香蕉枯萎病菌拮抗内生细菌GKT08鉴定及抗病促生效果评价

从香蕉枯萎病植株周围健康香蕉植株的根部分离到一株对香蕉枯萎病菌(FOC4)具有明显拮抗作用的内生细菌,通过形态特征、基本生理、生化鉴定及16SrDNA序列同源比较,初步认定该菌株为甲基营养芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus,命名为GKT08。GKT08能够明显抑制FOC4菌落的生长,抑制率为67.1%。盆栽试验表明,GKT08对香蕉枯萎病具有一定的防控作用,接种致病菌44d后的病情指数低于对照15.54%。GKT08能够明显促进香蕉植株的生长,处理60d后香蕉幼苗株高、假茎围和完全展开叶面积分别比对照增加了23.80%、23.36%和19.79%。     

银杏中内生细菌的分离鉴定

从银杏(Ginkgo biloba)组织中分离筛选内生细菌,并利用体外筛选与活体筛选相结合的方法进行植物病原拮抗菌的筛选。结果表明,内生细菌A97对甘薯干腐病、梨黑斑病、柑橘绿霉、苹果青霉等主要园艺产品采后病害具有显著拮抗作用,能够在宿主表面有效定殖,并显著抑制果实表面及伤口处病原菌的侵染,具有良好的应用开发潜力。经过形态特征、生理生化特性以及16SrRNA序列的同源性分析,可确认该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

几个抗疫病性不同的辣椒材料抗病基因同源序列的分离与比较

 根据已克隆抗病基因的保守序列设计简并引物, 对9 个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA 进行抗病基因同源性序列的特异PCR 扩增, 经序列测定和同源性分析发现14 个抗病基因同源性序列(RGAs) 与辣椒抗疫病作用相关, 其中B 引物扩增的8 个RGAs 与烟草抗花叶病基因N 、拟南芥抗丁香假单菌基因RPS2 和亚麻抗锈病基因L6 的同源性较高, 属于广谱(细菌、病毒、真菌) 抗病基因同源序列; C 引物扩增的6 个RGAs 与番茄抗叶霉病基因Cf2 和Cf9 有较高的同源性, 与抗疫病作用密切相关。研究还发现, 高感疫病的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs , 这与已报道的辣椒抗疫病微效QTLs 位点则来于感病亲本基因组的研究结论一致。     

羽毛针禾内生细菌分离鉴定及系统发育树分析

以羽毛针禾根和种子组织为试材,采用传统培养方法和免培养方法研究了组织中分离纯化出的内生细菌,对分离得到的纯菌株进行形态学观察、生理生化鉴定,并结合菌株的16S rRNA基因序列在RDP在线数据库中鉴定其属水平。将测序结果与GenBank中已知序列进行BLAST比对,查找相似性最高的菌种序列进行同源性分析,再通过软件MEGA 7.0构建系统发育树确定菌株的系统分类学地位。结果表明:从羽毛针禾种子和根中分别分离鉴定出4株和7株内生细菌,初步将这些细菌归为2门2纲2目2科2属,种子和根中的优势属分别为泛生菌属和假单胞菌属。在羽毛针禾根和种子中的内生细菌群落结构具有较为丰富的种群多样性,且菌群优势度存在差异。该研究成果为羽毛针禾内生菌资源库信息的积累和羽毛针禾内生微生物的后续开发提供了有利指导和参考依据。     

扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)研究刺芹侧耳细菌病原菌

为分析刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)工厂化栽培中发黄腐烂子实体的细菌组成,构建16SrDNA文库,利用限制性内切酶MspI和RsaI分别对随机克隆进行酶切筛选,并测定代表性克隆16SrDNA序列,BLAST分析结果表明刺芹侧耳子实体病状组织中存有两类菌群,分别为假单胞菌和芽孢杆菌属。同时,对刺芹侧耳子实体病状组织中的细菌进行分离培养、致病性测定、16SrDNA鉴定及BLAST分析,病原细菌与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的同源性较高,其作为引起刺芹侧耳工厂化栽培细菌性病害的病原菌在国内外尚属首次报道。     

