刺葡萄0943抗白腐病转录因子VdWRKY49的克隆及序列分析

【目的】获得来源于中国野生抗病种质刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因,揭示其序列特征、基因功能与抗葡萄白腐病之间的关系,初步揭示抗病种质抗病机制。【方法】利用同源克隆的方法分别获得刺葡萄0943的转录因子Vd WRKY49基因的编码区和启动子区域,分析其序列特征,通过实时荧光定量检测其对白腐病菌和水杨酸诱导的反应,同时以感病品种欧亚种‘黑比诺’为对照,分析不同种质中的转录因子Vd WRKY49基因序列及表达差异。【结果】来源于中国野生种质刺葡萄0943的Vd WRKY49基因,在其编码区和启动子区域都有抗病基因的序列特征和位点特征,同时也存在不同,在DNA和氨基酸水平上与来源于欧亚种的‘黑比诺’Vv WRKY49有差异,这些差异可能造成了其结构功能的差异;受到葡萄白腐病和水杨酸诱导后,Vd WRKY49基因的表达量明显高于Vv WRKY49。【结论】来源于刺葡萄0943的Vd WRKY49基因受到白腐病菌和水杨酸诱导后表达量和表达模式明显区别来源于‘黑比诺’的Vv WRKY49基因,推测在葡萄抗病途径中转录因子WRKY49具有重要的生物学作用。     

中国山葡萄‘双红’胺氧化酶(amine oxidase)基因的抗霜霉病研究

【目的】探究高抗霜霉病的中国山葡萄‘双红’中胺氧化酶(VaAO)在抗葡萄霜霉病中的作用。【方法】以中国山葡萄‘双红’为试材,采用RT-PCR技术,克隆山葡萄‘双红’的AO基因,命名为VaAO;利用RT-qPCR在转录水平上分别检测了抗病的山葡萄‘双红’和感病的欧亚种葡萄‘赤霞珠’接种霜霉菌后AO的表达模式;通过农杆菌介导的瞬时转化法,使VaAO分别在本氏烟草和葡萄‘赤霞珠’中瞬时过表达;利用DAB染色法,检测H_2O_2的积累。【结果】VaAO基因的开放阅读框(ORF)长2 184 bp,编码727个氨基酸。经BLAST比对发现VaAO氨基酸序列与欧亚种葡萄‘黑比诺’的氨基酸序列同源性高达99%。定量结果表明:抗病的‘双红’和感病的‘赤霞珠’的AO基因均受到霜霉菌诱导,且相对表达量都在接种72 h后达到最高峰。值得注意的是,VaAO在接种后24 h表现出显著上调。VaAO在烟草中瞬时表达后发现其蛋白定位在细胞核和细胞膜中。VaAO在‘赤霞珠’叶片中瞬时过表达能够显著提高叶片中H2O2的积累和抵抗霜霉病的能力。【结论】成功克隆了山葡萄‘双红’的VaAO基因,定量分析和瞬时表达均表明VaAO基因在参与葡萄抗霜霉病的过程中发挥了重要作用。     

中国野生葡萄芪合成酶基因STS19及其启动子的克隆与功能分析

以中国野生山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）‘通化3号’和刺葡萄（V. davidii Foex.）‘塘尾’为材料，克隆得到芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19。序列分析发现VaSTS19和VdSTS19的编码区均为1 179 bp，编码392个氨基酸，定位于16号染色体，二者核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.81%和98.21%。亚细胞定位结果显示VaSTS19和VdSTS19均定位于细胞膜、细胞质和细胞核。将35S强启动子连接VaSTS19和VdSTS19转入番茄能显著促进STS19的表达及番茄中白藜芦醇的合成和积累。分别从两种材料中克隆得到VaSTS19和VdSTS19的启动子。顺式作用元件分析表明，二者启动子中均包含多个胁迫应答元件、激素应答元件及光应答元件。序列分析发现二者启动子序列与欧洲葡萄VST2启动子序列同源性为60%。转基因烟草叶片中二者不同长度启动子片段对SA和MeJA诱导响应明显。结果表明STS19的表达模式和白藜芦醇的合成可能与其上游启动子类型和调控有关。     

