柑橘倍性操作技术与育种现状、难点及展望

柑橘染色体倍性操作技术研究与应用取得了较大进展:1.三倍体、四倍体报道较多,已有三倍体、四倍体新品种发布;2.部分四倍体作为砧木在控制树形、抗病、抗逆等方面有较好的表现;3.单倍体、双单倍体用于柑橘基因组研究获得重大进展。但柑橘倍性操作仍面临一些难点:1.童期长和珠心胚干扰影响多倍体新品种培育进度;2.单倍体和双单倍体获得依然较难;3.部分优质材料的育性低,以其多倍体为亲本的杂交育种受到限制。针对童期较长的问题,有必要应用缩短童期技术,或利用短童期资源对童期长的材料进行改良。针对珠心胚干扰的影响,应开发更多的单胚性四倍体材料,还可结合胚抢救、分子标记鉴定等方法提高多胚性四倍体为亲本创制三倍体的效率。关于将来柑橘倍性操作与育种研究的建议:1.提高2n配子的产生频率,以开发更多的多倍体类型,尤其是单胚性品种多倍体创制;2.发挥多倍体作为砧木的优势,促进砧木育种发展;3.继续诱导和利用柑橘单倍体、双单倍体,以利于柑橘基因组、功能基因研究和育种;4.以异源多倍体创制技术为基础,结合染色体操作技术培育仅带少量近缘物种基因组成分且具有目标性状的新种质。     

国庆1号温州蜜柑珠心胚苗培育及四倍体发掘

【目的】温州蜜柑一般表现为雄性不育、果实无核，收集国庆1号温州蜜柑（Citrus unshiu Marc.，简称G1）种子，用于培育珠心胚苗并发掘多倍体新种质，为其提纯复壮和珠心胚变异育种提供基础材料。【方法】从G1成熟果实剥取种子，浸泡消毒后离体播种至播种培养基；待幼苗长至有3～5枚真叶时，采用流式细胞仪分析倍性和SSR分子标记鉴定遗传来源。【结果】从约12 500个果实中剥取获得106粒种子，离体播种后41粒种子萌发，经培养获得62株实生幼苗；对所有幼苗进行倍性检测，获得四倍体1株，其余61株均为二倍体；用4对多态性SSR引物对获得的四倍体和随机筛选的38株二倍体植株进行分子鉴定，表明发掘的四倍体和35株二倍体的带型与亲本G1完全一致，推测其均为珠心胚来源，且四倍体为G1珠心细胞自然加倍而形成；其余3株二倍体在部分SSR位点与G1带型不一致，推测由G1与周边其他品种杂交而来。【结论】这些珠心胚苗二倍体及四倍体种质为国庆1号温州蜜柑提纯复壮、珠心胚变异育种及相关基础研究提供了珍贵的种质资源。     

三倍体葡萄柚实生后代多倍体的发掘与SSR遗传鉴定

【目的】从三倍体葡萄柚自然授粉的实生后代中发掘多倍体,希望获得一批多倍体新种质,并为探索三倍体遗传规律奠定基础。【方法】秋季采摘三倍体葡萄柚成熟果实,剥取种子,MT+1 mg·L-1GA3培养基播种,待种子萌发后,用流式细胞仪快速检测其倍性,并采用SSR(simple sequence repeat)分子标记鉴定其不同倍性后代植株的来源。【结果】获得了二倍体、三倍体、四倍体、五倍体、六倍体和疑似非整倍体等不同倍性的再生植株各172、52、7、1、1、18株。用13对多态性SSR引物鉴定其来源,结果表明,由二倍体可能三倍体母本所产生的1X配子与周边其他二倍体品种的花粉授粉而来,也可能由三倍体母本产生的重组型2X配子的无融合生殖而来;三倍体大部分由珠心细胞发育而来;四倍体为杂交起源的四倍体;五倍体和六倍体与母本(三倍体葡萄柚)的带型完全相同。【结论】上述活体材料的发掘为柑橘多倍体育种奠定了种质基础。     

尤力克柠檬与四倍体夏橙杂交幼胚试管培养试验初报

正世界各国十分重视柑橘育种,三倍体无籽育种一直都是各育种专家比较重视的柑橘育种方向之一。利用二倍体与四倍体进行有性杂交仍是目前柑橘获得三倍体育种材料的重要途径,但柑橘二倍体作母本与四倍体材料人工授粉受精后产生的三倍体杂种胚在杂交果实生长发育途中极易败育,与此同时杂种胚的获取亦容易受二倍体母本胚性干扰。利用幼胚试管培养技术~([1~3])可有效克服柑橘二倍体作母本与四倍体杂种胚败育问题,及有助于直接分离单、多胚不同     

