东方百合T-DNA插入突变株侧翼序列的分离及分析

采用反向PCR技术对东方百合(Oriental hybrid lily)T-DNA插入突变株的侧翼序列进行扩增并进行序列分析。结果表明:6个突变表型的植株都有T-DNA插入。扩增到的10个序列长度大都在500～900 bp左右。回收其中的8条亮带,克隆测序后,经NCBI BLASTx比对发现,除了B2序列因为太短没有显著的同源性以外,有1个是未知功能的蛋白。B1是Lys家族转录调节因子;CM1是C类细胞色素生成蛋白;CM2是糖转运跨膜蛋白;D1是特有的解旋酶家族;F1是rRNA小亚基甲基转移酶;G1是Arac家族转录调节因子。表明这些基因可能与这些突变表型有关。     

艾纳香MYB转录因子家族生物信息学分析

MYB转录因子是植物中庞大的转录因子家族之一,在植物体内有着广泛的生物学功能。基于艾纳香全长转录组数据库,利用DNAMAN 6.0、MEGA 5.05软件以及ProtParam、WebLogo和SOPMA在线网站分析艾纳香MYB转录因子家族蛋白的分类、理化性质、氨基酸序列高级结构、保守结构域、系统进化等。结果表明,挖掘到127个BbMYB基因,预测47条具有MYB转录因子保守结构域的蛋白序列;根据结构域可分为1R-BbMYB和R2R3-MYB 2个亚类,其中R2-BbMYB与R3-BbMYB基序中都含有3个保守的色氨酸,而R1-BbMYB基序只有2个保守的色氨酸;艾纳香MYB家族蛋白均为亲水性蛋白,热稳定性较高且富含碱性氨基酸,大部分蛋白以无规则卷曲为主,其中R2R3-BbMYB3、R2R3-BbMYB4与1R-BbMYB15蛋白是以α-螺旋为主;与拟南芥MYB转录因子家族共同构建的进化树发现,艾纳香MYB家族在进化上包括2个大类,6个亚类,通过艾纳香与拟南芥MYB蛋白序列相邻或是进化关系近可以预测艾纳香MYB基因功能,为进一步对艾纳香MYB家族基因研究及其功能鉴定提供科学依据。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。     

胶孢炭疽菌致病性减弱突变菌株H800 T-DNA插入位点侧翼基因的克隆

对农杆菌介导转化引起的致病性减弱突变菌株H800的菌落形态、孢子形态、菌丝体生长速率、孢子萌发率和致病力等生物学特性进行研究,并利用TAIL-PCR方法克隆T-DNA插入位点基因,结合生物信息学分析该基因功能与H800表型变化及致病性减弱的关系。结果表明,突变菌株H800的致病力低于野生型菌株CH008;生长速率为0.83 cm/d,亦显著低于CH008的1.13 cm/d;产孢量和分生孢子大小与CH008无明显差异;孢子萌发率为2.58％,显著低于野生型的95.98％;序列分析显示,T-DNA已插入StCg800基因的启动子区域,基因结构分析表明,StCg800基因编码区全长774 bp,无内含子,可编码257个氨基酸多肽的StCg800蛋白。该蛋白是不稳定的水溶性蛋白,亚细胞定位于细胞质,且无信号肽,推测为生长因子类的酶,但功能尚未知。     

一个小麦AP2/ERF转录因子家族单独亚族基因的克隆及分析

AP2/ERF家族转录因子是植物中重要的一类转录因子,广泛参与植物各类生理过程.为了给该家族转录因子的深入研究提供基础,利用小麦EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/UGOrg.cgi?TAXID= 4565),以拟南芥AP2/ERF家族转录因子单独亚族成员AtAP2-Soloist的氨基酸序列为探针,搜索到一个小麦UniGene数据,经拼接得到1个全长cDNA序列(TaAP2-Solosit),通过RT-PCR方法从"扬麦15"的cDNA中克隆了该转录因子基因(YM15AP2-Solosit).克隆的转录因子核苷酸序列与电子克隆的序列只有1个碱基不同,两者编码氨基酸序列一致.从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、功能域、二级和三级结构等方面进行了分析,结果显示"扬麦15"中的YM15AP2-Solosit转录因子属于AP2/ERF家族中的单独亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与拟南芥的AtAP2-Soloist相似.EST丰度分析显示,YM15AP2-Solosit在根、茎、叶和花中均有表达.     

小麦NAC转录因子的基因克隆与序列分析

为了深入研究小麦中NAC家族转录因子基因,针对NAC基因家族成员,设计了覆盖其全长编码区的1对特异引物,从陕253小麦品种中克隆了2条大小分别为1 463、1 549 bp的片段,命名为TaNAC2、TaNAC4( GenBank登录号为HQ872050HQ872051)。序列分析表明,这2个序列包含典型NAC的完整编码序列,包括两个内含子,具有完整的开放阅读框;推导的氨基酸序列分别为383、405个,这2个基因在N端均具有NAC基因的典型DNA结合结构域,即 NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的 A、B、C、D、E 5个亚区高度保守,仅在C亚区出现一个氨基酸的差异LM,而且在CD区出现罕见的半胱氨酸变异,此发现对于小麦品质的研究非常重要。同时发现这 2个NAC类转录因子都不含有核定位信号（NLS）,但是有相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,证实克隆序列属于NAC基因家族成员,并且发现的TaNAC4属于NAC转录因子家族的NAM亚组,TaNAC2属于NAC转录因子家族的CUC亚组。     

