海南岛黄瓜病毒病种类鉴定及其发生分布研究

2018年11月—2019年3月,在海南省三亚、乐东、东方、儋州、澄迈、海口、万宁和五指山共8个市县,采集疑似病毒病的叶片样本302份,采用小RNA深度测序和RT-PCR检测发现,黄瓜样品中存在黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot virus, MYSV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV)和瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV）共5种病毒,检出率分别为32.79%、31.46%、23.18%、9.61%和2.65%。病毒的复合侵染率为11.28%,有8种复合侵染类型,以其中2种病毒复合侵染为主。明确了海南岛黄瓜病毒病主要种类及发生分布情况。     

利用小RNA深度测序技术鉴定海南南瓜病毒种类

2016年在海南乐东、昌江、澄迈、海口、文昌、儋州等地采集疑似被病毒病感染的南瓜叶片样品6个,将样品合并,采用小RNA深度测序技术对上述混合样本的病毒种类进行鉴定,发现样本中含有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒(Papara ringspot virus,PRSV)、黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和中国南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl China virus,SLCCNV),通过PCR方法进一步验证了深度测序结果的准确性。SLCCNV在4个样品中存在,P-CJ分离物的DNA-A和DNA-B组分全长分别为2 735 bp(登录号为MF062251)和2 722 bp(登录号为MF062252)。DNA-A和DNA-B组分均与SLCCNV分离物的同源性最高,同源性分别为89.2%~99.3%和79.1%~98.8%;P-CJ分离物与从中国植物样品中分离到的SLCCNV聚在同一进化分支上。上述研究结果表明,P-CJ是SLCCNV的一个分离物。     

我国木薯花叶病毒病的发生危害及其病原鉴定

为明确国内木薯花叶病毒病（cassava mosaic virus disease）的危害情况、田间症状及其病原类型,本研究于2018—2019年调查了该病在国内的分布情况、症状特征及种质来源等数据,采集了8省（区）19地的384份样品,利用特异性引物检测2种木薯花叶病毒侵染引起的症状类型,并通过序列比对明确其病原特点。结果表明：木薯花叶病毒病已经在我国发生,种茎调运是该病远距离传播的主要原因;国内木薯花叶病毒病病原有斯里兰卡木薯花叶病毒株系（Sri Lankan cassava mosaic virus, SLCMV）和木薯普通花叶病毒（Cassava common mosaic virus, CsCMV）2种病毒,可分为单独感染、复合感染,其中SLCMV的检出率为21.1%,CsCMV的检出率为36.5%,SLCMV-CsCMV复合侵染率为15.1%;检测到的SLVMV与东南亚SLCMV序列同源性为99.4%~99.7%,检测到的CsCMV与拉丁美洲的CsCMV序列相似性为91%~96%。推测国内木薯花叶病毒病主要由2种病毒侵染引起,且普通花叶病毒有产生序列变异的可能性。     

广西柑橘碎叶病和叶斑病调查及其病原的遗传多样性分析

调查了广西南宁、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、贺州及防城港等主要柑橘种植区的柑橘碎叶病和叶斑病的发生情况,并对其病原柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus, CTLV）、苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）和柑橘叶斑病毒（Citrus leaf blotch virus, CLBV）进行了RT-PCR检测、病毒序列测定和遗传多样性分析。结果发现,在所有疑似柑橘病毒病样品中,CTLV检出率为7.3%,CLBV检出率为5.5%,ASGV检出率为3.0%。其中在南宁、桂林和玉林3个主要柑橘种植区采集的疑似柑橘病毒病样品的3种病毒病检出率合计分别为21.2%、28.6%和7.6%,且存在多种病毒复合侵染的现象。将克隆到的上述3个病毒分离物的病毒片段,分别与已报道的相应病毒的代表性分离物的病毒片段进行系统进化分析,结果表明,ASGV和CTLV的中国分离物在进化关系上均呈寄主相关性,ASGV的日本分离物则与地理位置相关性更强,而韩国和印度的分离物未表现出明显的寄主相关性和地理位置相关性。柑橘和苹果的ASGV和CTLV分离物均表现与地理位置相关,而梨的ASGV和CTLV分离物却与地理位置和寄主均不相关;CLBV分离物则呈明显的寄主相关性。本研究首次报道了广西柑橘碎叶病和柑橘叶斑病的发生情况及其病原的遗传多样性与系统进化关系,为柑橘病毒病的诊断和防治提供参考依据。     

PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）和槟榔坏死环斑病毒（Areca plam necrotic ringspot virus, ANRSV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中分别可诱导十字花科作物和槟榔产生坏死病症的2种不同属病毒。VPg（Viral protein genome linked）作为与马铃薯Y病毒科病毒基因组5′端的结合蛋白,在病毒复制、翻译和运动等侵染过程中发挥重要作用。本研究利用In-Fusion克隆策略分别构建了可表达3′端融合Strep蛋白标签序列的ANRSV和TuMV VPg全长编码基因的马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。通过农杆菌渗透注射接种本生烟（Nicotiana benthamiana）,利用RT-PCR、Strep蛋白标签亲和层析和Western blot等方法证明了PVX病毒载体能够介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生烟中系统表达,且发现这2种VPg蛋白的过量表达诱导本生烟叶片产生了不同程度的系统性坏死病症。进一步采用DAB和NBT染色,在产生坏死症状叶片中检测到大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积累。因此,推测VPg可能是TuMV和ANRSV诱发植物病症产生的一个决定因子,为后续研究这2种病毒诱导症状形成机制奠定了基础。     

蝴蝶兰亲环素基因PhCyP的克隆及表达分析

为研究蝴蝶兰对低温胁迫分子调控的机理,采用RT-PCR和RACE方法,从蝴蝶兰叶片中克隆到一个亲环素基因PhCyP（登录号为MH992514）,其基因cDNA全长序列为829 bp,开放阅读框长度为522 bp,编码173 个氨基酸,其编码蛋白含有一个类亲环素（CLD）保守结构域,为碱性亲水性蛋白。系统进化分析显示,蝴蝶兰PhCyP蛋白与兰科植物小兰屿蝴蝶兰、万带兰、深圳拟兰、铁皮石斛等亲环素蛋白亲缘关系较近。转录表达分析表明,PhCyP基因在蝴蝶兰不同发育时期的根、叶、花梗、花器官、子房、种子等组织中有高丰度表达。在13 ℃/8 ℃（昼/夜）温度条件下,PhCyP基因的表达水平先降低,处理6 d时降至最低,随后逐渐升高至恢复培养。在4 ℃低温条件下,PhCyP基因的表达水平升高,在处理4 h升至最高,然后逐渐下降,在处理48 h其表达低于处理前水平。以上结果表明,PhCyP基因参与蝴蝶兰对低温胁迫的响应,且对不同低温胁迫具有不同的分子调控机制。     

海南胡椒中黄瓜花叶病毒分离物的分子鉴定

通过间接酶联免疫法,从海南罹病胡椒植株中检测到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV).从病叶中提取总RNA,用巢式RT-PCR方法扩增获得657 bp的CMV CP基因片段,并与pMDl8-T载体连接和转入大肠杆菌克隆,然后进行测序.序列分析结果表明,该分离物与CMV亚组I、亚组II之间的核苷酸序列同源性分别为92.54%～99.09%和76.97%～77.42%,推导氨基酸序列同源性分别为98.17%～100%和81.74%～82.65%.该分离物CP基因与印度胡椒分离物同源性相对较低,应属不同株系.     

海南黄灯笼辣椒顶死病病原病毒的分离鉴定

从海南省黄灯笼辣椒顶死病株上分离纯化得到一个病毒分离物.研究结果表明,该病毒分离物能通过汁液磨擦接种侵染供试植物中的4科11种植物,可由桃蚜传播;提纯病毒粒子呈球形,直径28～30 nm,外壳蛋白分子量约为28 ku;分离物与CMV抗血清在ELISA测定中呈阳性反应;提取病毒分离物RNA,应用RT-PCR方法克隆了病毒外壳蛋白（CP）基因.CP基因675 bp,编码218个氨基酸.对CP基因序列分析表明,该病毒分离物的CP基因核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ分离物的同源性均在92.1%以上,所推导的氨基酸序列同源性在96.3%以上,而与亚组Ⅱ分离物的核苷酸序列同源性均低于77.3%,所推导的氨基酸序列同源性均低于80.7%.据此将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒,归属于亚组Ⅰ.     