2株抗枯萎病尖镰孢菌内生细菌菌株的分离及鉴定

华南地区因尖镰孢菌引起的枯萎病发生较为严重,特别是近年来发现的香蕉枯萎病,对香蕉产业来说更是毁灭性的病害。分离、筛选有拮抗活性的内生细菌是防治枯萎病的有效措施之一。从海南红树林健康叶片中分离到102株非致病性内生细菌菌株,通过室内抗菌活性的测定,得到了2株对枯萎病尖镰孢菌具有明显抑制作用的拮抗菌株。通过对它进行形态、生理生化特性及16SrDNA序列等方面的研究,确定其中1株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,命名为BS-009;另一株确定为新发表种Bacillus Mojavensis的一个相似种,命名为BM-027。     

香蕉ACC氧化酶基因(MAO3)的克隆及其表达特性分析

 根据同源扩增得到香蕉(Musa acuminata) ACC氧化酶基因(MAO3) 的核心部分, 再通过3'和5'RACE扩增上、下游序列以及Genome-Walker的方法得到启动子部分, 共获得3 718 bp长度的序列。将所得结果进行聚类分析, 发现香蕉中ACC氧化酶的氨基酸序列非常保守, 各序列间的同一性高达99% ,与单子叶植物和双子叶植物中ACC氧化酶的氨基酸序列的同源性在66.7%～71.8%之间。组织原位杂交试验表明MAO3基因的表达具有组织特异性, 初步认为是在韧皮部筛管组织中特异表达。运用实时荧光定量PCR技术, 实时监测到了MAO3基因和香蕉乙烯受体基因ERS2受机械伤诱导的定量变化。     

番木瓜内生细菌MG-Y2的鉴定及其生防作用

为筛选具有防病作用的植物内生菌,采用组织分离法和稀释分离法,分离番木瓜果皮中的内生细菌,得到103个菌株。采用培养基平板抑菌圈测定法从这些菌株中筛选到1株具有拮抗活性的细菌MG-Y2,对番木瓜疫霉病菌(Phytophthora nicotianae)、番木瓜炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)等8种病原菌有较强的拮抗作用。通过对其形态特征和生理生化特性测定以及16SrDNA部分序列同源性分析,鉴定该细菌为恶臭假单胞菌生物变种Ⅰ(Psudomonas putida biovarⅠ)。采用喷雾接种处理,MG-Y2可进入番木瓜叶片、叶柄、果皮和果肉中定殖。进行番木瓜果实采后防病试验,MG-Y2对采后番木瓜疫病和炭疽病的防治效果分别达到88.8%和57.4%。试验结果显示MG-Y2具有潜在的生防应用价值。     

宁夏枸杞内生真菌的分离及多样性分析

以枸杞为试材,采用组织分离法从不同品种、不同部位的枸杞组织中进行内生真菌的分离,根据培养性状、菌落、孢子等的形态特征和rDNA-ITS序列分析对分离菌株进行鉴定;根据枸杞内生真菌的相对频率、物种多样性指数、丰富度指数和相似性系数分析其组成特点。结果表明:21份枸杞样品中共分离得到363株内生真菌,这些菌株分属于链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、双极霉属(Bipolaris)、毛壳菌属(Chaetomium)、枝孢属(Cladosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)、光黑壳属(Preussia)、裂壳菌属(Schizothecium)、粪壳菌属(Sordaria)、戴氏霉属(Taifanglania)、梭孢壳属(Thielavia)、火丝菌属(Tricharina)和炭角菌属(Xylaria)14个属,其中链格孢属(Alternaria)、梭孢壳属(Thielavia)和曲霉属(Aspeirgllus)为优势属,分别占分离菌数的46%、14%和13%。枸杞植株各器官都有内生真菌分布,其中,茎部内生真菌多样性指数最大,为0.86,且果与茎部的相似性系数最大。不同枸杞品种间内生真菌分布存在差异,"宁杞1号""宁杞2号"内生真菌多样性指数和丰富度指数远远高于黄果枸杞和黑果枸杞。内生真菌群落组成的相似性结果表明,部分内生真菌具有一定的宿主和组织偏好性。枸杞体内含有丰富的内生真菌资源,其内生真菌具有很高的宿主特异性,而且其分布受生境影响。     