稻曲病菌T-DNA插入突变体B1464插入位点分析

以稻曲病菌致病力丧失的突变菌株B1464为材料,对其生物学形态和分子遗传变异进行分析。B1464田间接种表现为不致病,与野生型菌株相比,在营养贫瘠的MM培养基上生长速率没有显著差异,而在PSA和TB3培养基中生长速率较慢,并且在PS液体培养基中产孢能力下降,同时突变菌株的分生孢子与野生型相比形态和大小均发生变化。Southern杂交结果显示T-DNA在突变菌株B1464中以单拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增得到的紧邻T-DNA两侧的侧翼序列在野生型中不相邻,与野生型菌株基因组比对发现突变菌株插入位点处丢失约20kb的DNA片段。RT-PCR结果表明突变菌株中T-DNA插入位点两侧基因表达量均下调。推断突变菌株B1464的致病能力丧失可能是由于T-DNA的插入导致了染色体重排及破坏了某些基因的正常表达。     

水稻小粒矮突变性状与T-DNA插入标签的共分离检测

 从T-DNA水稻标签系中发现1个标签系中出现了小粒矮(sgd)突变性状的分离。为克隆该突变基因和进行基因功能研究,对该突变体进行了遗传分析。该标签系存在多个插入事件,且T3代发现目标突变性状分离系中,另一个非目标插入事件已经纯合,故特异PCR检测不能确认小粒矮突变性状与T-NA插入共分离。但通过TAIL-CR方法,获得了插入点侧翼的水稻基因组序列,并证实该侧翼序列与小粒矮突变性状共分离。     

橡胶树转HbCBF1基因矮化突变体T-DNA插入位点研究

利用经PCR、GUS染色和Southern杂交均证明已成功转入Hb CBF1的、田间表型为矮化的橡胶树植株C1为材料,通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA右侧侧翼序列1.6 kb,根据侧翼序列与载体的序列设计引物分析验证该序列真实可靠,并设计引物判断基因的T-DNA插入以杂合位点存在,与此同时,将该侧翼序列与已有的橡胶树基因组测序结果进行比对分析,发现该插入位点处并不存在基因,根据CBF1与Ca MV35s启动子的研究推测,C1植株的矮化表型是由于Ca MV35s启动子驱动抗逆基因导致,而非插入基因造成。     

稻瘟病菌致病性增强突变体B11的基因分析

 在农杆菌介导转化（AtMT）的稻瘟病菌突变体库中,筛选到一个菌丝生长增快,对大麦致病性增强的突变体B11。Southern杂交分析表明B11中T DNA为单拷贝插入。通过TAIL PCR克隆插入位点侧翼序列,序列测定与比对分析显示T DNA位于假想基因MG01679的编码区内。利用PCR的方法,克隆基因的DNA和cDNA序列。该基因开放阅读框包括1个内含子和2个外显子,编码序列的长度为696 bp,编码231个氨基酸的多肽,编码产物属于ThiJ/PfpⅠ蛋白家族。因此,将该基因命名为MgThiJ1。MgThiJ1蛋白序列与尖胞镰刀菌假想蛋白FOXG_09029有57%的同源性,与禾谷镰刀菌假想蛋白FGSG_08979有54%的同源性。MgThiJ1基因可能为致病过程的负调控因子,其具体作用机制有待进一步研究。     

转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

农杆菌介导的转高赖氨酸蛋白基因（sb401）水稻T4代分析

通过农杆菌介导的方法用富赖氨酸蛋白基因（sb401）转化粳稻品种日本晴,获得了独立的10个转化株系,对转化株系进行连续自交,通过筛选得到9个纯合的T4代转化株系。 Southern blotting分析发现,整合位点是随机的,并为低拷贝（1~3个）。TAI-PCR扩增得到8个T-DNA侧翼序列,并定位于日本晴的7条染色体上。蛋白质和氨基酸测定分析发现,sb401基因对各株系的蛋白质、赖氨酸和其他氨基酸组分的提高起到了一定的作用。将杂交结果与T-DNA插入位置结合分析发现,在低拷贝的情况下,表达量的差异不明显。     

花生高蛋白转化体T—DNA整合位点侧翼序列分析

利用山东省花生研究所分子育种实验室改建的植物表达载体，采用自创的农杆菌直接注射法转化花生品种花育22号。运用近红外扫描技术分析单粒花生主要脂肪酸、含油量和蛋白质含量，获得了蛋白质含量明显提高的转化体。通过DNAwalking技术获取T—DNA左边界侧翼序列3条、右边界侧翼序列1条。经Blast分析，在GenBank中找...     

一个水稻类病变黄叶突变体的鉴定和精细定位

从15000多个水稻转基因株系中发现了一个类病变黄叶突变体.该突变体最显著的特征为叶片由下而上依次黄化,同时出现类似病原体感染的病斑.根据突变体表型,将该突变体命名为syll(spotted and yellow leayes 1).遗传学分析表明,该突变性状受1对隐性核基因控制.PCR检测和潮霉索抗性分析显示.该突变...