枸橼种质对柑橘溃疡病的抗性鉴定

柑橘溃疡病(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)是严重阻碍柑橘产业发展的世界性检疫病害,防控困难,选育抗病品种为防治溃疡病的唯一有效办法。枸橼C-05是柑橘属独特的抗溃疡病种质,为抗性机理和抗病育种提供了种质基础。为了进一步评价枸橼C-05的抗性,另外收集了13份枸橼种质,对其进行溃疡病的离体和活体抗性评价。叶片形态学观察表明,14份枸橼种质存在较大的形态学差异。采用离体与活体注射接种不同浓度的柑橘溃疡病菌,根据叶片的感病症状、病斑周围黄色晕圈大小等典型溃疡病症状,综合评价枸橼类种质的抗病性。结果表明:枸橼种质之间对溃疡病的抗性存在极大差异,溃疡病的抗性评价综合病情指数显示枸橼C-05、园香橼、矮果香橼、美国枸橼、普通枸橼和印度大果综合病情指数较小,表现为极抗病或抗病,其他枸橼种质表现不同程度的感病性;枸橼种质的抗病或感病性与其叶片形态特征无关。枸橼C-05和5个抗病枸橼种质对柑橘溃疡病具有针对性的抗性,这对进一步研究抗病机理和抗病育种具有重要意义。     

甜橙SWEET2a促进柑橘溃疡病菌侵染

柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染感病种质冰糖橙叶片后，在侵染部位形成典型的火山口凸起症状，但在抗病种质枸橼C-05叶片侵染部位呈现逐渐褐色坏死，未形成溃疡病典型症状。基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果，分析鉴定的20个甜橙SWEET受Xcc诱导表达变化，结果显示SWEET2a和SWEET17d在冰糖橙中受Xcc诱导上调表达，SWEET12b在枸橼C-05中受Xcc诱导上调表达；实时荧光定量PCR验证，SWEET2a在冰糖橙叶片中受Xcc诱导高表达而在枸橼C-05叶片中表达变化不显著；SWEET2a在不同柑橘种质同源基因编码的氨基酸序列相似性为94.6%，其启动子顺式作用元件在冰糖橙和枸橼C-05中的种类和数量存在较大差异。冰糖橙和枸橼C-05叶片瞬时过表达结果显示，SWEET2a促进Xcc的繁殖，且拟南芥过表达转基因株系接种毒性菌Pst.DC3000(Pseudomonas syringae tomato DC3000)后，单位叶面积菌含量显著高于野生型。SWEET2a蛋白部分定位于质膜，表明SWEET2a...     

柑橘溃疡病抗性相关的SSR标记筛选

以抗柑橘溃疡病的‘宜昌橙2586’与易感病的‘岭南沙田柚’进行杂交,随机选取F₁ 代材料80 株,开展溃疡病抗性田间接种鉴定。鉴定结果表明,溃疡病抗性在F1 代分离明显,若将免疫和高抗类型均视为抗病,中抗、中感和感病类型均视为感病,则抗感的分离比例接近1︰1。采用集合分离分析法BSA (Bulked Segregant Analysis),结合SSR 分子标记技术,筛选到1 个与柑橘溃疡病抗性相关的分子标记CCR-110。利用F₁ 代分离个体和公认的抗感材料对标记进行验证分析,发现该标记表现较好的抗性相关性。F₁ 群体相关分析表明,该标记与柑橘溃疡病抗性的相关系数为0.79;采用最大似然法计算重组率为9.38%±3.5%,通过 Kosambi 函数将其转换成图距单位（cM）,遗传距离为9.11 cM;感病的甜橙类、柚类、枳类没有此标记,抗病的金柑类、宜昌橙类、香橙类、宽皮柑橘类的多数材料出现此标记。     

