铝诱导的茶树根系转录组变化分析

探讨茶树响应铝（Aluminum,Al）的基因调控网络和表达模式,确定一些关键候选基因,为茶树耐Al分子机制研究奠定基础。测定了0、0.2、1、2、4βmmol·L^-1 5个Al³⁺浓度处理7βd的福鼎大白茶根系抗氧化酶活性和Al含量变化,并提取0βmmol·L^-1（R0）、1βmmol·L^-1（R1）和4βmmol·L^-1（R4）3个浓度下的茶树根系总RNA,通过Illumina Hiseq Xten平台进行高通量转录组测序。结果表明,随着Al³⁺浓度的升高,根系POD（Peroxidase,过氧化物酶）活性逐渐下降,APX（Ascorbic acid peroxidase,抗坏血酸过氧化物酶）活性则逐渐升高。SOD（Superoxide dismutase,超氧化物歧化酶）活性在Al³⁺浓度为1βmmol·L^-1时最高,CAT（Catalase,过氧化氢酶）活性在各处理间无显著差异。根系中Al含量随着Al³⁺浓度的升高呈先上升后下降趋势,在Al³⁺浓度为1βmmol·L^-1时达到最高。经筛选得到R1 VS R0,R4 VS R0,R4 VS R1的DEGs（Differentially expressed genes）分别为1β894、2β439个和1β384个,显著上调（下调）的差异表达基因分别有733（1β161）、846（1β593）个和628（756）个。GO富集分析表明,3个处理组在生物学途径中富集最多的类别均为刺激响应。在分子功能和细胞组件方面,R1 VS R0和R4 VS R0富集最多的类别均为核酸结合转录因子活性和细胞外围,R4 VS R1富集最多的类别为氧化还原酶活性相关基因和膜区域。KEGG富集分析表明,R1 VS R0、R4 VS R0、R4 VS R1分别显著富集了29、41条和19条Pathway,它们包括转录因子、转运蛋白、植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成途径等,鉴定到多个参与调控活性氧代谢、有机酸或金属转运蛋白、转录因子及细胞壁结构修饰等生理过程的基因在Al诱导后上调或抑制表达,显示这些基因与茶树耐Al分子机制密切相关。     

茶多酚诱导铜绿假单胞菌交叉耐受性研究

检测了亚致死浓度的茶多酚（Tea Polyphenols,TP）处理对铜绿假单胞菌交叉耐受性的诱导作用。铜绿假单胞菌暴露于1βmg·mL^-1茶多酚1βh后能够显著增强细菌对多种环境条件的耐受性,包括氧化剂（1βmmol·L^-1 H₂O₂）、高温（47℃）,及酸性溶液[磷酸缓冲液（pH4.0）、含有有机酸（60βmmol·L^-1柠檬酸、60βmmol·L^-1乳酸、80βmmol·L^-1乙酸）的磷酸缓冲液（pH4.0）]。另外,通过荧光定量RT-PCR技术分析了茶多酚诱导下铜绿假单胞菌胁迫相关基因的表达情况。研究发现,茶多酚能够显著诱导铜绿假单胞菌氧化胁迫相关基因katB、sodM、ohr、lexA和recN的表达,以及热激蛋白基因dnaK、groEL、htpG、grpE和groES的表达。这些胁迫相关基因的表达很可能在细菌交叉耐受性形成过程中起到重要作用。以上研究结果表明,虽然茶多酚作为天然食品添加剂具有较高的安全性,但在实际应用过程中应充分考虑茶多酚诱导细菌交叉耐受性所导致的潜在风险,以优化食品保鲜策略。     

