烟草叶片中GST和GPX酶活性较野生型提高约2倍,并随着接菌时间的延长,两种酶活性显著升高。初步推断Ha GSTU1具有抗核盘菌的功能。     

东乡野生稻苗期低温诱导表达新基因BGIOSGA013293-DX的过表达载体构建与转化

结合表达谱数据分析,参考公共数据库中的序列信息设计引物,利用RT-PCR技术,从东乡野生稻中获得了1个在低温诱导条件下高表达的螺旋—环—螺旋结构域蛋白基因BGIOSGA013293-DX的全长c DNA,并构建了其过表达载体。序列比对分析表明,该基因位点在93-11中编码308个氨基酸,而在东乡野生稻中编码335个氨基酸,比93-11多27个氨基酸。且这27个氨基酸连续分布在一起,另外还有1个氨基酸的差异。利用农杆菌介导法将BGIOSGA013293-DX转入水稻受体品种93-11,获得了9株过表达转基因水稻植株,经潮霉素抗性标记基因PCR阳性检测和GUS检测,获得的转基因植株为携带BGIOSGA013293-DX的阳性植株。     

人工microRNAs干扰At3A06基因增强了拟南芥对菌核病的敏感性

基于本研究室自主开发的油菜防御cDNA芯片分析结果,油菜基因Bn3A06受菌核病诱导后特异上调表达。序列比对发现,该基因与拟南芥基因At3A06高度同源,后者编码289个氨基酸,功能未知。本研究用花序浸染法将At3A06基因的人工微RNA(amiRNA)干扰载体(该载体包含一个除草剂草胺磷抗性基因)转化拟南芥。经草胺磷筛选获得3株T1代转基因植株,PCR检测均为阳性;荧光定量PCR检测表明,与野生型对照相比,3个转基因植株的At3A06基因的表达量均显著降低;对其T2代进行菌核病抗性鉴定,结果显示转基因株系对菌核病的敏感性均显著增强(P0.05)。推测At3A06基因可能参与了植物的防御反应,与植株对核盘菌抗性相关。     

过氧化物酶基因TaPRX-2A调控小麦穗部性状的功能分析

为研究过氧化物酶基因 TaPRX-2A在调控小麦穗部性状中的功能，以苏麦3号为材料，通过Ensemblplants数据库获得 TaPRX-2A全长cDNA序列，利用PCR方法克隆获得该基因编码区全长序列。生物信息学分析结果表明，该基因包含一个1 026 bp的开放阅读框，编码342个氨基酸。进一步构建基因过表达载体 TaPRX-2A-PC186,通过基因枪介导的遗传转化方法将 TaPRX-2A-PC186转入小麦KN199中，创建过表达 TaPRX-2A转基因株系，调查 TaPRX-2A基因对转基因株系穗部性状的影响。结果表明，过表达 TaPRX-2A转基因株系的穗长显著变短，穗粒数显著减少，说明 TaPRX-2A在调控小麦穗部发育过程中具有重要的作用。     

花生中FAR1-5转录因子的克隆和功能分析

FARl是一类起源于转座子酶的转录因子,在光敏色素A(phyA)信号通路启动、植物光形态建成中具有重要作用。本试验对抗旱花生品种J11的FAR1-5基因进行了克隆,通过序列比对进化分析,表明其与野生花生Arachis duranensis,A.ipaensis相关基因具有较高相似度。干旱胁迫状态下,转基因植株抗旱性强于野生型植株,抗氧化酶活性增强,表明该转录因子可积极响应花生抗旱胁迫。研究结果可为花生抗旱育种提供新的基因资源。     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。     

外源5-ALA对干旱胁迫下茶树叶绿素合成和荧光特性及关键酶基因表达的影响

为探究外源5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)在茶树幼苗响应干旱胁迫时对茶树叶绿素合成和荧光特性的调控机理,以舒茶早为试验材料,PEG-6000模拟干旱胁迫环境,喷施5-ALA进行处理,检测茶树幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量,进一步测定叶片叶绿素荧光参数及关键酶基因的表达.结果显示,外源5-ALA显著提高干旱胁迫...     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

茶树CsMGTs基因的克隆及其镁转运功能分析

镁离子（Mg²⁺）作为叶绿素的中心成分,是植物细胞中含量最丰富的二价阳离子,也是多种酶的激活剂,特别是茶氨酸合成酶的活性依赖Mg²⁺,常被作为茶树专用肥的特征成分,因此对茶树的生长发育和茶叶的品质形成至关重要。MRS2/MGT家族镁转运蛋白在维持植物体内Mg²⁺的吸收转运、胞内平衡和耐逆性等方面起着重要的作用。为探究茶树MRS2/MGT家族镁转运蛋白基因的功能,以茶树品种陕茶1号为材料,克隆了4条MRS2/MGT镁转运蛋白基因,分别命名为CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3。生物信息学分析表明,这4个转运蛋白在C末端均含有2个跨膜结构域和1个保守的GMN三肽基序;系统发育分析显示,CsMGT1属于Clade C成员,而CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3属于Clade B成员,所编码蛋白与木本植物柑橘MGT家族的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,CsMGT1、CsMGT2、CsMGT2.1和CsMGT3在茶树的根、茎、叶、花中呈组成型表达,且根和叶对Mg²⁺浓度均表现出不同程度的响应。鼠伤寒沙门氏菌镁转运缺失突变株MM281功能互补试验表明,CsMGT1和CsMGT2均具有Mg²⁺转运功能,且CsMGT1的Mg²⁺转运功能优于CsMGT2,而CsMGT2.1和CsMGT3几乎没有镁离子转运功能。本研究结果丰富了茶树CsMGTs家族的生物学功能,为进一步阐明茶树通过镁转运功能机制实现对镁离子的利用奠定了前期研究基础。     