龙胆不同栽培土壤微生物群落结构及其驱动因子

以黑土、沙土和沙壤土为研究对象，采用农化分析技术测定土壤化学因子，利用16S rRNA和ITS技术开展根际土壤细菌和真菌基因组测序研究，以期探讨龙胆不同栽培土壤微生物群落结构及多样性特征。结果表明：3种土壤的养分除了TP以外均存在明显差异(P<0.05),其中，黑土养分含量最高，沙壤土次之。黑土中酸杆菌门、绿弯菌门和担子菌门占优势，在沙壤土中，放线菌门、疣微菌门和被孢霉门占优势，而变形菌门、芽单胞菌门和子囊菌门在沙土中占优势。Shannon和Chao1指数表明黑土微生物群落多样性和丰富度略高于沙壤土，但二者显著高于沙土(P<0.05)。PLS-PM分析表明，土壤有机碳(SOC)与土壤细菌群落结构呈极显著正相关(P<0.01),而土壤速效养分(NH⁺₄-N、NO^-₃-N,AP和AK)与细菌多样性具有极显著负相关关系(P<0.01)。可以看出，SOC和速效养分影响了根际细菌群落结构和多样性，黑土和沙壤土比较适合栽培龙胆。     

甘蓝霜霉病内生拮抗细菌的筛选鉴定及防效研究

以感染霜霉病和健康的甘蓝叶片为试材,研究筛选了对甘蓝霜霉病菌有拮抗作用的内生细菌。结果表明:从健康的甘蓝幼苗中分离到18株内生细菌;用离体叶法进行测定,发现其中2株内生细菌对甘蓝霜霉病菌有拮抗作用,对其中一拮抗效果较好的菌株AC8进行田间防治试验,其防效达61.4%;通过形态观察、培养特征和生理生化特性鉴定,菌株AC8属于蜡状芽孢杆菌。     

红掌根腐病病原鉴定及其PCR 检测方法

 利用真菌通用引物ITS1 和ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列 比较,设计了1 对红掌根腐病菌的特异引物SF1/SR2,对30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和2 种 细菌基因组DNA 进行PCR 扩增。结果表明,只有红掌根腐病菌获得572 bp 的特异带。使用引物SF1/SR2 对华丽腐霉进行PCR 扩增,其检测灵敏度在DNA 水平上可达1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基 因组DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到572 bp 的特异片段,实现了对红掌根腐病菌的快 速可靠的检测。     

黄瓜根际土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE技术分析了接种枯萎病菌后黄瓜根际土壤细菌群落的动态变化。对黄瓜种植前、接菌前、接菌后发病、接菌后未发病以及接种清水(对照)共5份土壤样品直接提取其总DNA,用F338-GC/R518引物扩增16Sr DNA基因的V3可变区,结合DGGE电泳条带分析样品的细菌群落组成及变化趋势。结果显示,接种枯萎病菌后,会引起黄瓜根际土壤中细菌数量及种类发生较大的变化,其中,接种枯萎病菌后Rhodococcus phenolicus(E1)、Clostridiumsp.(E3、E6)以及3种未培养细菌(E2、E4、E5)数量增加,另外2种未培养细菌(A1、A2)数量减少。     

氯化苄法提取植物内生放线菌基因组DNA

以植物内生放线菌菌株GL0806123为试材,用氯化苄快速提取植物内生放线菌菌株GL0806123基因组DNA。建立用氯化苄提取植物内生放线菌基因组DNA的方法。结果表明:用氯化苄法能够成功提取植物内生放线菌菌株GL0806123基因组DNA,以此为模板PCR扩增出16S rDNA区段,测序后可用于菌种鉴定。氯化苄法是一种快速提取植物内生放线菌基因组DNA的方法。     

芝麻立枯病拮抗菌的筛选方案优化

通过对峙培养法,利用PDA、KBM和MYG等3种培养基分别测定399株内生细菌对立枯丝核菌的拮抗作用.结果表明:在3种培养基上均表现出一定拮抗作用的菌株95株,拮抗率为23％.温室条件下测定399株内生细菌对芝麻立枯病的生防效果,共筛选到25株茵可有效降低芝麻立枯病发病率和严重度.优化后的筛选方案为:首先利用3种培养基对内生细菌的拮抗性进行体外初筛,选择3种培养基上均有拮抗性的菌株为目标菌株(95株),再将初筛的拮抗性菌株进行体内复筛,选择可有效降低芝麻立枯病发病率和严重度的生防菌株(22株).     