柑橘HSP20家族基因鉴定及其响应溃疡病菌侵染表达分析

为探究HSP20在柑橘（Citrus L.）响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染过程中发挥的作用，鉴定CsHSP20家族基因。生物学信息分析显示共有42个，分为11个亚族，分布在9条染色体上，编码135～373个氨基酸，蛋白分子量15.17～41.71 kD，等电点4.53～10.07,92.9%的基因没有或只有1个内含子，各亚族基因间有高度相似的结构和保守基序，每个基因的启动子都具有与激素或胁迫相关的顺式作用元件。其次，对感病的冰糖橙和抗病的枸橼C-05进行接种Xcc和40℃热胁迫处理，qRT-PCR结果显示CsHSP20家族中的HSP17.9、HSP23.3、HSP18.5和HSP18.0均上调表达，但抗感材料之间差异明显，HSP23.3在枸橼C-05中受Xcc上调表达水平极显著，该结果与受Xcc侵染的转录组结果一致。在冰糖橙叶片瞬时超表达候选基因，Xcc定量分析结果显示枸橼C-05的HSP23.3抑制Xcc繁殖速度更明显。     

甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4 的分子标记

 以甜瓜（Cucumis melo L.）抗蔓枯病自交系PI482398（含抗蔓枯病基因Gsb-4）和感病自交系‘白皮脆’以及它们的F₁、BC₁P₁、BC₁P₂、F₂ 群体为材料,苗期进行蔓枯病菌（Didymella bryoniae）接种鉴定,结果表明甜瓜抗蔓枯病基因Gsb-4 为单显性遗传。利用集团分离分析法（bulked segregant analysis,BSA）对89 对SSR 引物进行筛选,引物CMTA170a 在抗性材料中可扩增出约为120 bp 的条带,并与抗性基因Gsb-4 表现出连锁关系。统计了CMTA170a 在118 个F₂ 单株上的多态性,并利用MAPMAKER/Exp version 3.0b 软件进行了计算,其与Gsb-4 的遗传连锁距离为5.14 cM。     

与番茄颈腐根腐病紧密连锁的SCAR标记开发

利用与番茄颈腐根腐病抗性基因Frl紧密连锁的CAPS标记C2-25,开发设计了新的SCAR标记,用于快速检测Frl抗性材料。使用C2-25引物,在25份已知表型的番茄材料中进行PCR,产物单克隆测序后发现,19份纯合抗病材料存在1条完全相同的抗病序列;4份纯合感病材料存在1条完全相同的感病序列;2份杂合抗病材料均存在前述的抗病序列和感病序列。根据抗病、感病序列SNP差异设计引物,最终筛选得到可扩增出370 bp抗病特异片段和520 bp感病特异片段的番茄颈腐根腐病连锁标记R-6F/2R、S-3F/4R。在500株F_2材料中进行验证,检测到122株纯合抗病单株、257株杂合抗病单株和121株纯合感病单株。F_2材料人工接种鉴定结果显示,473株单株抗性与分子鉴定结果一致,分子标记辅助鉴定的准确率达到94.6%。开发的SCAR标记准确度高、成本低、操作简便,可用于Frl基因的分子标记辅助育种。     

马铃薯高世代选系疮痂病抗性评价及SSR辅助筛选

利用国外种质资源创造的20 份高世代马铃薯无性系为试材，以尤金为感病对照，克新18 号为抗病对照，采用自然 病圃和人工接种的鉴定方式进行疮痂病抗性评价，利用SSR 分子标记分析试材之间的亲缘关系，并对比SSR 遗传相似性系 数聚类结果和试材抗病性分类结果，探究利用SSR 分子标记辅助筛选疮痂病抗病资源的可行性。从试验地土壤和感病块茎 共分离纯化具有链霉菌特征的菌株278 份，其中240 份来自于块茎，38 份来自于土壤。具有致病力的菌株127 株，经鉴定 全部属于Streptomyces scabies 菌种。试材间的抗病性存在明显差异，可分为高抗、中抗、中感和高感4 个类型。人工接种与 自然病圃抗性鉴定结果存在极显著相关（R²=0.946 7）。抗病类型与感病类型通过SSR 遗传相似性系数聚类大致可以区分。     

