叶籽银杏DNA甲基化水平与模式变异的研究

以萌动期与展叶期的叶籽银杏和银杏为试材,采用基于DNA甲基化敏感扩增多态性分析（Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP）方法,在全基因组水平上探究叶籽银杏、银杏不同发育期DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征。萌动期选用22对引物,在叶籽银杏和银杏中检测到扩增位点为498和384个,甲基化位点为237和165个,其总甲基化率分别为47.6%和42.4%;展叶期选用40对引物,在叶籽银杏有叶生胚珠（YZ2）、无叶生胚珠（YC）及银杏（CK）叶片中检测到扩增位点767、600及367个,甲基化位点分别为370、244及152个,其总甲基化率分别为48.3%、40.5%及41.5%。进一步对不同发育期叶籽银杏、银杏DNA甲基化模式的变化特征进行分析,结果显示：萌动期、展叶期叶籽银杏与银杏相比均有超过半数的位点（52.1%、54.6%及64.2%）DNA甲基化模式发生多态性变化,萌动期叶籽银杏相对于银杏其变化趋势以超甲基化为主;展叶期叶籽银杏有叶生胚珠相对于叶籽银杏无叶生胚珠及银杏甲基化的变化趋势以超甲基化为主,叶籽银杏有叶生胚珠相对于银杏DNA甲基化模式变异幅度更大,超甲基化水平更高,显示出叶籽银杏基因组独特的DNA甲基化特征。     

银杏基因组DNA甲基化修饰位点的MSAP分析

 利用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于银杏基因组的甲基化敏感扩增多态性（methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP）分析体系,在全基因组水平检测银杏DNA甲基化修饰水平、模式及位点等表观遗传信息。结果显示,从54对MSAP选扩引物中,选出16对MSAP引物组合,共扩增产生454条清晰可辨且可重复的DNA条带,平均每对引物扩增获得28.38条带。在全部扩增位点中,检测到甲基化位点200个,CCGG/GGCC位点甲基化修饰比例为44%。部分银杏基因组甲基化修饰位点进行回收,最终分离了18条存在甲基化修饰的基因组DNA序列。BLASTn比对分析表明,银杏基因组中包括转录调控因子、反转录转座子、通道蛋白、启动子结合蛋白、蛋白激酶等在内的多种类型的DNA序列中均存在DNA甲基化修饰现象。     

光照诱导广叶绣球菌基因组甲基化分析

利用荧光标记甲基化敏感扩增多态性技术(fluorescence-labeled methylation-sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)比较广叶绣球菌(Sparassis latifolia)菌丝在光、暗条件下基因组胞嘧啶甲基化的变化。F-MSAP分析显示,15对选择性扩增引物共扩增出6383个CCGG位点,平均每个处理每对引物扩增47个条带,其中2849条片段发生甲基化。黑暗组、光照24h和光照48h处理组总甲基化水平分别是49.54%、41.71%和42.88%,黑暗组和光照处理组的总甲基化水平差异显著(P0.01),而光照组间甲基化水平差异不显著(P=0.10)。与黑暗组相比,光照诱导全甲基化率升高,半甲基化率降低,差异显著(P0.01)。总的趋势是光照引起广叶绣球菌菌丝DNA去甲基化。     

菊花组织培养继代过程中的DNA甲基化变化

采用MSAP（甲基敏感扩增多态性）方法对菊花（Dendranthema ×grandiflorum）组织培养继代过程中的DNA甲基化情况进行了分析。结果发现,3个单芽系的组培苗较田间材料均有DNA甲基化增加和减少现象,采用7对引物,共扩增出929条带,各单芽系DNA甲基化变异率分别为8.929%、8.902%和8.986%。继代材料较母体均有甲基化变异发生,且变异类型中DNA甲基化减少的比例高于甲基化增加的比例,随着继代次数的增加,两种变异间的差异逐渐减小,比例相近。同时在同一单芽系内的不同次继代个体间有DNA甲基化变化现象,对5次继代的180个个体研究发现,带型变化中18.38%的带型不一致,2.99%为一个或两个个体发生了变化,仅有1.72%在发生变化后趋于稳定,另外10.68%的带型呈现不稳定的随机变化。     

科技文摘

<正>铅胁迫下萝卜基因组DNA甲基化分析利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术,分析不同浓度铅(Pb)处理下萝卜基因组DNA甲基化水平的变化,探讨DNA甲基化在植株对Pb胁迫反应中的作用。结果表明,经100、400和800 mg·L~(-1)Pb(NO_3)_2处理后,MSAP比率分别为12.7%、14.2%和17.0%,均高于对照;全甲基化率分别为9.7%、10.2%和12.8%,而其对照为9.5%,表明重金属铅胁迫后,某些位点发生了重新甲基化。萝卜肉质根中总甲基化水平随Pb处理浓度上升而提高。甲基化变     

番木瓜成熟过程中全基因组DNA甲基化和转录组变化分析

采用全基因组DNA甲基化(WGBS)和转录组测序(RNA-seq)技术对番木瓜4个成熟时期(绿熟期、破色期、熟化期、腐熟期)的果实样品进行高通量测序.C位点、CG、CHG和CHH序列平均甲基化水平分别为17.15％、49.33％、34.30％和8.28％.全基因组DNA甲基化水平在果实成熟过程中持续下降,同时差异表达基...     

