基于梨贝壳杉烯氧化酶基因PpKO 序列的功能性SNP 标记

 基于基因序列的功能性标记是基因分型、图谱定位和相关性状标记辅助选择的理想标记。以‘矮生梨’ב茌梨’的梨杂交分离群体和9个梨栽培品种为试材,以梨赤霉素合成代谢途径的关键酶基因--贝壳杉烯氧化酶基因（PpKO）的cDNA序列为基础,设计5对PCR引物,通过高通量熔解曲线（high resolution melting,HRM）分析,筛选到可对基因进行良好分型的1对引物。通过对杂种后代和测试品种的测序分析表明,此对引物的扩增子是一个位于PpKO第8外显子上的长度为200 bp的序列,从中共检测到两处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）变化,且均为非同义cSNP。这两处SNP标记均可以作为适合高通量分析的遗传标记在遗传作图、基因定位或资源鉴定中加以利用。     

宽皮柑橘单核苷酸多态性的高分辨率熔解曲线分型

 高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting analysis,HRM）可以检测单碱基改变引起的DNA双链熔解温度（T_m）值变化,从而可以对样本在单核苷酸多态性分子标记（Single nucleotide polymor- phism,SNP）上进行基因分型。通过分析NCBI数据库中宽皮柑橘的表达序列标签（Expressed sequence tag,EST）数据鉴别SNP位点,并用小片段扩增法高分辨率熔解曲线分型技术（High resolution melting analysis of small amplicons）分析11个宽皮柑橘（Citrus reticulata）品种以及柳橙（Citrus sinensis Osbeck var.‘Liucheng’）的5个SNP位点的基因型。结果显示,小片段扩增法高分辨率熔解曲线分型可以快速、清楚地分辨纯合与杂合基因型,在校正温度差异后也可以很好地分辨同一个SNP位点不同的纯合型。统计分析表明样本在所有SNP位点上均存在多态性,5个SNP位点的平均多态性信息含量（PIC）为0.3190,显示样本在这组SNP位点上具有较高的杂合率。     

白菜型油菜和菜薹的InDel 标记开发及其RILs群体遗传连锁图谱的构建

 通过白菜型油菜‘R-O-18’和菜薹‘L58’的基因组重测序数据与白菜基因组的参考序列（‘Chiifu-401-42’的基因组序列）的比对,在全基因组范围内检测到了18 479 个短插入缺失变异位点（≤5 bp）。从中挑选了500 个插入/缺失片段为4 ~ 5 bp 的InDel 变异位点,将其设计成InDel 分子标记并进行试验验证,结果有452 个标记通过PCR 扩增出单一条带,但仅有106 个在‘R-O-18’和‘L58’间表现出多态性,346 个没有多态性,48 个在PCR 中没有扩增。亲本间具有多态性的106 个InDel 标记可用来检测以‘R-O-18’和‘L58’为亲本构建的RILs 基因型,并构建了一张包含99 个标记的遗传连锁图谱。     

两种SNP分型方法的比较及其在柚品种鉴定中的应用

 用两种常用的SNP分型方法,等位基因特异性PCR法（Allele-specific PCR,AS-PCR）和高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting analysis,HRMA）,对16个柚栽培品种和8个柚杂种后代材料进行了7个SNP位点的分型研究。结果表明这两种方法所得的分型结果相同,都将24个样本分成了22种基因型。值得一提的是,样本‘八朔’与‘红八朔’,‘红甘夏’与‘川野夏橙’之间在所测位点无差别,表明其应当是同一来源的无性系变异。‘早熟真龙柚’和‘中熟真龙柚’的分型结果表明它们的基因型不同,看来并非是起源同一基因型的不同芽变品种,也不存在亲子关系。可见,AS-PCR和HRMA均适用于柚类品种的区分和鉴定。AS-PCR法是一种准确、低成本的SNP分型方法,适合普通实验室使用,惟对PCR反应体系要求严格。HRMA分型法具有准确、快速、简便、分析量大的特点,但需要专门的设备,试剂成本也高。     