黄瓜褐斑病抗源鉴定与抗性遗传分析

通过苗期人工接种抗病性鉴定方法,对34份黄瓜种质资源进行了褐斑病抗性鉴定,从中筛选出5份高度抗褐斑病资源、2份抗病资源、3份中抗资源,其余均为感病和高度感病资源。鉴定结果说明现有黄瓜种质资源中蕴涵着潜在的改良黄瓜褐斑病抗性基因。通过对高抗/高感亲本杂交F1、F2代及回交世代的抗病性分离观察表明,符合孟德尔的1∶2∶1和1∶1的分离规律,认为抗病性由1对单隐性基因控制,感病相对于抗病为不完全显性。研究结果对黄瓜抗褐斑病育种具有重要的应用价值。     

茄子株高性状鉴定与遗传分析

以长茄高代自交系125 和126 构建的茄子6 个不同世代的遗传群体〔P₁、P₂、F₁、F₂、 B₁（125×F₁）、B₂（126×F₁）〕 为试材，利用主基因+ 多基因混合数量性状遗传模型对茄子的株高性状进行多世代遗传联合分析。结果表明：供试亲本株高 性状差异显著，分离世代株高性状数值均呈单峰的偏正态分布，属于数量性状遗传。多世代遗传联合分析结果显示茄子株高 性状的最适遗传模型为C-0 模型，不存在主基因遗传效应，表现为多基因控制的加性- 显性- 上位性遗传模式。采用二阶 遗传参数进一步分析株高的多基因遗传效应，结果显示，茄子分离世代F₂、B₂ 的多基因遗传率分别为49.24%、22.77%，茄 子株高以多基因遗传为主。     

不同抗性甜瓜接种蔓枯病菌后若干生理指标的变化

对不同抗性甜瓜接种蔓枯病菌后测定叶片中叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和3种防御酶（PPO、PO、PAL）的活性。结果表明：叶绿素含量在接种后呈现先增加后减小趋势,抗病甜瓜增幅大,叶绿素含量高于感病甜瓜;可溶性糖含量在接种后先降低后升高、再降低再升高,抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜;可溶性蛋白含量在接种后逐渐升高,感病甜瓜峰值出现早于抗病甜瓜;3种酶活性在接种后都有不同程度提高,其中抗病甜瓜酶活性增幅高于感病甜瓜。几种酶活性变化可以用于甜瓜蔓枯病抗性鉴定。     

3个柑橘品种叶片结构和生化物质与柑橘溃疡病抗性的相关性研究

以'滑皮'釐柑、'建阳橘柚'和'沃柑'3个柑橘品种为试材,观察其叶片结构,测定叶片生化物质含量,幵分析其与柑橘溃疡病抗性的相关性。结果表明:'滑皮'釐柑对柑橘溃疡病免疫,'建阳橘柚'对柑橘溃疡病有较高的抗性,'沃柑'表现为高感。3个柑橘品种的叶片气孔密度与柑橘溃疡病抗性呈极显著负相关,气孔面积与柑橘溃疡病抗性呈显著负相关,叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、蜡质含量等挃标与柑橘溃疡病抗性均呈极显著正相关。3个柑橘品种健康叶片中可溶性蛋白含量差异不显著;丙二醛(MDA)含量'滑皮'釐柑'建阳橘柚'沃柑',差异达显著水平;过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)活性大小均为'滑皮'釐柑'建阳橘柚'沃柑',差异均达显著水平。3个柑橘品种接种溃疡病菌后,叶片中的可溶性蛋白含量与柑橘溃疡病的抗性强弱无显著相关,MDA含量与柑橘溃疡病抗性呈显著负相关,POD、SOD活性与柑橘溃疡病抗性呈极显著正相关,PPO活性与柑橘溃疡病抗性呈显著正相关。     

大蒜白腐病抗性鉴定方法研究

 以汉中红皮蒜（抗病）和改良蒜（感病）为鉴别品种,对大蒜抗白腐病鉴定中的接种叶龄、接种部位、接种后培养温度及调查时期等进行研究。结果表明,苗期白腐病菌通过伤口和自然孔口均可浸染大蒜植株,而花芽鳞芽分化期通过伤口侵入。抗病性鉴定最适接种叶龄为6叶期,离体接种法较活体接种法更简便快捷。离体接种鉴定时叶面接种和叶背接种鉴定结果无显著性差异;接种后最适培养温度为18 ℃,最适调查时期为接种后7 ~ 8 d。以G005（抗病）、G023（感病）和G025（感病）大蒜为验证品种,离体接种鉴定结果显示,建立的大蒜白腐病抗病性鉴定方法可行,能反映品种的真实抗性。     