茶树中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（CsG6PDHs）的克隆与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH,EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途径中的关键限速酶,在植物逆境胁迫响应和生长发育中具有重要作用。然而,目前有关G6PDH在茶树中的研究尚处空白。在茶树中克隆到3个CsG6PDHs基因,分别命名为CsG6PDH1（MW025829）、CsG6PDH2（MW025830）、CsG6PDH4（MW025831）。聚合进化树结果显示,CsG6PDH1和CsG6PDH4均为质体型蛋白,而CsG6PDH2为胞质型蛋白。表达分析发现,CsG6PDHs在不同组织中均有表达;低温或炭疽菌侵染条件下,CsG6PDH1和CsG6PDH4均被抑制表达;冷驯化期间,CsG6PDH2和CsG6PDH4在不同品种中均上调表达;此外,CsG6PDHs在茶芽休眠和萌发过程中均不同程度上调表达。以上结果表明,CsG6PDHs在茶树生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用,这为后续深入研究G6PDH在茶树中的功能奠定了理论基础。     

茶树CsAAPs亚家族基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术,从龙井43中成功克隆了5个茶树AAPs（Amino acid permeases,氨基酸通透酶）基因。氨基酸序列比对结果表明,5个CsAAPs亚家族蛋白的序列同源性较高,为70.27%。根据氨基酸序列同源性构建系统发育树,结果显示5个CsAAPs分属3组。生物信息学分析表明,CsAAPs均含有9~10个跨膜区域和16~18个AAP保守基序。为了研究该亚家族对氮素的响应情况,选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,氮饥饿两周后,分别供应不同浓度的NH₄NO₃,然后利用qRT-PCR对CsAAPs在不同组织、氮素水平及茶树品种中的表达情况进行分析。研究发现CsAAPs在营养组织中均有表达,但是存在一定的组织表达差异,其中CsAAP3在茎中表达量最高,CsAAP8的主要表达部位为根和茎。在给氮素饥饿处理的茶苗从新供氮之后,CsAAP3的基因表达在3个氮素利用效率不同的品种间差异较大;在氮高效品种中茶302茎中表达的CsAAP3和CsAAP8,可以快速地对低氮条件做出响应,在低氮处理3 h后,基因表达水平明显增加。此研究预示着CsAAPs亚家族在茶树体内可能通过复杂的氨基酸转运参与氮代谢调控。     

茶树CsCML16基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

类钙调蛋白CMLs（CaM-like proteins）是植物体内一类重要的钙信号转导蛋白,在抗非生物胁迫中发挥重要作用。以龙井43、福鼎大白茶和黄金芽的一年生茶树扦插苗为材料,通过低温处理（10℃和4℃）分析茶树在低温胁迫下的生理变化;通过克隆茶树类钙调蛋白CsCML16,分析其在低温胁迫下不同抗寒性茶树品种中的表达模式。结果表明,低温胁迫下龙井43的抗寒性较强,福鼎大白茶次之,黄金芽品种较弱。以龙井43的cDNA为模板,克隆获得CsCML16基因,序列分析表明该基因CDS全长为480 bp,编码160个氨基酸,具有钙受体蛋白EF-Hand保守结构域,为小分子蛋白,相对分子量17.58 kDa;亚细胞定位结果显示CsCML16定位于细胞核和细胞膜。荧光定量结果表明,低温胁迫诱导CsCML16基因的上调表达,且在不同的茶树品种中表达量有差异。为进一步揭示CsCML16基因的生物学功能提供依据。     

茶树CsRAV2转录因子基因的克隆与表达特性分析

RAV转录因子是AP2/ERF家族的成员之一,在植物生长发育和逆境调控中起着重要作用。本研究以安吉白茶和迎霜这两个茶树（Camellia sinensis）品种为试验材料,通过PCR和RT-PCR方法分别从两种茶树的DNA和cDNA中克隆得到CsRAV2基因。分析显示,来源于两种茶树中的CsRAV2基因全长均为1 089 bp,没有内含子,分别编码362个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性、三级结构上分析显示,茶树中CsRAV2转录因子是亲水性蛋白。茶树中CsRAV2转录因子与拟南芥AtRAV具有相似的三级结构。实时定量PCR分析表明,茶树中CsRAV2基因在茶树根中表达量最高,高温、低温、NaCl处理均能诱导该基因表达,不同品种间存在差异。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。