黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,CMV质粒作为RT-PCR反应的阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增.对2002-2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的767bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物.结果表明98份材料中96.94%检测到CMV.     

应用多重RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒

 根据病毒外壳蛋白基因序列, 设计了2对检测百合无症病毒(LSV) 、百合斑驳病毒(LMoV)的引物, 对扩增条件进行优化, 建立了同时检测LSV和LMoV的多重RT-PCR检测方法。此方法可特异地从带有LSV和LMoV的样品中扩增出2条带LSV (876 bp) 、LMoV (662 bp)。灵敏性测定结果表明, 该双重PCR可从稀释10⁴ 组织中检测出病毒, 具有与单一PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明, LSV扩增产物与其它分离物核苷酸同源性为87.8%～99.3%, LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为90.1%～99.5%。     

马铃薯X病毒的RT-PCR检测

 通过对“一步法”RNA提取方法的改进，简化了提取程序，并保证了RNA的质量。根据马铃薯x病毒(PVX)基因序列设计合成了一对特异性引物，运用反转录PCR (RT-PCR)对PVX-RNA进行扩增，成功得到了与预期大小相一致的308 bp片段，而对照未得到任何产物，同时对反转录酶AMV用量做了不同的处理，得出AMV仅用1u仍能得到较好扩增的效果。从而建立了经济简便的PVX的RT-PCR检测体系，为PVX的防治、脱毒苗的检测提供有效手段。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

库尔勒香梨上ACLSV的RT—PCR检测

以库尔勒香梨叶片和皮层为材料通过改进提取方法提取总RNA,获得了较完整的RNA,在此基础上进行了反转录和PCR扩增。并进行了库尔勒香梨上ACLSV(Apple chlorotic leaf sopt virus)的RT-PCR检测,建立了该病毒的RT-PCR检测体系。用此体系扩增得到了ACLSV一个长约为358bp的片段。     

番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 TY-1的 PCR 检测

利用特异引物对3份抗病纯合材料(基因型Ty-1/Ty-1)和4份感病纯合材料(基因型ty-1/ty-1)进行PCR扩增,抗、感材料均产生398bp的PCR扩增片段,抗病和杂合抗病材料的酶切产物存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303和98bp以及398、303和98bp的片段,而纯合感病材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为398bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及抗病杂合材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对13份番茄杂交种进行检测,有8份杂交种含有Ty-1抗病基因,3份材料不含Ty-1抗病基因。利用这条标记对国内的13份番茄自交系进行检测,13份材料均不含Ty-1抗病基因。     

番茄抗病基因Ty-1的CAPS标记及检测

为了获得番茄抗病基因Ty-1的分子标记,利用特异引物对3份抗病纯合材料（基因型Ty-1/Ty-1）和3份感病纯合材料（基因型ty-1/ty-1）进行PCR扩增,抗病、感病材料均产生400 bp的PCR扩增片段,感病和杂合抗病材料的酶切产物存在RsaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了350、50 bp以及400、350、50 bp的片段,而抗病纯合材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为400 bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对33份番茄F1进行检测,有20份材料含有抗病基因Ty-1,13份材料不含抗病基因Ty-1。利用该标记对国内的24份番茄自交系进行检测,24份材料均不含抗病基因Ty-1。经反复验证,结果准确可靠,该标记可以用于对番茄抗病基因Ty-1的筛选鉴定。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

3种苹果潜隐病毒多重RT-PCR检测体系的建立

 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 的多重RT-PCR方法。以复合感染3种病毒的苹果‘望山红’组培苗为试材, 对影响多重PCR的反应条件进行了一系列的调整和优化。多重RT-PCR体系灵敏性测验显示, 最低能从RNA总量187.5 ng的样品中检测3种病毒的存在。多重RT-PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性, 12个田间苹果样品的多重RT-PCR检测结果与单一PCR的结果一致, 初步证明了多重RT-PCR检测的准确性。     

柑橘4种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)和柑橘叶斑驳病毒(CLBV)是影响柑橘生产的重要病毒性病害,建立快速、准确的检测方法是防控该病害的基础。本研究通过筛选针对4种病毒基因组保守区域设计的特异性引物,优化影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、退火温度,建立了可同时扩增4种病毒的多重RT-PCR检测体系。该检测体系扩增的特异片段大小分别是CTLV 889 bp、CYVCV 612 bp、CTV 462 bp和CLBV 294 bp,扩增产物清晰,特异,检测灵敏度较普通单重RT-PCR灵敏度低约10倍。采用多重RT-PCR和单重RT-PCR对收集到的59份田间样品分别进行检测,结果显示2种方法检测结果一致,4种病毒的检出率在11.9%～54.2%之间。建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、灵敏地检测单一或复合侵染的4种柑橘病毒。