不同猕猴桃品种对溃疡病菌的抗性评价及其利用

【目的】通过评价当前国内主要猕猴桃品种对溃疡病的抗性表现,为猕猴桃抗病品种的利用提供理论依据。【方法】采用枝条离体划伤接种,分别以红阳和海沃德猕猴桃作为抗感参照品种,对12个猕猴桃品种进行室内抗性鉴定;采用自然诱发接种法对23个猕猴桃品种进行田间抗性鉴定;定点监测不同品种在产业化园区中的抗病性表现。并在此基础上,利用筛选出的抗性品种,在重病园区进行改种,探索利用抗病品种防控猕猴桃溃疡病的实际效果。【结果】不同品种抗病性差异显著,室内抗性鉴定12个供试品种,其中抗病2个、中抗4个、中感6个;田间抗性鉴定23个供试品种,其中高抗3个、抗病2个、中抗6个、中感5个、感病4个、高感3个;规模化生产中红阳、Hort16A和金艳等中华猕猴桃品种表现出高度感病,海沃德、翠玉和魁绿品种表现出较高抗性;将红阳与Hort16A高感品种改换为翠香、翠玉、徐香、海沃德等抗病品种后,植株发病率与病情指数显著降低,相对防效超过85%。【结论】供试品种总体抗性趋势由高到低是软枣、毛花猕猴桃品种美味猕猴桃品种中华猕猴桃品种,研究结果表明筛选和利用抗病品种是解决猕猴桃溃疡病危害的有效途径。     

抗番茄黄化曲叶病毒病基因ty-5的功能标记开发与利用

番茄黄化曲叶病毒病是番茄重要病害之一。在ty-5基因编码序列分析的基础上,设计ty-5基因的功能标记,对番茄黄化曲叶病毒病抗病自交系t33-14、感病自交系t2301、t33-14 × t2301的F₂株系和不同来源的26份番茄材料进行基因型鉴定,并进行表型相关性分析。结果表明,功能标记TySNP能准确地区分育种亲本以及杂交后代群体的番茄黄化曲叶病毒病抗病材料纯合基因型、感病材料纯合基因型以及感病杂合基因型,且不同的基因型跟表型能较好对应吻合,可对杂交后代进行有效选择。因此,功能标记TySNP可用于番茄分子标记辅助育种,可为定向改良番茄品种对黄化曲叶病毒病的抗性提供分子辅助育种手段。     

杧果种质对细菌性黑斑病的抗性评价

本研究采用离体叶片接种法对64份杧果种质进行细菌性黑斑病抗性鉴定。结果表明,64份种质材料有2份抗病,9份中抗,53份感病,未发现高抗或免疫种质。     

番茄试管苗抗TYLCV 鉴定技术研究

 为了开发番茄对番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）抗病性鉴定的新技术,设计了在番茄试管苗中接种TYLCV的试验。将对TYLCV感病的品种‘Moneymaker’、‘中蔬6号’、‘丽春’和抗病品系‘AVRDC CLN 2123 A’在试管中进行组织培养,21 ~ 25 d后切取长2.0 ~ 2.5 cm的嫩枝,将嫩枝基部在含TYLCV-[CN：SH2]侵染性克隆质粒的农杆菌EHA 105菌株的悬浮液（OD₆₀₀ 0.5）中浸润1 min接种。14 d后,感病品种试管苗开始出现TYLCV症状并且愈来愈重,28 d后TYLCV症状十分典型,56d后症状极其严重：叶片窄小、黄化、极度卷曲,植株严重矮化,停止生长或死亡;而同样接种的抗病品系试管苗却无一发病。接种的番茄试管苗经PCR检测显示,从感病品种试管苗中均能扩增到356 bp的特异片段,而在抗病品系中无此条带。这些结果显示了在试管里鉴定番茄品种或材料对TYLCV抗性的可能性。     