四种植物提取物对抵御葡萄霜霉病菌的影响

以对霜霉病具有抗性的葡萄品种‘左优红’和‘Fredonia’、委陵菜、无花果为试材,制备丙酮和2种乙醇提取物,研究4种植物的不同提取物在感病葡萄品种‘霞多丽’抵御霜霉病侵染中的作用,观测其对‘霞多丽’葡萄叶片多酚氧化酶(PPO)和β-1,3葡聚糖酶(Glu)活性的影响。结果表明:4种植物的提取物100倍稀释液均可在一定程度上降低葡萄霜霉病菌对‘霞多丽’叶片的侵染率,提取物作用效果强弱依次为70%乙醇委陵菜叶片提取物(60℃提取3h)50%丙酮的‘Fre-donia’叶片提取物70%乙醇的‘左优红’的提取物(50℃水浴提取5h),而无花果提取物作用最差;有效提取物均能不同程度地提高‘霞多丽’葡萄叶片的PPO和Glu活性。     

葡萄种质资源对叶片白腐病的抗性鉴定及评价

【目的】葡萄白腐病是葡萄生产中导致重大损失的主要原因之一,挖掘抗病种质,阐明抗病机制,以期为抗病育种提供种质资源储备。【方法】利用离体接种的方法系统评价了中国野生葡萄种质、欧亚种及部分杂交种对葡萄白腐病的抗性,并以葡萄抗病中的关键基因为指示基因,探讨抗病种质和感病种质的不同抗病模式。【结果】对78株葡萄属17个种进行离体接菌评价后,对不同来源的种质进行了抗性分类,其中刺葡萄♂(Vitis davidii)是最抗白腐病种质,欧亚种‘美人指’(Vitis vinifera‘Manicure Finger’)最为感病。5个WRKY基因已经验证在葡萄抗病中起作用,笔者以最抗病的刺葡萄和最感病的‘美人指’进行基因型表达分析。以WRKY基因为指示性基因,检测了其介导的抗性途径中的关键基因PR、NPR1等在抗性葡萄刺葡萄和感病葡萄‘美人指’中的表达,并探讨WRKY基因及关键基因对病原菌的响应机制。WRKY基因及病程相关基因在刺葡萄和‘美人指’分别受到葡萄白腐病病原菌侵染诱导后,具有不同的时空表达差异和量化差异,WRKY基因和相关基因在刺葡萄中表达迅速且上调倍数高,但在‘美人指’中表达迟缓,且上调程度低。【结论】经过系统的鉴定评价筛选到一批抗性种质,可作为潜在育种材料。通过抗病基因表达分析检测,发现抗病基因在刺葡萄中反应迅速,从而使刺葡萄具备高抗病性。     

柑橘4个WRKY转录因子基因的克隆及其响应柑橘溃疡病菌侵染的表达分析

以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因Cs WRKY22、Cs WRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个Cs WRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。     

梨矮化砧木‘中矮1号’生长素氢转运体基因PcAHS及其启动子的克隆与表达分析

以梨（Pyrus communis L.）紧凑型矮化砧木‘中矮1号’及其母本‘锦香’新梢韧皮部为试材,根据转录组测序结果设计特异性引物,克隆到1个长1 239 bp的基因序列。该序列在两个品种间不存在差异,均编码412个氨基酸,其氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、梅（xp_008242099.1）、毛果杨（xp_002306421.2）、草莓（xp_00428771.1）的生长素氢转运体基因（AHS）编码的氨基酸序列的相似性在67% ~ 99%之间,命名为PcAHS。qRT-PCR分析发现,‘中矮1号’新梢韧皮部中PcAHS的表达量均低于母本‘锦香’,推测其启动子序列存在差异。‘中矮1号’及其母本‘锦香’PcAHS 基因上游启动子长度分别为828 bp和888 bp,二者相似性89.1%。序列分析发现‘中矮1号’PcAHS基因启动子有一段58 bp（–496 bp ~–553 bp）的缺失;利用植物顺式作用元件数据库PLACE和PLANTCARE分析表明,‘中矮1号’启动子含有一个‘锦香’没有的BPBF转录因子结合元件P-box。推测‘中矮1号’PcAHS基因启动子特有的片段缺失和P-box转录因子结合元件可能是导致其表达量低并通过影响生长素的运输最终引起矮化的原因。     