小白菜小孢子培养再生植株的倍性与基因组DNA甲基化的关系

对小白菜品种进行游离小孢子培养，得到9株再生植株，其中2株为单倍体，7株为二倍体，二倍体自然加倍率为77.7 %。为 避免材料间差异，取单倍体和二倍体再生植株各2株，提取单株DNA，分别构建单倍体和二倍体DNA混合池。利用甲基化敏感性限制性 内切酶-PCR法，结合SRAP分子标记技术，对2个DNA混合池进行筛选，共筛选768对引物，只有在未酶切的单倍体和二倍体DNA池中SRAP 引物扩增无差异，而酶切后有差异的条带，才认为是单倍体和二倍体甲基化差异。试验共获得8对含有多态性的引物，试验结果证明 小白菜小孢子培养获得的再生植株的倍性与基因组DNA甲基化有关。     

果实成熟过程中的DNA甲基化调控研究进展

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰,对植物果实的成熟具有重要的作用,本文中综述了果实成熟过程中DNA甲基化水平的变化及其调控机制。基于已有研究发现,大部分果实在成熟过程存在总体DNA甲基化水平降低的情况,也有部分果实的总体DNA甲基化水平随果实成熟呈现升高趋势。此外,在果实成熟过程中特定基因尤其是与成熟相关的基因在去甲基化酶作用下发生去甲基化进而影响果实成熟。引起果实成熟过程中DNA甲基化水平变化的机制总体而言是受到甲基化酶、去甲基化酶以及植物特有的RdDM途径的综合调控。本文为深入解析果实发育与成熟的分子机制提供理论参考,并对以后的研究提出可行的建议。     

红富士苹果芽变系DNA甲基化研究

以35份富士苹果(Malus×domestica Borkh.‘Fuji’)芽变材料为试材,利用甲基化敏感扩增多态性(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)分析和UPGMA聚类方法,对其基因组甲基化修饰水平、变异模式以及表观遗传变异关系进行研究。结果表明:(1)不同富士系得到不同的MSAP扩增,总DNA甲基化水平27.90%～36.16%,平均32.87%,双链全甲基化为主要甲基化方式;(2)富士芽变材料绝大多数位点保持了原有甲基化模式;(3)绝大多数芽变(68.57%)检测到全部的甲基化变异模式(12种),去甲基化频率极显著高于甲基化频率(P 0.01),且CG去甲基化极显著高于CHG;(4)36份种质遗传相似系数平均值0.89(0.79～0.92),在聚类图上,富士原种分布在芽变系集中区外,新近发生的芽变系更倾向于聚在一起,着色系片红型和条红型芽变呈分散排布状态。总的来看,富士芽变的甲基化变异模式丰富,超甲基化和去甲基化相伴发生,但以去甲基化为主;‘富士’着色芽变与其最原始品种富士,以及芽变之间发生了较大表观遗传变异;片红和条红型芽变聚类未表现明显偏好性。本研究将为进一步开展富士着色系芽变机理研究提供指导,可以CG去甲基化为切入点展开深入研究。     

虎奶菇菌丝体和菌核基因组甲基化分析

以虎奶菇[Pleurotus tuber-regium (Fr.) Singer]菌丝体和菌核为材料,利用MSAP技术分析其甲基化水平,并对甲基化差异片段进行回收测序,探究虎奶菇生长与DNA全基因组甲基化的关系.结果 表明,菌丝体和菌核的DNA甲基化率分别为7.94％和9.54％,其中半甲基化率分别为4.50％和4.0...     

低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析

为了揭示西瓜二倍体及三倍体在低温胁迫下的耐冷性分子机制,以西瓜二倍体自交系‘83166’（‘京欣1号’品种的母本）及其同源三倍体为材料,利用MSAP及cDNA-AFLP技术研究低温处理前后基因表达的差异,并对差异带进行克隆、测序和比对。28对MSAP引物扩增得到2 356个位点,其中二倍体经低温处理后总甲基化率下降8.5%,三倍体下降10.4%。将13条差异带与西瓜基因组数据库比对,有7条带确定是西瓜基因组序列。26对cDNA-AFLP引物组合扩增出1 267条带,其中二倍体上调表达占48.2%,下调表达占51.8%;三倍体上调表达占51.3%,下调表达占48.7%。21条差异带在NCBI中找到了同源序列基因,包括假定蛋白（38.1%）、能量与代谢（38.1%）、信号转导（9.5%）、物质运输（9.5%）以及DNA修饰（4.8%）,另有9条无同源序列。低温胁迫后,三倍体去甲基化率与上调表达量均大于二倍体,而且三倍体诱导出更多的差异基因参与了能量代谢调控、信号转导、物质运输等过程,说明在抵御低温胁迫中三倍体比二倍体有更强的耐冷性。     