棕果番茄果实颜色遗传及gf位点序列变异分析

将番茄红果材料‘OH 88119’与棕果材料‘Black Cherry’杂交获得F2分离群体。通过对成熟果实外果皮、中果皮/内果皮和胎座颜色的观察,在不考虑番茄红素颜色的情况下,外果皮和中果皮/内果皮的颜色分别由一个基因控制,且独立遗传。用gf位点特异引物经PCR和RT-PCR扩增和测序,获得了‘Black Cherry’和‘紫色圣女果’的基因组DNA序列以及8个棕果番茄的cDNA序列,与红果材料中对应的GF位点序列相比,‘Black Cherry’、‘黑番茄（9T）-h’、‘黑番茄–2012’和‘紫果（圆）’的编码区出现了一个T与C替换,‘紫果（椭圆）’编码区缺失了两个核苷酸AT,而‘紫色圣女果’、‘紫玉（F1）-h-h’和‘Chocolate Cherry’则在编码区插入了一个A,这些突变分别属于gf 4、gf 3和gf 2类型,都形成新的终止密码子。根据序列差异建立了可用于鉴定gf 3和gf 4的dCAPS（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）标记,为棕果番茄的标记辅助选择提供工具。     

梨贝壳杉烯酸氧化酶基因PcKAO1 的克隆与表达分析

 以梨矮化砧木‘中矮1 号’新梢叶片为试材,根据苹果基因组中相关序列信息设计特异引 物,通过RT-PCR 的方法克隆了梨赤霉素合成过程中关键酶--贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）基因的编码 框全长序列。该序列全长1 568 bp,开放阅读框（ORF）编码503 个氨基酸,相对分子量为57.59 kD,等 电点为9.47,氨基酸序列与其它物种已知的KAO 序列具有53.14% ~ 98.61%的相似性,且具有细胞色素 P450 家族蛋白典型的功能结构域和跨膜结构域,将该基因命名为PcKAO1,GenBank 登录号为 KC153027.1。用同样的方法克隆了对照梨品种‘早酥’（乔化）和‘锦香’（半矮化）的PcKAO1 基因, 通过比对分析发现3 个品种的PcKAO1 基因间仅有个别碱基差异,其编码的蛋白序列完全一致。RT-PCR 半定量分析表明：PcKAO1 基因在‘中矮1 号’各个检测的器官组织中均有表达,其中以种子和子房中的 表达量最高;在3 个品种的新梢叶片中,除新梢生长初期（5 月10 日）之外,其他时期矮化砧木‘中矮 1 号’均低于乔化和半矮化的对照品种‘早酥’和‘锦香’,而在这些时期‘中矮1 号’新梢生长逐渐减 缓乃至停长。     

无核酸橙资源‘抛橘’的遗传鉴定

以福建无核酸橙资源‘抛橘’为研究对象，运用 cpSSR（叶绿体 SSR）标记鉴定其母系亲本，nSSR（核 SSR）标记鉴定其父系亲本，并构建 UPGMA 聚类树。7 对 cpSSR 引物扩增出 22 个条带，平均每个位点 3.14 个条带，平均期望杂合度（He）和 Shannon 信息指数（I）分别为 0.47 和 0.81。13 对nSSR 引物扩增出 65 个条带，平均每个位点 5 个条带，He 和 I 分别为 0.66 和 1.27。根据 UPGMA 聚类分析结果推测‘抛橘’是以柚类（Citrus maxima）× 酸橙类（Citrus aurantium）杂交而来，并与代代酸橙有密切联系。以甜橙为参考基因组对‘抛橘’进行基因组重测序的分析结果显示：‘抛橘’与酸橙的基因组序列相似度在 85%以上，进一步证明‘抛橘’可能是酸橙的一种类型。     