华东葡萄泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的抗白粉病特性分析

【目的】分析华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’的Ring型泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的转基因植株对葡萄白粉病的抗性,研究这2个基因的抗白粉病特性,为改良欧洲葡萄抗病性提供可用基因。【方法】利用同源克隆的方法获得中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的编码区序列(CDS);通过实时荧光定量PCR方法检测其在白粉菌诱导和水杨酸处理后的葡萄叶片中的表达;使用聚乙二醇(PEG)介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位;通过农杆菌介导法获得转基因‘无核白’和‘红地球’植株;经过苯胺蓝染色,利用血球计数板计数分析白粉菌在转基因植株叶片上的生长情况,鉴定转基因株系的抗病性。【结果】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3响应白粉菌和水杨酸处理,表达模式明显区别于感病对照‘赤霞珠’。中国野生华东葡萄‘白河-35-1’VpUIRP2蛋白定位在细胞质,VpUIRP3蛋白定位无特异性。通过农杆菌介导的遗传转化获得4个VpUIRP2的转基因‘红地球’株系和1个‘无核白’株系,转基因株系对白粉病表现出抗性。【结论】中国野生华东葡萄‘白河-35-1’泛素连接酶基因VpUIRP2能增强葡萄对白粉病的抗性,可以作为抗病基因用于改良欧洲葡萄的抗病性。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

山葡萄‘通化-3’抗寒相关基因SSH文库的构建及分析

【目的】克隆山葡萄抗寒相关基因和分析葡萄的抗寒机理。【方法】利用抑制性消减杂交技术(SSH),选用抗寒性强的山葡萄株系‘通化-3’和抗寒性弱的欧洲葡萄品种‘红地球’分别作Driver和Tester,建立了ASSH(山葡萄)与SSSH(‘红地球’)2个c DNA表达文库。【结果】差异表达克隆测序后经DNAMAN比对,从657个克隆中筛选出了70个Unigenes;通过BLAST比对分析,发现在ASSH文库中含有与山葡萄相关的r RNA基因内含子编码的归巢核酸内切酶、衰老相关蛋白质、细胞色素P450、抗冻蛋白、防御素样蛋白、热休克蛋白等相关的EST序列;SSSH文库中含有与‘红地球’相关的衰老蛋白。此外还发现了14个未知蛋白的ESTs序列。【结论】筛选出了与山葡萄抗寒性相关的AFPs、Haps、防御素样蛋白、细胞色素P450加单氧酶等多个相关的ESTs,以及14个未知蛋白序列,也可能参与山葡萄的抗寒代谢。     

A 3-Year Adaptation Study of Three Distinct Grapevine Cultivars under Midwestern Field Conditions

Simultaneous responses of American (Concord), European (Pinot Noir), and American-European hybrid (Traminette) cultivars to seasonal and diurnal variation in field environmental conditions were assessed to propose suitable cultivars for potential use for selection and breeding in grapevines in dry areas. ‘Pinot Noir’ had higher gas exchange parameters, higher water potential, and chlorophyll fluorescence, while ‘Concord’ had the lowest values in all three seasons and experienced moderate stress by the end of each season. The dry conditions in 2005 caused water potential to decline sharply compared to values recorded in 2004 and 2006. ‘Pinot Noir’ and ‘Traminette’ exhibited a mild stress, while ‘Concord’ exhibited a moderate stress in 2006. Photosynthetic rate decreased slightly during the summer with a slight recovery at the beginning of September, and did not differ across the seasons among cultivars. Stomatal conductance followed the same pattern. However, in both 2004 and 2005, stomatal conductance dropped sharply late in the season because of frequently occurring high temperatures that were greater than 32 °C. Maximum morning values of Fv/Fm were within the optimal range. The study suggests the presence of marginal photoinhibition during mid-summer in Concord cultivars, because no full recovery of photochemical efficiency early in the evening was observed. The European cultivar (Pinot Noir) and the American-European hybrid (Traminette) are more adapted to field conditions in Kansas than Concord cultivars. However, high cold-mortality of Pinot Noir due to high sensitivity to cold winter temperature makes the hybrid cultivars the most suitable cultivar for Midwest regions with relatively cold winters.     