逆境信号下木薯MeMYC2转录因子表达及功能分析

MYC2是茉莉酸信号途径中的关键节点基因,在植物生长发育及逆境信号响应过程中发挥重要作用。本研究基于木薯基因组数据库序列,以木薯‘cv. 60444’品种为材料,采用RT-PCR方法同源克隆得到MYC2基因（数据库No. Manes.17G016000）,命名为MeMYC2.1。MeMYC2.1基因开放阅读框（ORF）全长2055 bp,无内含子,氨基酸序列中包含典型的bHLH保守结构域;序列比对分析发现MeMYC2与蓖麻MYC2具有较高同源性。外源施加植物激素水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、过氧化氢（H₂O₂）以及低温胁迫下,木薯叶片中MeMYC2.1的表达被显著诱导。进一步克隆获得MeMYC2.1基因上游1500 bp启动子序列,利用在线数据库PlantCare分析发现,MeMYC2.1启动子序列中不仅含有响应茉莉酸的顺式元件CGTCA/TGACG,还含有低温响应元件LTR及ABA响应元件ABRE。以上研究结果表明,MeMYC2.1可能是植物激素茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）响应低温物胁迫分子网络中的一个节点基因,对其功能的深入研究将有助于探讨JAs在植物低温胁迫应答中的作用机制。     

芒果无机焦磷酸酶基因的克隆及其表达载体构建

无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase,PPase）催化焦磷酸（PPi）水解为2个无机正磷酸（Pi）,是蔗糖合成途径中的调控关键节点之一。本研究根据已经报道的PPase基因的序列设计兼并引物,采用3′ RACE和5′ RACE方法,从贵妃芒果的果实中克隆得到了一个芒果PPase基因,将其命名为MiPPase,其全长cDNA序列为1014 bp,开放阅读框为837 bp,编码278个氨基酸,分子量为30.85 ku,等电点为4.68。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与红花烟草具有较近的亲缘关系。为深入探究MiPPase基因在蔗糖代谢过程中的作用,本研究成功构建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因过量表达载体,为后续研究MiPPase基因在芒果果实蔗糖合成的作用机理提供理论依据。     

双重RT-PCR方法检测花生条纹病毒和黄瓜花叶病毒

为了建立花生条纹病毒(PStV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的双重RT-PCR检测方法,根据Gen-Bank中登陆的PStV和CMV的核苷酸保守序列分别设计特异性引物,以感病叶片总RNA反转录物为模板,建立了双重RT-PCR反应体系,并对双重RT-PCR的特异性和灵敏性进行了验证。结果表明:此方法能够特异地从感染PStV和CMV的样品中扩增出PStV(300bp)和CMV(1054bp)2个条带,与实验设计相符;扩增产物测序结果表明,PStV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为93%～99%,CMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为90%～99%,证明了检测结果的准确性;该方法特异性良好,灵敏性与单一扩增相同,能够特异、灵敏、准确地检测花生CMV和PStV。     

番茄斑驳花叶病毒海南分离物全基因组序列分析

本研究采用小RNA深度测序及RT-PCR检测技术鉴定海南省陵水县冬种番茄(圣女果)病株受到烟草花叶病毒属的番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)侵染。通过机械摩擦接种,将该病原病毒保存于本生烟植株上,命名为番茄斑驳花叶病毒海南分离物(ToMMV-HN)。采用RT-PCR分段扩增获得了该病毒分离物的全基因组序列。测序结果表明,该病毒分离物基因组全长6399 nt,含有4个开放阅读框,编码4种蛋白,与已报道的ToMMV9个分离物核苷酸和编码产物氨基酸序列相似性分别为98.0%～100%和99.2%～100%;与同属的番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、番茄棕色皱果病毒(Tomato brown rugose fruit virus,TBRFV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)代表分离物核苷酸序列相似性分别为84.7%、80.7%和79.0%。系统进化分析结果表明,ToMMV-HN与该病毒中国西藏和云南辣椒分离物亲缘关系最近,与美国加州和南卡州番茄分离物次之,与西班牙和巴西番茄分离物亲缘关系相对较远。本研究为我国番茄病毒病诊断和防控,尤其是抗病品种选育提供了基础资料。     