磷铝互作对茶树根系生长及有机酸分泌的影响

为探究磷铝互作对茶树生长的影响,设置了3个铝浓度以及5个磷浓度进行磷铝交互处理,分析茶树根系生长、有机酸分泌以及磷铝元素吸收的变化。结果表明,低磷（0.01 mmol∙L^-1）或高铝（1 mmol∙L^-1）均能显著促进茶树新根生长,且低磷高铝共同处理下茶树新根根尖数、根长、平均直径及干物质增加量均达到最大值;高铝能够使高磷（0.5 mmol∙L^-1）条件下受阻的新根恢复生长;除高磷处理外,提高环境中的磷铝浓度能够显著促进另一元素在茶树根部的积累。一定范围内磷能够显著促进铝在嫩叶中的积累;但磷充足时（>0.05 mmol∙L^-1）铝却会抑制磷在嫩叶中的积累。在磷充足时,提高铝浓度均能促进草酸、苹果酸、柠檬酸的分泌;提高磷浓度能促进柠檬酸的分泌,低磷能促进草酸和苹果酸的分泌,且低磷高铝协同促进苹果酸的分泌。双因素方差分析结果表明,磷、铝浓度及其交互作用对茶树新根的根长、根尖数、磷铝吸收及有机酸分泌均有极显著影响（P<0.01）,可见磷铝互作能够显著影响茶树根系生长及有机酸分泌。     

产多酚氧化酶茶树内生真菌的筛选及产酶条件优化

以愈创木酚、α-萘酚、没食子酸、L-酪氨酸和单宁酸等5种酚类物质为底物,采用鉴别培养基筛选法从14株茶树内生真菌中初筛获得4株产多酚氧化酶的真菌。根据变色圈的大小、颜色深浅和摇瓶发酵的结果复筛获得产多酚氧化酶能力较强的菌株CSN-13。对菌株CSN-13产酶营养条件进行初步分析,结果表明,在供试的6种碳源物质中,以麸皮对菌株CSN-13产多酚氧化酶的促进作用最为明显;供试的5种氮源物质中,以硝酸铵的促进作用最为明显;在发酵培养基中添加茶水,对产酶有明显的促进作用。采用正交设计对CSN-13产酶发酵培养基进行初步优化,优化后的培养基配方为：麸皮（40βg·L^-1）、硝酸铵（15βg·L^-1）、茶水（4βg·L^-1）、KH₂PO₄（2βg·L^-1）、MgSO₄·7H₂O（0.5βg·L^-1）、无水CaCl₂（0.075βg·L^-1）、CuSO₄·5H₂O（0.01βg·L^-1）。采用优化后的培养基,菌株CSN-13在28℃下培养5βd,酶活力达到241βU·mL^-1·min^-1,比优化前提高8.5倍。茶树内生真菌菌株CSN-13及其发酵产酶培养基的研究为多酚氧化酶的进一步开发打下了基础。     

外源亚精胺对铅胁迫下茶树生长的影响

选取龙井43为材料,采用盆栽试验,研究了外施1.0 mmol·L^-1的亚精胺（Spd）对不同浓度重金属铅（Pb²⁺）胁迫下茶树株高、地径和叶片相关抗氧化酶活性、渗透调节物质含量、丙二醛（MDA）含量、细胞膜透性以及叶绿素含量等生理指标的影响。结果表明,低浓度铅胁迫能够促进茶树生长,而高浓度铅胁迫影响了茶树正常生长;喷施外源亚精胺有效缓解了随着胁迫Pb²⁺浓度升高对茶树造成的伤害,提高了叶片抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量和叶绿素含量,降低了叶片脯氨酸（Pro）含量、MDA含量和相对电导率（RC）,从而促进茶树生长。表明外源亚精胺对铅胁迫下茶树生长具有积极的促进作用。     

基于4300 DNA分析系统的茶树SSR发掘方法优化与建立

简单序列重复（Simple sequence repeats, SSR）在茶树遗传与育种研究中具有重要的作用,基于4300 DNA分析系统的SSR发掘具有通量高、准确和灵敏等特点,已被用于许多物种的分子标记研究,但在茶树的相关研究中尚未见报道。本研究应用单因素试验和L₉(3⁴)正交设计试验对影响茶树SSR-PCR的主要参数进行优化,建立了适合于4300 DNA分析系统的茶树SSR-PCR反应体系：1.0 μL DNA（25 ng·μL^-1）,0.2 μL M13F-F、0.2 μL R和0.4 μL IR-M13F,0.8 μL dNTPs（25 mmol·L^-1）,1.0 μL 10×Buffer（含Mg²⁺）,0.1 μL Ex-Taq聚合酶（5 U·μL^-1）,无菌水定容至10 μL。所有引物浓度均为1 μmol·L^-1。同时,本研究还证明,可以以自行配制的6.5%聚丙烯酰胺凝胶溶液（acry:bis=29:1）替代4300 DNA分析系统指定凝胶溶液,检测SSR位点。     