Growth of Vitis vinifera L. and Vitis aestivalis Michx. as Affected by Temperature

Abstract

Four European (Vitis vinifera L.) winegrape cvs., ‘Semillon’, ‘Pinot Noir,’ ‘Chardonnay’, and ‘Cabernet Sauvignon’, and one American (Vitis aestivalis Michx.) winegrape cv. ‘Cynthiana’, were subjected to three temperature regimes in growth chambers set at 20/15°C, 30/ 25°C, or 40/35°C, for 16/8 hr day/night to determine the influence of temperatures on vine growth and development. In general, the best temperature for shoot and root growth 28 days after temperature treatments was 20/15°C for ‘Semillon’, ‘Cabernet Sauvignon’, and ‘Cynthiana’, and 30/25°C for ‘Pinot Noir’ and ‘Chardonnay’. Although 40/35°C reduced number of leaves, shoots, tendrils, and internodes, total leaf area (LA), and total shoot biomass of all the cultivars, the reduction was more pronounced in ‘Cynthiana’ than in the European cultivars. The average reduction in number of leaves at 40/35°C for the European cultivars was 47%, compared with 92% for ‘Cynthiana’. The two types of grapes adapted differently to high temperature. Shoot growth in the European cultivars continued under high temperature, whereas growth ceased in ‘Cynthiana’. Roots of ‘Cynthiana’, however, were less susceptible to the adverse effect of high temperatures than were the shoots. This study shows that the European cultivars were relatively more tolerant to high temperature than the American cultivar and they have a potential for production of wine in the climate of south central Kansas.     

四种复配芽孢菌剂对葡萄霜霉病的防治

以"霞多丽"葡萄叶片为试材,采用室内离体叶片接种法和田间喷雾法,探究了4种复配芽孢菌剂对葡萄霜霉病的防治作用,以期为葡萄霜霉病的生物防治提供参考依据。结果表明:4种复配芽孢菌剂均能有效防治葡萄霜霉病,在室内预防和治疗试验中,复配芽孢菌剂Ⅳ在浓度稀释50倍时的防效最好,分别为82.51%和83.16%;且与其它药剂相比复配芽孢菌剂Ⅳ的EC₅₀值最小,抑菌活性最高,分别为5.00×10⁷cfu·mL^-1和3.95×10⁷cfu·mL^-1。田间防效试验中,复配芽孢菌剂Ⅳ对葡萄霜霉病防效较好,持续时间长,药效比较稳定,连续施药4次后防效可达80.39%,可作为生产上防治葡萄霜霉病的生防药剂加以推广。     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

不同酿酒葡萄品种白藜芦醇合酶基因的克隆和序列分析

以红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”和白葡萄品种“雷司令”为试材,采用改良CTAB法提取葡萄叶片组织中的DNA,并扩增得到4个酿酒葡萄品种的白藜芦醇合酶基因部分片段.结果表明:红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”的扩增产物均为1 419 bp,白葡萄品种“雷司令”扩增产物为1 417 bp.通过序列多重比较分析,所得到的4个白藜芦醇基因片段与Genbank中河岸葡萄(AF128861)的该基因序列同源性较高(90％以上),外显子区同源性高于内含子;红色葡萄姊妹品种之间、红色葡萄不同品种之间、红色葡萄与白色葡萄品种之间的序列同源性依次递减.     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性，在生物信息分析的基础上，以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料，利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示，葡萄LIM基因家族有14个成员，可分为4个亚族，各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大，但亚族内差异较小；分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现，二者存在钝化选择关系；多序列比对发现，该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域；保守基序分析结果表明，所有基因均包含motif2；基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子；14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明，高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现，VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调，且随处理时间的延长表达量显著增加。     