通过体细胞无性系变异获得马铃薯优良新材料

为建立马铃薯（Solanum tuberosum L.）试管薯切片再生体系并评价其体细胞无性系变异的应用潜力,以马铃薯品种‘米拉’的试管薯切片为外植体,通过调节培养基植物生长调节剂配比和蔗糖浓度建立再生体系并获得再生植株;通过逆境胁迫快速筛选出优良再生株系‘M-13’,并比较其生长特性及稳定性;利用SCOT和RAPD分子标记检测其遗传变异。结果表明：不添加蔗糖MS + 2 mg ? L-1 6-BA + 0.25 mg ? L-1 TDZ + 0.1 mg ? L-1 2,4-D可获得最高芽分化率65.33%。与母本‘米拉’相比再生植株‘M-13’生长更为健壮,其试管苗和试管薯质量均约为母本的2倍;‘M-13’的根/冠比和叶绿素含量较母本分别升高了112%、23.78%,而叶片可溶性磷含量和过氧化物酶POD活性则分别下降了16.36%和30.37%。SCOT和RAPD两种分子标记均能在‘M-13’中检测到新条带或缺失条带,与母本间的遗传相似系数分别为0.9323（SCOT）和0.9256（RAPD）,表明‘M-13’的DNA发生变异但仍保持母本的大部分特性。     

高羊茅EST-SSR标记开发及遗传多样性分析

采用从其他作物转移与利用自身EST序列设计两种方法为高羊茅（Festuca arundinacea L.）开发EST-SSR分子标记,并利用所开发标记对高羊茅品种（系）进行遗传多样性分析。利用来自小麦、大麦、玉米、高粱和水稻的732对EST-SSR在高羊茅上进行通用性分析,得到406个有效的扩增引物对（55.46%）。利用高羊茅EST数据库（GenBank/dbEST）中63 853条EST序列进行微卫星序列的查找,共发现包含微卫星的EST序列420条,占整个EST总数的0.658%。其中三核苷酸基序出现频率最高（43.33%）,次之为二核苷酸基序（33.57%）。二核苷酸基序以CT/GA出现频率最高（16.90%）,三核苷酸基序以CAG/GTC出现的频率最高（10.63%）。进一步运用Primer 5.0软件设计了108个引物对,并交上海桑尼公司合成。PCR检测表明,92个引物对（85.19%）在高羊茅中均可以扩增出稳定清晰的带型。从498对（其中5种作物的406对,高羊茅的92对）有效扩增的EST-SSR引物中随机选取81对引物,对12个高羊茅品种（系）进行扩增。79个引物对显示出多态性（97.53%）。共检测到133个等位变异,平均每对引物有1.68个等位变异;多态性信息含量（PIC）值最高为0.66,最低为0.14,平均为0.48。聚类分析结果表明,12份材料在相似系数为0.61处可分为5大类：第Ⅰ类为‘爆发力’和‘法思’;第Ⅱ类为‘强劲’、‘家园’和‘翠碧A’;第Ⅲ类为‘可其思3号’和‘凌志’;第Ⅳ类为‘雅典娜2号’、‘美洲虎3号’、‘火凤凰’和‘TF160’;‘球道’单独为第Ⅴ类。     

苹果PGIP基因部分家族成员启动子的克隆与功能分析

根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物,克隆了苹果（Malus × domestica Borkh.）品种‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’中PGIP家族基因PGIP1和PGIP2的启动子片段,序列分析结果表明PGIP1与PGIP2启动子序列相似度为71%,‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’的PGIP1、PGIP2启动子相似度都达到了99%。两个品种PGIP1启动子中TATA-box和CAAT-box的数量明显多于PGIP2,PGIP1和PGIP2启动子分别存在茉莉酸甲酯和水杨酸响应元件,暗示PGIP1和PGIP2存在不同的抗病响应途径。构建了启动子︰︰GUS融合表达载体,通过对农杆菌介导法转化烟草叶片中的GUS活性分析,比较了不同启动子的活性。结果表明：PGIP1启动子活性在品种间差异不显著;PGIP2启动子活性在品种间差异显著,‘秦冠’是‘太平洋玫瑰’的2.37倍,可能与品种抗病性差异有关;同一品种中PGIP1启动子活性显著高于PGIP2。     