以异源四倍体体细胞杂种为父本与二倍体杂交创造柑橘三倍体的研究

 2001～2002连续两年, 以沙田柚、本地早橘、中秋橘、HB柚、国庆4号温州蜜柑等二倍体品种为母本, 以NS (橘柚+无酸甜橙) 、NH (橘柚+ HB柚) 、SH (无酸甜橙+ HB柚) 、VM (伏令夏橙+橘橙) 、HD (甜橙+丹西橘) 等优良四倍体体细胞杂种的花粉授粉, 通过胚挽救技术获得再生植株。经细胞流式仪和染色体计数观察表明, 两年从10个授粉组合中共获得244株三倍体和10株四倍体。在这些三倍体中有147株来自沙田柚为母本的组合。目前已有172株三倍体和4株四倍体植株移栽成活。这些材料为进一步选育无核三倍体品种奠定了基础。     

以雄性不育胞质杂种‘华柚2号’为母本创制柚有性群体

【目的】以具有胞质雄性不育特性的‘华柚2号’为母本与有核柚品种有性杂交,以期转移其不育胞质进而实现二倍体水平的无核柚改良。【方法】以‘华柚2号’为母本‘,沙田柚’和‘鸡尾’葡萄柚为父本分别配置杂交组合,并对其子代遗传来源和单/多胚性早期鉴定。【结果】分别从‘沙田柚’和‘鸡尾’葡萄柚为父本的杂交组合获得实生苗1 018和687株;用3对多态性SSR标记对实生苗的遗传鉴定表明均为父母本有性后代。以单/多胚性分子标记进行的早期胚性鉴定表明‘,沙田柚’为父本的有性后代均为单胚性;而‘鸡尾’葡萄柚为父本的后代,单胚与多胚性比例为2.86∶1。【结论】以‘华柚2号’为母本创制的有性后代为无核柚改良以及柑橘雄性不育恢复基因定位和克隆奠定了种质基础。     

三倍体无核葡萄育种研究进展

综合有关文献综述了三倍体无核葡萄育种研究的最新进展。探讨了三倍体葡萄育种的主要途径如利用二倍体和四倍体杂交、胚乳培养、利用2n配子和芽变选择等。概述了三倍体葡萄的无核机理、三倍体鉴定方法、胚挽救技术应用。简要介绍了国内外育成的7个三倍体无核葡萄新品种尾玲、戴拉王、蜜无核、美嶺、夏黑、无核早红和马格拉契的特征特性,并讨论了三倍体无核葡萄育种存在问题和未来的研究重点如杂交亲本的选择、三倍体杂合胚的发育特点和无核性状的遗传规律等。     

无核葡萄胚挽救育种与杂种后代分子标记辅助选择

【目的】对无核葡萄胚挽救影响因素与‘美丽无核’幼胚和胚乳的发育及败育过程进行研究,为提高胚挽救效率提供理论依据;通过大田杂交与胚挽救育种技术,从中选出无核杂种优株,为选育无核新品种提供材料。【方法】以8个杂交组合的杂种后代为材料,研究亲本基因型、取样时期和胚发育培养基相态对成苗率的影响,同时通过分子标记辅助选择对杂种后代进行无核性状检测;采用石蜡切片法对‘美丽无核’的幼胚和胚乳的发育与败育进程进行细胞学观察。【结果】利用胚挽救技术从8个杂交组合中获得杂种单株468株。其中‘昆香无核’ב新郁’杂交组合成苗率较高,为9.48%;‘火焰无核’ב昆香无核’、‘昆香无核’ב红宝石无核’、‘红宝石无核’ב克瑞森无核’杂交组合分别在授粉后41、47和55 d取样,进行胚挽救的成苗率最高;‘火焰无核’ב昆香无核’和‘红宝石无核’ב克瑞森无核’在固体培养基上成苗率较高;‘昆香无核’ב北醇’在固体或固液双相培养基上的成苗率无显著差异;利用无核基因探针GLSP1-569、SCAR标记SCF27-2000对4个杂交组合的326个杂交后代进行筛选,初步确定210个株系携带无核基因;‘美丽无核’幼胚发育至球形胚时期开始败育,时间为花后38 d。【结论】‘昆香无核’和‘红宝石无核’适宜作无核葡萄胚挽救育种的母本材料;以‘火焰无核’‘昆香无核’和‘红宝石无核’为母本的杂交组合的最佳取样时期分别为授粉后41、47和55 d;不同母本的杂交组合对胚发育培养基的相态要求有差异;‘美丽无核’作母本材料时适宜取样时期为花后34～36 d。     