菜薹转录组中SSR信息与可用性分析

利用菜薹转录组分析检测到48 975条unigene（38.17 Mb）序列数据,运用MIcroSAtellite（MISA）工具发现其中具有1 ~ 6个核苷酸重复类型的SSR位点11 879个,SSR位点发生频率为1/3.2 kb（312.5/Mb）。6种SSR位点类型中主要为1 ~ 3个核苷酸重复,占总SSR位点数的99.01%,其中单、二和三核苷酸类型分别为41.11%、28.23%和29.67%。发现重复序列的基序58个,重复次数在5 ~ 23之间,其中出现频率高的基序主要有A/T、AG/CT、AT/AT、AC/GT、AAG/CTT和AGG/CCT。重复序列长度在10 ~ 60 bp之间,大多小于20 bp,大于20 bp的仅有7.9%（938个SSR位点）。设计出676对具有潜在多态性的SSR引物组合,从中随机抽取30对引物进行PCR扩增验证其可用性,发现22对引物在4份菜薹种质中的扩增产物条带清晰稳定,其中12对引物具有多态性。     

干旱胁迫下柑橘叶片基因表达谱的cDNA-AFLP 分析

 为分离和鉴定柑橘干旱胁迫应答基因,应用cDNA-AFLP分析技术,以盆栽‘天草’橘橙枳砧嫁接苗为试材,对正常灌水和不同干旱胁迫处理下叶片的基因表达谱进行分析。利用81对引物组合进行扩增,共筛选获得113条差异表达转录衍生片段（TDF）,其中上调表达71条（63%）,下调表达29条（26%）,其余13条（11%）为瞬时表达。选取70个差异表达TDF进行克隆测序,共得到62个有效序列,BLAST结果表明：33个TDF与已知功能基因具较高同源性,功能涉及信号转导、能量代谢、离子通道和蛋白合成等,18个TDF与功能未知基因或假定基因同源性较高,其余11个TDF无同源序列,可能为新的未知功能基因。     

西藏光核桃SRAP-PCR反应体系的优化和引物筛选

以西藏12份光核桃种质为试材,采用正交设计,从dNTPs、Mg²⁺、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶5种因素5个水平来优化SRAP-PCR反应体系,并对引物进行了筛选。结果表明:光核桃25μL的SRAP反应体系的最佳组分包括2.5μL 10×buffer,0.35 mmol/L dNTPs,1.5 mmol/L Mg²⁺,0.4μmol/L引物,20 ng模板DNA和2.5 U Taq DNA聚合酶。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以dNTPs浓度影响最大,模板DNA的影响最小。应用该体系从40个引物组合中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物组合23个。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为利用SRAP标记技术进行光核桃遗传多样性研究提供了依据。     

大白菜品种鉴定的SSR核心引物筛选及其应用

为筛选出一套大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）的核心引物,以54份大白菜骨干自交系为材料,从已发表的2 129对白菜SSR引物中,初步筛选出分布于白菜整个基因组、具有唯一扩增位点、扩增稳定性及重复性好的多态性SSR引物51对。进一步根据引物的多态性信息量（PIC）、等位基因数量、位点的物理位置和主成分分析（PCA）等分析结果,确定了一套包含28对SSR引物的核心引物组合。比较核心引物组合、51对多态性SSR引物和123个标记（72个SNP标记与51对多态性SSR引物）对54份大白菜骨干自交系的聚类分析结果,三者具有较高的一致性;该套引物可将262份大白菜高代自交系区分开,具有较好的鉴别能力。利用这套核心引物构建了242份大白菜品种的指纹图谱。该研究获得的28对SSR引物可以用于大白菜的遗传多样性分析和品种核酸指纹库构建等研究,可为大白菜新品种的特异性、一致性、稳定性检测体系的建立和新品种保护提供技术支持。     

云南番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

在云南省元谋县发现大量下部叶片褪绿黄化,顶叶卷曲畸形的番茄植株。将叶片采集带回实验室,采用番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的特异性引物分别扩增得到774和400 bp的目标条带,测序比对发现其与ToCV的KR184676.1和TYLCV的FJ012359.1序列相似度均为99%,确认这两条带对应的两种病毒分别为ToCV和TYLCV,明确该番茄植株被ToCV和TYLCV复合侵染。同时发现云南地区有B型和Q型两种烟粉虱存在,且Q型的比例高于B型,二者均可携带ToCV和TYLCV。ToCV首次在云南省发现,其由沿海向内陆蔓延的过程中与TYLCV的复合侵染已蔓延至西南地区,值得高度重视和警惕。