半矮蔓西葫芦新品种东葫2号的选育

东葫2号是以冬玉经7代自交纯合选育出的02-8A白皮自交系为母本，以国外材料经5代自交分离选出的稳定的绿皮自交系，与国内黑龙江小 白皮杂交，再自交纯合得到的早熟自交系9601-4B为父本，配制而成的早熟丰产半矮蔓西葫芦一代杂种。该品种植株生长势强，早熟性好，植株后期 不早衰；瓜长筒形，纵径 23～25 cm，横径6～7 cm，瓜皮翠绿色，光泽度好；田间表现对病毒病、霜霉病和白粉病的抗性比对照早青一代强。露地 栽培每667 m²产量4 500～5 000 kg，保护地栽培每667 m²产量6 000 kg左右。适于我国北方露地和日光温室栽培。     

露地黄瓜新品种津绿4号

在引进国内外品种资源的基础上，筛选出优良的自交系Ｆ１５和Ｑ２４，育成了丰产、抗病、品质优良的露地黄瓜新一代杂种津绿４号。其植株长势强，叶深绿色，以主蔓结瓜为主，第一雌花着生在第４节左右，雌花节率３５％左右。瓜条长棒形，长３５ｃｍ左右，单瓜重约２００ｇ。瓜把短，瓜皮深绿色，瘤显著，密生白刺，果肉绿白色、质脆，品质优，商品性好。早熟，从播种到采收约６０天，采收期６０～７０天。每６６７ｍ２产量５５００ｋｇ左右。耐热性强，对枯萎病、霜霉病、白粉病的抗性强，适于春秋露地栽培。     

夏秋黄瓜新品种湘黄瓜4号的选育

湘黄瓜4号系从200余份黄瓜品种资源中筛选出的优良自交系L88-9和T5-8杂交配制而成的一代杂种。植株生长势强，以主蔓结瓜为主，果实长棒形，长约31cm，瓜把长约3.6cm，平均单果质量297g，果皮深绿色、刺瘤较多，突起较明显，瓜把无苦味，肉质脆，风味佳，商品性好，从播种至采收45～50d(天)，平均每667m2产量2405kg，比津研7号增产39%，田间表现抗病毒病、霜霉病和枯萎病。     

葡萄活性赤霉素合成关键基因VvGA3ox家族的克隆和表达分析

在植物赤霉素合成代谢中,GA3ox可将几种非活性赤霉素转化为具生理活性的赤霉素。以葡萄有核品种‘黑比诺’和无核品种‘无核白’为材料,克隆葡萄的VvGA3ox基因家族成员,分析基因结构、进行染色体定位和系统发育树构建,检测其组织器官表达特性和在胚珠（幼种子）发育过程的表达变化。结果表明,葡萄基因组VvGA3ox家族有3个成员,cDNA长度分别为1 313、1 225和1 480 bp,都包含2个外显子和1个内含子结构。组织器官特异性表达分析表明,VvGA3ox1在胚珠中的表达很低,在根中高表达;VvGA3ox2和VvGA3ox3在花和胚珠中的表达较高。在受精后胚珠（幼种子）发育过程中,VvGA3ox家族基因的表达趋势存在差异,其中VvGA3ox1在‘黑比诺’与‘无核白’中均是在盛花后30 d时上调之后下降;VvGA3ox2在‘黑比诺’中20 ~ 30 d极速上调之后下降,相应地‘无核白’中是先缓慢下降之后上升;VvGA3ox3在‘黑比诺’中逐渐下降,对应地‘无核白’中是在10 ~ 15 d先上升后在20 ~ 45 d呈下降趋势并逐渐与‘黑比诺’中的表达持平。VvGA3ox在有核和无核葡萄品种中表现较大差异表达,与葡萄无核性状有一定关系。