柑橘10个品种实生后代多倍体的发掘及SSR鉴定

秋季采摘柑橘成熟果实并剥取种子,将小粒种籽和瘪籽播于MT培养基,待萌发长出2～3片真叶时,取其叶片检测倍性;将饱满种籽播种于露地,对其幼苗首先通过形态筛选获得似多倍体的植株,然后取其叶片用流式细胞仪进行倍性检测;最后对获得的多倍体植株进行SSR分子鉴定。试验结果表明,获得早金甜橙、卡特夏橙、塔罗科血橙、日辉橘、Ortanique橘橙、默科特橘橙、华农本地早橘、朱红橘和Flame葡萄柚等9个品种的四倍体分别为6、1、3、12、3、6、2、1和10株;获得早金甜橙、塔罗科血橙、Itabori甜橙和Ortanique橘橙等4个品种的三倍体分别为1、1、2、4株。用13对多态性SSR引物对胚抢救获得的三倍体和四倍体的来源进行鉴定,发现早金甜橙、Itabori甜橙的三倍体再生植株为异源三倍体;塔罗科血橙、Ortanique橘橙的三倍体可能为同源三倍体;早金甜橙和Ortanique橘橙的四倍体可能为同源四倍体;塔罗科血橙四倍体为异源四倍体。采用37对多态性引物对从饱满种籽中获得的8个品种四倍体的来源进行鉴定,发现均为同源四倍体。这些自然发掘的多倍体资源对柑橘无核育种和相关基础研究具有重要价值。     

以柑橘多胚性二倍体母本倍性杂交培育三倍体

2009-2012年,以柑橘8个多胚性二倍体品种为母本与近年始花的5个异源四倍体体细胞杂种和1个同源四倍体分别杂交,培育三倍体新种质。连续4年共配置15个杂交组合,授粉4 442朵花,坐果1 484个,平均坐果率33.4%;用于幼胚挽救的果实1 075个,共培养幼嫩种子12 578颗,经生芽、生根诱导获得再生植株2 832个;以流式细胞仪对所有再生植株倍性检测,15个组合共获得三倍体401个,四倍体121个;移栽成活三倍体349个,四倍体98个。对W. 默科特 × NH组合89个株系的三倍体的SSR分子鉴定表明,所有三倍体后代均为双亲的有性杂种。     

利用胚挽救技术创制葡萄多倍体种质的研究

为培育三倍体无核葡萄新品种,以二倍体欧洲葡萄无核品种红宝石无核、爱莫无核、黎明无核和欧山杂种北醇及四倍体欧美杂种藤稔、黑奥林为亲本,进行了红宝石无核×藤稔、黎明无核×藤稔、爱莫无核×黑奥林、藤稔×北醇、黑奥林×北醇5个组合的杂交,通过胚挽救技术获得杂种幼苗41株。在此基础上,利用流式细胞术、染色体计数的方法对所获得的杂种幼苗进行了早期倍性鉴定,结果表明有10株杂种为三倍体,6株为四倍体,4株为非整倍体,其余21株为二倍体。这将为进一步选育出三倍体无核葡萄新品种和提供新的育种材料奠定基础。     

利用流式细胞术快速鉴定169份香蕉种质资源的染色体倍性

【目的】利用流式细胞术快速测定169份香蕉种质资源的倍性,以期为香蕉遗传进化以及杂交育种研究提供理论依据。【方法】研究以‘小果野蕉’(AA)为内参,分析香牙蕉(Musa AAA Cavendish)、大蕉(Musa Dajiao)、粉蕉(Musa ABB Pisang Awak)、棱指蕉(Musa ABB Bluggoe)、龙牙蕉(AAB)、贡蕉(AA)、野生蕉等不同类型香蕉种质资源的染色体倍性。【结果】野生蕉、贡蕉均为二倍体,香牙蕉、棱指蕉、龙牙蕉均为三倍体,大蕉和粉蕉多数为三倍体,‘畦头大蕉’‘景洪野大蕉’‘粉杂1号’为四倍体。本研究中的香蕉杂交组合‘高州中把大蕉’ב那邦野蕉’、‘高州中把大蕉’ב广宁野生蕉’、‘高州中把大蕉’ב阿宽蕉’、‘华农中把大蕉’ב阿宽蕉’的后代均为四倍体,而‘广粉1号’ב那邦野蕉’为三倍体。‘海南红蕉’和‘飞亚-25’为三倍体。【结论】香蕉基因组和倍性十分复杂,根据形态特征鉴定香蕉染色体倍性,其结果可靠性很低。以嫩叶为材料,采用FCM技术可以快速、准确鉴定香蕉资源的倍性。     