DNA sequencing reveals false positives during the detection of aster yellows phytoplasmas in leafhoppers

During the summer of 2001 and 2002, 850 and 865 carrot plants and 926 and 2584 leafhoppers associated with aster yellow (AY)-type disease were collected from five fields in Manitoba, Canada. DNA was extracted from 999 individual leafhoppers and 381 leaf tissues from both apparently healthy and AY-like infected carrot plants. All DNA samples were examined by PCR for the presence of phytoplasmas using three universal primer pairs P1/P6, P1/P7 and R16F2n/R2 derived from phytoplasma rDNA sequences. DNA amplification with these three primer pairs generated the expected amplification products of 1.7, 1.5 and 1.2 kb, respectively. Diluted PCR products obtained using universal primer pair P1/P6 were nested with R16F2n/R16R2n. The latter set of primers amplified DNA samples from 92 carrot plants and 83 leafhopper samples. In order to assess the diversity among insect and plant phytoplasmas, nested PCR products from all 92 carrot and 83 leafhopper samples were subjected to RFLP analysis using restriction endonucleases KpnI, MseI, and HhaI. This RFLP analysis showed similar patterns among carrot and leafhopper samples. Phytoplasmas detected in most samples belonged to the subgroup 16Sr-IA. To understand why the R16F2n/R16R2n of primers did not amplify the PCR product obtained from the first PCR in the remaining samples, four PCR products of P1/P6 from two plants (representing 16Sr-IA and 16Sr-IB) and two leafhopper samples that did not amplify with nested PCR, were used for DNA sequencing. ¹ The BLAST analysis of the obtained sequences showed that the PCR amplicons from the two carrot samples precisely matched with the GenBank sequences of known phytoplasmas. Alignments of these two sequences have shown very slight variations (transition/transversion ratio mean of 0.539) that would correspond to the minor differences at the 16S level between the 16Sr-IA and 16Sr-IB phytoplasma subgroups. The sequences of PCR products obtained from the two insect samples had similarity (>98%) with the sequences of phytoplasma in carrot except that their length differed from the carrot samples by 6 bp. They actually matched bacterial sequences from the GenBank, indicating that a single PCR using P1/P6 was not enough to detect phytoplasma in leafhoppers.     

火龙果Ty1-copia类反转录转座子反转录酶序列的克隆及分析

 根据Ty1-copia类反转录转座子反转录酶的保守区设计简并引物,通过PCR扩增,从火龙果基因组中扩增出260 bp左右的目标条带,经回收、克隆、测序及序列分析,获得了23条来源于火龙果试管苗变异和非变异材料的反转录酶序列。通过系统演化分析,所得序列可分为5类,存在较高的异质性;与母株相比,变异植株的反转录酶序列存在缺失、移码和终止密码子突变。经反转录酶氨基酸序列对比,火龙果与其它物种间具有较高的同源性,表明在不同物种间可能存在反转录转座子的横向传递作用。     

Spacing Experiments on Vegetables: V. The Effect of Spacing and Manuring on the Composition of the Foliage of Shallots and Globe Beet,Considered in Relation to the Growth of the Plants

Summary

A leaf curl disease was observed on croton (Codiaeum variegatum L.), a popular ornamental plant in botanical, home, and office gardens in and around Bengaluru, South India. Diseased plants showed typical symptoms of vein thickening, severe inward curling and a reduction in leaf size, and stunting. The pathogen responsible was transmitted to healthy croton plants by grafting of infected scions, and through the whitefly vector, Bemisia tabaci, suggesting that the disease was caused by a begomovirus. The association of a begomovirus with the disease was further confirmed by the amplification of viral DNA fragments of ca. 520 bp and 575 bp derived from the coat protein (CP) gene of DNA-A using degenerate primers and total DNA extracted from infected, but not from healthy croton plants. The 575 bp fragment corresponding to the core region of the CP gene was cloned and sequenced. Phylogenetic analysis of the core CP sequence grouped the croton-infecting begomovirus, which we tentatively called croton leaf curl virus (CrLCuV), with Ageratum yellow vein virus (AJ810825), with which it shared the highest nucleotide identity (95%). The core CP sequence was similar (90 – 95%) to many other begomoviruses from the Indian sub-continent that infect tomato, tobacco, cotton, and papaya. Thus, its precise taxonomic denomination will require sequencing of the complete ssDNA viral genome.     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系研究

研究建立了根癌农杆菌介导的矮牵牛遗传转化体系.结果表明最佳的不定芽诱导分化和继代培养基为:MS 6-BA1.5 mg/L NAA0.2 mg/L;选择培养基中30 mg/L卡那霉素和300 mg/L的头孢霉素是适宜的抗生素使用浓度;侵染过程中0.05 MPa负压处理5 min和共培养过程中添加20 mg/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经2次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PGR-Southern杂交,证实外源基因已整合进入矮牵牛基因组中.