外源水杨酸甲酯对高温胁迫下茶树光合作用和抗氧化酶的影响

近年来茶园高温灾害频发,而关于提高茶树耐热性的研究相对较少。本文以龙井43为试验材料,利用不同浓度水杨酸甲酯（MeSA）喷施茶苗后,在高温环境下（43℃）处理12βh,随后测定茶树叶片的净光合速率（Pn）,Rubisco最大羧化速率（V_c,max）、RuBP最大再生速率（J_max）,电解质渗透率（EL）,丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶活性等相关指标。结果发现,1βmmol·L^-1 MeSA能够有效缓解高温导致的茶树Pn降低,维持V_c,max和J_max稳定;高温导致茶树叶片EL和MDA含量迅速上升,而适当浓度的MeSA可显著降低高温环境下EL和MDA含量。此外,结果表明1βmmol·L^-1 MeSA能够提高APX和CAT活性,进而减少H₂O₂积累,减轻茶树细胞膜过氧化作用。综上所述,外源施用MeSA能够在一定程度上维持高温条件下植物叶片细胞光合系统稳定,提高茶树叶片的抗氧化酶活性,缓解氧化胁迫,最终提高茶树的耐热性。     

茶树对硒吸收累积特性及其硒调控相关基因的表达分析

本文采用沙培试验,从动态角度研究了不同时间和不同浓度下茶树对硒的吸收累积规律,并分析相关基因的表达特点。结果发现,茶树不同部位对硒的累积量存在较大差异,大部分硒保留在根部,在其体内的迁移率较低,硒的累积量和外源硒浓度、培养时间显著相关;当外源硒浓度在0~0.05 mmol·L^-1时,茶树长势良好,但当浓度高于0.10 mmol·L^-1时,茶树表现出中毒症状。荧光定量PCR分析发现,转录因子CsbHLH62及茉莉酸信号途径中的关键基因丙二烯环化氧化酶基因（CsAOC）和脂氧合酶基因（CsLOX6）受到高浓度硒的诱导表达,相关性分析表明,这3个基因的表达量与根系硒含量呈显著正相关。本研究表明,茶树各部位对硒的累积与外源硒浓度和培养时间显著相关,基因CsbHLH62、CsAOC和CsLOX6可能在该过程中发挥着重要作用。     

外源5-氨基乙酰丙酸对低温胁迫下茶树叶片光合及生理特性的影响

通过对陕茶1号（耐低温型）和金牡丹（低温敏感型）2个茶树品种在冬季自然低温胁迫下喷施不同浓度（0、10、30、50 mg·L^-1）的外源5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,ALA）,探究外源ALA对低温胁迫下茶树叶片光合荧光特性及生理特性的调控作用。结果表明,适宜浓度的外源ALA对低温胁迫下茶树叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率、PSⅡ最大光化学效率及PSⅡ潜在活性具有促进作用,能够提高水浸出物、咖啡碱、游离氨基酸、儿茶素类物质、茶氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等生理活性物质含量的累积;外源ALA能够提高低温胁迫下茶树光合作用的能力并改善茶叶品质,其中50 mg·L^-1的ALA处理能有效提高陕茶1号应对低温胁迫的能力,10 mg·L^-1和30 mg·L^-1的外源ALA对金牡丹应对低温胁迫具有较好的缓解效用。     