沙田柚多倍体遗传差异的SSR分析

应用21对柑橘SSR引物对7份有沙田柚血缘的不同倍性材料进行了基因组的遗传差异分析。平均每对引物扩增出3个等位基因,每对引物可检测到的等位基因数目为2～5个不等,多态性带纹为62.5%。NTSYS软件进行相似系数计算,7份材料的相似性系数为0.763～0.892。UPGMA法聚类分析,在相似性系数为0.83处可划分为3类,即3株天然四倍体为第Ⅰ类;2株人工同源四倍体与1株天然三倍体为第Ⅱ类;二倍体母株为第Ⅲ类。天然三倍体与二倍体的遗传相似性较四倍体与二倍体的遗传相似性更高。4对引物(CAT01,TAA33,AG14 and TC26)可以区分天然四倍体与人工同源四倍体。与亲本二倍体母本相比,所试三倍体和四倍体均发生了DNA水平变异,表现为带纹缺失同时又增加了新的带纹。这些多倍体试材可为培育无核三倍体柑橘提供丰富变异的亲本材料。     

6-BA对抗寒无核葡萄胚挽救的影响

【目的】探讨提高抗寒无核葡萄胚挽救育种效率的方法。【方法】以4个种子败育型无核葡萄品种‘火焰无核’‘海王星’‘木星’和‘红宝石无核’为母本,欧山杂种(品种)‘北醇’为父本进行杂交,将杂交胚珠接种于添加不同质量浓度6-BA的MM3+500 mg·L-1水解酪蛋白(CH)+1 mmol·L-1丝氨酸(Ser)培养基上进行培养。【结果】除‘海王星’ב北醇’外,供试的其他杂交组合均在添加6-BA质量浓度为0.5 mg·L-1时,胚珠发育率、萌发率和成苗率最高,差异达到显著水平;当6-BA的质量浓度为1.0 mg·L-1时,对胚挽救效率具一定程度的促进作用或作用不显著;当6-BA的质量浓度为1.5 mg·L-1时,对‘火焰无核’ב北醇’‘木星’ב北醇’‘海王星’ב北醇’杂交后代胚的成苗起到一定程度的抑制作用。【结论】不同的杂交组合对不同质量浓度6-BA的敏感程度不同,0.5 mg·L-16-BA能够提高无核葡萄胚挽救效率;首次选用的抗寒无核品种‘木星’和‘海王星’均可作为无核葡萄胚挽救育种的母本。     

基于胚抢救技术的枳雀×枳杂交群体创建及鉴定

【目的】新资源获得是开展育种的前提和基础,通过两种砧木杂交,创造出聚合两种砧木优良性状的新型砧木资源材料。【方法】以枳雀为母本、枳为父本进行杂交实验,结合胚抢救技术获得子一代植株,利用形态学观察及SSR分子标记技术对子一代进行鉴定。【结果】三年胚抢救实验共接种3 146粒种子,获得胚抢救幼苗1250株,成苗率为39.73%。其中通过形态学鉴定出41株杂种苗,共筛选出8对SSR引物来对父本母本进行区分,其中的CS014RCS014F、CS065R-CS065F引物组合可以准确地鉴定出杂种后代,通过SSR分子标记鉴定出20株有性杂种植株。所获得的61株杂种资源为将来深入开展柑橘砧木育种研究工作奠定了材料基础。【结论】以多胚性柑橘为母本的杂交组合获得的成熟种子,难以通过直接播种的方式获得杂种苗。将胚拯救与分子鉴定相结合,通过SSR分析,找到可靠的SSR引物对鉴定杂交后代,为柑橘砧木育种的进一步研究奠定了物质基础。     