西番莲不同种质资源抗寒性测定

为筛选贵州抗寒性强的西番莲品种,设定5个低温处理梯度,测定不同低温胁迫下6个品种西番莲枝条膜脂特性、可溶性物质、细胞保护酶,分析其变化趋势,并通过隶属函数法综合评价各品种抗寒能力。研究结果表明,所有品种枝条相对电导率均随处理温度降低而增加,‘蓝香西番莲'（Passiflora incarnata）、‘玛格丽特西番莲'（Passiflora ‘Lady Margaret'）、‘贵寒1号'（Passiflora edulis）半致死温度较其他低,各品种MDA变化趋势差异较大,总体上-20℃下MDA含量高于5℃处理,‘玛格丽特西番莲'‘贵寒1号'‘台农1号'‘巨无霸黄金果'枝条可溶性糖随处理温度降低呈下降趋势,各西番莲品种枝条可溶性蛋白质含量随处理温度降低呈先增加后减少趋势,除‘巨无霸黄金果'外,其他品种枝条CAT酶活性均随处理温度下降呈先上升后下降趋势,枝条POD酶活性随处理温度下降呈先上升后下降趋势,各品种枝条SOD酶活性随温度变化趋势差异较大。根据隶属函数法判定6个西番莲品种均为Ⅱ级,中抗寒性品种,得出各品种抗寒性强弱顺序为：‘贵寒1号'>‘蓝香西番莲'>‘玛格丽特西番莲'>‘台农1号'>‘紫花西番莲'（Passiflora amethystina）>‘巨无霸黄金果'。     

百香果连作对土壤细菌群落结构的影响

细菌群落在土壤健康和植物的生长中起着重要作用,而作物的连作对其有着显著的影响。为探明百香果连作对土壤细菌群落结构和多样性的影响,本研究以种植‘台农1号’百香果1年（TF）、2年（TS）、3年（TT）、4年（TFo）及0年（撂荒地,TZ）的土壤为材料,利用Illumina高通量测序技术对不同种植年限土壤细菌群落结构及多样性开展分析研究。结果表明,所有土壤样本共检测出2418个OTUs,分属28门、70纲、170目、269科、465属、963种,其中变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）是主要的优势菌门,细菌群落的丰富度和多样性指数随连作年限的增加表现为先增加后降低。分析发现,百香果连作对土壤细菌群落结构有显著影响,其中绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）和芽孢杆菌属（Bacillus）的相对丰度随连作年限的增加而显著升高,研究结果可为百香果连作障碍发生机制的进一步研究提供依据。     

建兰花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值,建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。根据CyMV的外壳蛋白基因序列设计4对特异性引物,经过优化反应条件,建立该病毒的RT-LAMP 检测方法,并进行LAMP检测的特异性、敏感性检测。该方法能特异扩增CyMV,与其他4种病毒（齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒和小苍兰花叶病毒）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CyMV,可省去电泳分析的时间。针对CyMV建立的RT-LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点,适用于在进境检疫及种苗繁育过程中的检测鉴定。     

扁核木属植物叶绿体基因组特征分析

扁核木属（Prinsepia）植物在中国分布有4个种,均具有极高的食用和药用价值。为解析扁核木属植物的叶绿体基因组特征,基于现已发表的扁核木属植物叶绿体基因组,利用相关生物信息学手段进行其叶绿体基因结构、SSR、密码子偏好性和序列变异情况分析,并构建系统发育树。结果表明,2种扁核木属植物叶绿体基因组大小介于159 179~ 168 206 bp之间,平均GC含量为37.3%,从编码基因数目来看,仅相差2个tRNA,而蛋白编码基因和rRNA数目均一致,种间具有较高的保守性;在扁核木和蕤核叶绿体全基因组序列中各检测出分散重复49个,其中以正向重复和回文重复为主,占比达73%~82%,而串联重复数目分别为49个和58个,经简单重复序列SSR分析,分别在2种植物叶绿体基因组序列中分别筛选出100个和84个SSR位点,且多是以A/T碱基为主的单核苷酸重复类型;扁核木属植物叶绿体基因组密码子偏好性分析发现GC3的碱基含量显著低于GC1和GC2,说明密码子偏好以A、U结尾,ENC取值均大于48%,表明其密码子偏性较弱,中性绘图和PR2-plot分析发现自然选择是影响扁核木属植物密码子使用偏好性的主要原因,通过建立高、低基因表达库,以RSCU值为参考,确定了6个扁核木属最优密码子。经叶绿体基因组序列变异分析,根据核苷酸多态性指数Pi>0.015筛选出trnH-GUG-psbA,psbZ-trnG-UCC-trnfM-CAU-rps14和psaJ-rpl33-rps18等3个高变区,以蕤核叶绿体基因组为参考,在扁核木叶绿体基因组编码区发现存在大量的插入、缺失和SNP突变位点,并在蕤核叶绿体基因组中发现了多个该物种的特有基因。基于叶绿体基因组的trnS-trnG间隔区构建的系统发育树显示,4种扁核木属植物可分为南系（扁核木、台湾扁核木）和北系（蕤核、东北扁核木）两类。研究结果可为扁核木属植物的系统发育、分类鉴定及其资源的开发利用等相关研究提供理论基础。     