通过HRM技术筛查与梨矮生性状决定位点PcDw紧密连锁的SNP标记

在果树的基因组中存在大量的SNP（single nucleotide polymorphism）位点,筛查与目标性状紧密连锁的SNP标记,对目标基因的精细定位具有重要意义。以‘矮生梨’（Pyrus communis L.‘Aishengli’）与‘茌梨’（Pyrus bretschneideri Rehd.‘Chili’）的F1杂交分离群体共215个单株为试材,参考苹果基因组的序列设计26对适合HRM分析的引物,依据分离群体分组分析（bulked segregant analysis,BSA）原理,通过高通量熔解曲线（high resolution melting,HRM）分析,筛选到两个与决定梨矮生性状的PcDw基因连锁的标记CNqau012和CNqau039,二者与目标位点的连锁距离分别是13.3 cM和2.3 cM。对CNqau012和CNqau039的扩增子测序分析表明,在矮生型与普通型中都存在一处单核苷酸变化（分别是G/A和C/T）。这些标记的获得对PcDw基因的精细定位及克隆具有重要意义。     

黄瓜果皮光泽性状的遗传分析及基因定位研究

 以黄瓜（Cucumis sativus L.）果皮有光泽自交系‘1101’（P1）为母本,以3 个无光泽自交 系‘1116’（P2）、‘9930’（P3）、‘1107’（P4）为父本,分别构建6 世代遗传群体,对黄瓜果皮光泽性状 进行遗传规律分析和基因定位研究。结果表明,黄瓜果皮有光泽性状由显性单基因G 控制,有光泽对无 光泽为显性。利用‘1101’ב1116’的F2 群体,结合分离群体分组分析法（bulked segregate analysis, BSA）筛选得到了30 对与黄瓜果皮有光泽基因G 相关的SSR 标记,将该基因定位到黄瓜第5 染色体上, 侧翼标记为CS28 和SSR15818,遗传距离分别为2.0 cM 和6.4 cM。两侧翼标记之间的物理距离为454 kb, 在该区域中共预测了177 个候选基因。     

番茄抗黄化曲叶病基因y-5分子标记及遗传分析

以番茄抗黄化曲叶病毒ty-5基因的抗病材料‘13072’（亚洲蔬菜研究与发展中心提供）和感病材料‘13493’（早粉2号）为亲本配置杂交组合,获得F1、F2、BC1P1和BC1P2 4个世代,对番茄黄化曲叶病抗性基因ty-5进行遗传规律分析和基因定位研究。结果表明,抗性基因ty-5为隐性基因控制。利用657株F2分离单株,应用群体分离分析（BSA）法筛选得到与ty-5基因连锁的5个多态性SSR标记,构建了ty-5基因的分子标记连锁图谱,将ty-5基因定位到番茄4号染色体上,物理距离为737 kb的区段内,两侧翼标记为TES2461和TGS4151,与ty-5遗传距离分别为2.4 cM和3.1 cM。生物信息学分析表明,该区段存在52个预测候选基因。     

结球甘蓝BoCBF1与BoCBF2基因的CAPS标记及其对耐寒性的影响

以两份具有不同耐寒性的甘蓝自交系341和21-3为试材,根据已有拟南芥CBF1基因序列及甘蓝基因组测序拼接出的Scaffold信息,获得了甘蓝BoCBF1和BoCBF2基因编码区的全长序列。经PCR产物直接测序发现BoCBF1基因在自交系341和21-3间的变异表现为4个单核苷酸多态性（SNP）,而BoCBF2基因则表现为16个SNP及1个18 bp碱基的插入缺失（InDel）。为简便快捷地鉴定两个自交系间BoCBF1和BoCBF2基因序列的变异,开发了BoCBF1和BoCBF2基因的CAPS标记,分别命名为BoCBF1-TaqαⅠ和BoCBF2-BstUⅠ。利用这两个CAPS标记对两个自交系、F1、F2群体的基因型与耐寒性进行相关性分析,发现这两个基因的变异与材料的耐寒性极显著相关,可用该标记进行甘蓝耐寒育种的分子标记辅助选择。     