依据多倍体形态特征快速高效发掘柑橘四倍体

基于柑橘多胚性品种存在珠心细胞自然加倍的特点，建立了基于种子催芽、生长室实生播种、幼苗“观根辨叶看油胞”形态初选和流式细胞仪倍性鉴定的发掘柑橘四倍体的快速方法。采用该方法，分别从无酸甜橙、红江橙、贡柑、年橘、新会柑、滑皮金柑的432、506、1 356、1 870、2 749和685株实生苗中，发掘出疑似四倍体5、6、5、17、45、7株；通过倍性检测，从上述6个品种分别获得四倍体4、5、5、14、39、5株，形态初选准确率分别为80.0%、83.3%、100.0%、82.4%、86.7%和71.4%。与之前的四倍体发掘方法相比，本方法四倍体初选准确率高，并且从种子播种到获得四倍体植株耗时不超过40 d。SSR分子鉴定表明，所鉴定的四倍体均来自其二倍体品种珠心细胞自然加倍形成的双二倍体，为柑橘三倍体无核育种提供了珍贵的四倍体亲本资源。     

试管嫁接提高柑桔三倍体组培苗成苗率试验

选育三倍体类型是柑桔育种的热点之一。四倍体与二倍体杂交是获得三倍体的一条有效途径。但三倍体胚有早期败育的现象,为了获得三倍体植株,幼胚须进行早期离体培养。本实验室以异源四倍体柑桔体细胞杂种为父本与二倍体有籽品种或类型杂交,通过幼胚早期离体培养,获得了一批三倍体植株。但是,由于三倍体幼胚离体培养再生的试管苗大部分生长势很弱,生长慢,根发育不良,难以形成完整植株,即使成株,移栽成活率也较低。为了提高三倍体幼胚成苗率及移栽成活率,获得生活力强的三倍体材料,我们进行了试管微嫁接及不同时期移栽的试验。１材…     

两个三倍体苹果新种质形态差异研究初报

以2种类型群体的三倍体种质为试材,比较分析了株系间及群体间的形态差异.结果表明.齐纳金实生后代所获得的三倍体种质各形态指标遗传变异幅度较大,表现出了丰富的遗传多样化;寒富与四倍体种质4-9杂交获得的三倍体种质群体相对整齐.乔纳金实生后代得到的3倍体植株生长势弱、叶片皱褶,而寒富与四倍体种质4-9杂交得到的三倍体植株生长势强、叶片舒展.     

本地早蜜橘胚性愈伤组织的离体诱导

柑橘胚性愈伤组织诱导技术在柑橘种质资源离体保存、理化诱变、原生质体融合、外源基因转化等柑橘种质保存及新种质创制过程中有着重要的基础研究地位。目前随着柑橘分子生物育种技术的快速发展,胚性愈伤组织作为柑橘理化诱变、原生质体融合、外源基因转化的理想起始材料,其在柑橘种质创新研究中的基础应用作用更为明显。柑橘胚性愈伤组织目前主要可通过败育的成熟胚珠、未成熟胚珠、实生幼苗胚轴茎段、子叶以及花药培养等途径来诱导获得。     

‘希姆劳特’与不同倍性玫瑰香型葡萄杂交胚挽救技术研究与倍性鉴定

以葡萄二倍体无核品种‘希姆劳特’为母本,分别与二倍体玫瑰香优系和四倍体‘巨玫瑰’杂交胚珠,及‘希姆劳特’自交胚珠为试材进行胚挽救试验,研究亲本基因型、取样时期、胚发育培养基、培养温度对杂交胚生长发育的影响,并通过染色体计数法对‘希姆劳特’与‘巨玫瑰’杂交幼苗进行倍性鉴定。结果表明:‘希姆劳特’×玫瑰香优系的杂交胚发育率、萌发率(18.18%、13.64%)均显著高于‘希姆劳特’ב巨玫瑰’(13.45%、4.20%)和‘希姆劳特’自交(7.03%、6.25%);‘希姆劳特’×玫瑰香优系、‘希姆劳特’ב巨玫瑰’杂交胚珠及‘希姆劳特’自交胚珠的最佳取样时间均为授粉后54 d;‘希姆劳特’×玫瑰香优系、‘希姆劳特’ב巨玫瑰’杂交胚珠在25℃下培养胚发育率更高,适于‘希姆劳特’×玫瑰香优系、‘希姆劳特’ב巨玫瑰’杂交胚发育的培养基为:Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L 6-BA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L琼脂+1g/L活性炭。经根尖染色体倍性鉴定,‘希姆劳特’ב巨玫瑰’获得1株三倍体幼苗,2株二倍体幼苗。