密本南瓜白粉病抗性遗传规律分析

于2012年10月在广西农业科学院蔬菜研究所中试基地,以经田间自然发病和苗期接种鉴定而来的抗病自交系“806”和感病自交系“810”为材料,配组杂交和F1代自交,获得正反交F1和F2种子,然后采用苗期接种鉴定法同时调查亲本、正反交F1、F2的发病情况,最后利用x2适合性检验分析抗性遗传规律,以选育抗白粉病密本南瓜新品种,解决生产中南瓜白粉病危害问题.结果表明:正反交F1代的病情指数均接近感病亲本“810”,而明显高于抗病亲本“806”；正反交F2代的抗感比例分别为1∶2.73和1∶2.72,x2检验均达显著水平,据此推定密本南瓜白粉病抗性符合单基因控制的隐性遗传规律.     

大蒜紫斑病抗性鉴定方法的研究

 以G087 (抗病) 、G064 (中抗) 、G073 (感病) 大蒜为鉴别品种, 对大蒜紫斑病的侵染途径, 抗性鉴定的接种叶龄、接种浓度、接种部位, 接种后培养温度及调查时期等进行了研究。结果表明,苗期紫斑病菌通过伤口和自然孔口均可浸染大蒜植株, 而花芽鳞芽分化期只可通过伤口侵入。抗病性鉴定最适接种叶龄为5叶期; 最适接种浓度为1 ×106个·mL - 1 ; 离体接种法较活体接种法更简便快捷。离体接种鉴定时, 叶面接种和叶背接种鉴定结果无显著性差异; 接种后最适培养温度为21 ℃; 最适调查时期为接种后第6天。以G057 (抗病) 、G103 (中抗) 、G083 (感病) 大蒜为验证品种, 离体接种鉴定结果显示,建立的大蒜紫斑病抗病性鉴定方法可行, 能如实反映品种的真实抗性。     

四倍体西瓜抗枯萎病生理小种1分子标记辅助选择技术研究

基于已获得的二倍体西瓜与抗枯萎病基因Fon-1紧密连锁的分子标记,进一步完成了Fon-1基因的精细定位。利用两个四倍体西瓜材料（易感病的NF3为受体,抗病的JH为供体）,构建以NF3为轮回亲本的回交群体,使用新开发出的SNP标记对各世代群体进行分子标记辅助选择,及苗期抗病性接种鉴定。结果发现,在分离世代群体中通过接种鉴定获得抗病株比例较分子标记检测值低12.64% ~ 15.34%,这可能是由于基因剂量效应造成的。抗病基因杂合位点对枯萎病抗性依次为：三显体（AAAa）> 二显体（AAaa）> 单显体（Aaaa）。目前分子标记尚无法检测杂合基因型的剂量效应,容易将感病的单显体（Aaaa）误判为抗病株。在构建的673株BC1F2代自交群体中检测到29株纯合基因型（AAAA）抗病单株,占总检测株数的4.31%,与苗期抗病性接种鉴定结果符合度达到100%。     

番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的双重SNP标记的开发

本试验旨在开发一种新的设计共显性SNP标记的方法,以提高SNP标记检验的效率,并将其成功应用于番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的SNP标记开发中,提高了种质资源鉴定和育种分离世代材料筛选的效率。通过对抗病基因Ty-1和等位感病基因ty-1的cDNA序列进行比对,挑选了两个稳定扩增的多元非同义突变位点,分别用来设计Ty-1和ty-1的SNP标记NL3和NL2,将两个标记进行混合得到双重SNP标记NL2-3。通过用NL2-3检验已知的抗病和感病番茄材料,验证了其多态性和稳定性。并用NL2-3对抗感病材料的F₃代杂交分离群体和普通自交系进行了Ty-1的筛选,并经过田间观察进一步验证了该标记的可靠性。此方法开发得到的双重SNP标记只需要进行一次PCR反应和一次凝胶电泳就可以区分纯合抗、杂合抗、纯合感3种基因型,提高了育种选择的效率。