毛竹林带状采伐后垦复施肥对新竹生长及土壤养分含量的影响

为了解毛竹林带状采伐后采取垦复施肥经营方式对竹林快速更新恢复的效果,筛选最优组合模式,为毛竹林采伐更新恢复过程中高效培育提供理论依据。本研究以福建省漳平市毛竹林地为研究对象,设置8 m采伐宽度,采用竹蔸施肥（A）、垦复方式（B）和施肥比例（C）3因素3水平L₉(3⁴)正交试验设计,探讨带状采伐下毛竹林垦复施肥对出笋数、立竹数以及土壤氮、磷、钾养分含量的影响,分析新竹生长及土壤养分的相关关系。结果表明：3个因素对毛竹出笋数和立竹数重要性顺序相同,均为B>C>A,但对土壤不同养分指标表现不同,其中B因素为首要因素且占较大比例;相关性分析表明,出笋数、立竹数均与土壤全磷、全钾、速效钾呈显著正相关（P<0.05）,出笋数与立竹数、立竹数与土壤速效钾均呈极显著正相关（P<0.01）。综合考虑毛竹林带状采伐后林地迹地更新效果,最优的垦复施肥组合为A₃B₂C₃,即用竹篼施肥2（200 g/竹篼）,垦复方式为带状深翻,氮、磷、钾配比为17∶8∶5。     

蝴蝶兰PhPP2Aa基因作为低温胁迫内参基因的研究

实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其具有简单灵敏、准确高效等诸多优点,成为目的基因表达水平研究最常用的技术手段。而结果的可靠性取决于很多因素,其中使用合适的内参基因是qPCR技术最基本的应用前提。许多研究表明没有一种内参基因可以在任何条件下都能稳定地表达。目前尚未见到关于蝴蝶兰低温生长条件下最佳内参基因选择的有关报道。蛋白磷酸酶2A（PP2A）是真核生物体内一种主要的细胞内源丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。本研究根据蝴蝶兰低温转录组测序结果克隆得到1个PP2A的A亚基基因,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为1764 bp,编码1个含有587个氨基酸的蛋白,将该基因命名为PhPP2Aa,GenBank登录号为MW847782。序列分析结果表明,该基因与其他植物PP2A核苷酸序列相似性均在80%以上,氨基酸序列与小兰屿蝴蝶兰PP2A序列相似性为99.66%。基于氨基酸序列进化分析结果表明,蝴蝶兰PhPP2Aa与小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的亲缘关系最近。将蝴蝶兰PP2A与其他7种候选内参基因（TUA、TUB、ACTIN、F-box、RPL19、RPL36及RPL41）进行实时荧光定量PCR,用3种常用内参基因分析软件对各个基因Ct值进行稳定性分析,结果表明蝴蝶兰8个候选内参基因在低温胁迫条件下表达水平最稳定的内参基因为PP2A,其次为ACTIN;最不稳定的基因为F-box,其次为TUA。以蝴蝶兰PP2A作为内参基因探讨低温胁迫响应基因PhNAC1的表达情况,结果显示蝴蝶兰PhNAC1的表达模式符合低温胁迫条件下的表达特性。该结果表明蝴蝶兰PhPP2Aa基因可作为低温胁迫条件下目的基因转录水平研究的内参基因。