茶多酚抑制腐败希瓦氏菌机理研究

研究评价了茶多酚对腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的抑菌和杀菌效果,并初步探讨了其抑菌机理。结果表明,茶多酚对腐败希瓦氏菌的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为1 mg·mL^-1和16 mg·mL^-1,2 mg·mL^-1茶多酚处理能显著抑制细菌的生长曲线,在25℃和4℃作用96 h和192 h希瓦氏菌分别下降了10⁵ CFU·mL^-1和10⁶ CFU·mL^-1,杀菌作用表现时间依赖性。茶多酚单体的杀菌能力大小分别为EGCG>ECG>EGC>EC。在茶多酚作用下,腐败希瓦氏菌胞外上清中Na⁺/K⁺-ATP酶和AKP酶活性显著上升,投射电镜（TEM）观察细菌出现了破损、变形等现象。可见,茶多酚能有效抑制腐败希瓦氏菌的生长,在低温长时间下仍表现出杀菌能力,其杀菌机制主要是引起细菌细胞壁和细胞外膜损伤,使胞内成分泄漏,导致细菌死亡。     

香茅草挥发物及其主要成分对3种茶树病原真菌的抑制性研究

采用固相微萃取和气相-质谱联用仪检测了香茅草鲜草茎和叶的挥发成分,分析确定了香茅草鲜草茎和叶中共51种挥发成分,主要成分为柠檬醛[包含(E)-柠檬醛与(Z)-柠檬醛]和香叶醇,茎中相对含量分别为81.39%(58.48%和22.91%)和4.79%;叶片中相对含量分别为78.50%(51.63%和26.87%)和3.68%。采用菌丝生长速率法,研究了柠檬醛和香叶醇分别对茶树炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)、轮斑病病原菌(Pestalotiopsis theae)、褐芽病病原菌(Phoma adianticola)的抑制活性。活性初测结果表明,500 mg·L^-1处理96 h,两种成分对供试轮斑病病原菌抑制率均低于56%;而对供试茶炭疽病和褐芽病病原菌的抑制率均可达100%。进一步活性测试结果表明,柠檬醛对茶炭疽病和褐芽病病原菌的抑制中浓度(EC₅₀)值分别为(230.56±3.49) mg·L^-1和(124.79±10.29) mg·L^-1;香叶醇对两种病原菌的EC₅₀值分别为(238.38±5.51) mg·L^-1和(115.38±10.96) mg·L^-1。本研究初步明确了香茅草鲜草挥发成分及其对茶树病害病原菌抑制活性的主要物质基础,为茶园种植香茅草具有潜在防病害作用提供了理论依据。     

苯并噻二唑（BTH）和β-氨基丁酸（BABA）对茶树新梢生长和品质成分的影响

通过设定不同浓度的BTH和BABA对2年生龙井43进行喷雾处理,探讨两种物质对茶树新梢部分生长指标、茶鲜叶主要品质化学成分的含量和相关代谢酶活性的影响。结果表明,与对照相比,处理后新梢芽长和芽重、含水量、干物质量差异不显著（P>0.05）。鲜叶中多酚类物质、总氨基酸、咖啡碱和可溶性蛋白的含量均有不同程度的提高,75 mg·L^-1 BTH处理后含量分别增加了29.32%、49.10%、23.77%、96.34%;400 mg·L^-1 BABA处理后含量分别增加了15.75%、45.50%、21.31%、87.18%。可溶性糖含量和酚氨比降低。PPO和GS两种酶的活性明显提高,而POD和PAL的活性相应降低。以上研究初步表明75 mg·L^-1的BTH和400 mg·L^-1的BABA可以通过调节茶叶的主要化学品质成分和相关酶的活性,在一定程度上改善茶叶的品质。     

茶树根内生细菌的分离及其茶多酚耐受性的初步研究

本实验研究了茶树根内生细菌的分离方法及对茶多酚的耐受性,并对内生细菌进行了初步的鉴定。结果表明,分离茶树内生细菌时采用75%的酒精2min和2%次氯酸钠20min表面消毒处理,消毒彻底;含茶多酚的细菌营养平板可作为茶树根内生细菌的选择性分离平板。茶树内生细菌对茶多酚的耐受浓度,最高不高于0.5g/L;经鉴定主要为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。