大白菜橘红心类胡萝卜素组分及其基因分析

利用高效液相色谱法（HPLC）,根据二极管阵列检测器和标准品的检测结果对橘红心和白心大白菜内叶类胡萝卜素组分进行鉴定;以橘红心大白菜自交系‘A21530’和白心大白菜自交系‘A21445’为亲本构建了一个269 单株的F2 分离群体,进行橘红心基因精细定位;根据大白菜基因组注释信息,筛选橘红心候选基因并克隆测序分析;基因内部开发标记,在F2 群体进行候选基因验证。研究结果表明,橘红色是由于前番茄红素（7, 9, 7′, 9′–四顺式–番茄红素）、9–顺式–β–胡萝卜素、前链孢红素（7, 9, 9′–三顺式–链孢红素）和其他胡萝卜素组分积累造成的。通过精细定位将橘红心基因定位于A09 号染色体末端,其两侧紧密连锁的标记是SB13037 和SB13049,这两个标记各有一个重组单株,与橘红色基因分别相距0.3 和1.1 cM,物理距离为98.904 kb。根据大白菜基因组注释信息,分析定位区域的23 个基因,筛选出1 个编码类胡萝卜素异构酶的基因CRTISO,基因编号Bra031539。测序结果表明,Bra031539 的编码区有53 个SNP 和6 个碱基缺失,造成12 个氨基酸突变和2 个谷氨酸的缺失。根据缺失突变位点设计标记,在F2 群体中进行验证,结果表明候选基因与橘红心性状共分离。     

辣椒白粉病抗性QTL 定位分析

以辣椒（Capsicum annuum）白粉病抗、感病亲本H3 和83-60 构建的包含142 个重组自交系的RIL（H3×83-60） F8 群体为试验材料，基于亲本重测序数据设计KASPar 引物，构建了包含16 个连锁群的辣椒遗传连锁图谱，总图距1 356.5 cM，标记间平均图距为4.69 cM。基于2016 年和2017 年重组自交系群体白粉病发病表型数据，获得了PMR6.1、PMR9.1、 PMR11.1、PMR11.2 和PMR5.1 等5 个白粉病抗性QTL 位点，其中PMR6.1、PMR9.1 在两年中均被检测到，表型贡献率在 10.8%～21.4% 之间。通过辣椒白粉病抗性QTL 定位，开发与白粉病抗性基因连锁的SNP 分子标记，对于辣椒抗病辅助育 种有重要参考价值。     

葡萄SNP 标记的CAPS 和TSP 分析

 为了建立起葡萄SNP 标记分析的一般方法和探索EST-SNP 标记在葡萄中的应用，对前期开 发的葡萄EST-SNP 位点进行了筛选，设计了28 对CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences，酶切 扩增多态性序列）标记引物和22 对TSP（Temperature-switch PCR，温度转变PCR）标记引物，并在31 份葡萄材料中进行了分析，其中20 对CAPS 引物和10 对TSP 引物电泳条带较清晰，多态性较好。基 因分型统计显示：所有的SNP 位点均含有2 个等位基因，平均多态性信息含量（PIC）为0.336，平均 Shannon’s 信息指数为0.511。基因分型和葡萄材料聚类结果均显示这两种方法所获结果提供的信息量大且 结果可靠。本方法简便、成本低，可作为SNP 分型有效方法用于葡萄品种鉴定、基因分型和遗传多样性 分析等。