胶东半岛地区葡萄病毒病田间调查和血清检测

2008年8—9月对胶东半岛葡萄主产区15个葡萄园的病毒病发生及危害情况进行了田间调查,采集了4个酿酒葡萄品种共计44份葡萄样品,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行病毒血清学检测。从样品中分别检出葡萄斑点病毒(GFKV)、葡萄卷叶病毒1(GLRaV-1)和葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3),检出率分别为6.82%、2.27%和40.91%。蛇龙珠样品中3种病毒均被检出,总检出率达60.71%;赤霞珠样品中检出了葡萄卷叶病毒3和葡萄斑点病毒,总检出率为36.46%。蓬莱地区葡萄样品中3种病毒均被检出,检出率达55.56%,龙口地区病毒检出率也达到了52.17%。     

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间自然发病率调查及检测

对宁夏贺兰山东麓8个酿酒葡萄种植地区8个葡萄品种的病毒病田间自然发病情况进行调查,采用RT-PCR方法,检测了40份样品中GLRaV-1~5这5种葡萄卷叶伴随病毒的感染率。结果表明:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄主要病毒病有葡萄卷叶病、扇叶病和栓皮病,其中葡萄卷叶病尤为严重;不同酿酒葡萄种植区和品种间葡萄卷叶病的感染存在着差异,老葡萄种植区中品种间葡萄卷叶病发病率明显高于新葡萄种植区的品种;"蛇龙珠"和"黑比诺"是感染葡萄卷叶病毒的主要品种,发病率高达85.1%和52.7%;利用5种葡萄卷叶伴随病毒引物进行RT-PCR检测,检出3种病毒类型,且GLRaV-3的检出率最高,为87.5%。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

中国葡萄卷叶相关病毒7检测及基因变异分析

葡萄卷叶相关病毒7(grapevine leafroll-associated virus 7,GLRaV-7)是与葡萄卷叶病相关的重要病原物之一。为明确中国GLRaV-7分离物的基因序列变异,采用RT-PCR方法对采自中国15个省(市)、自治区的188份葡萄样品进行检测,检出率为24.5%(44/188)。对来源于42个GLRaV-7分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)和15个分离物的热休克蛋白70(heat-shock protein 70,HSP70)基因进行克隆、测序。序列分析结果显示,来源于国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.12%~100.00%和88.94%~100.00%、85.33%~100.00%和88.97%~100.00%。基于CP和HSP70基因序列构建的进化树,分别将GLRaV-7分离物划分为6个和5个明显区分的组群。Gp3、Gp4和Gp5仅由中国分离物组成。本研究中初次分析国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因序列变异,可为进一步开展GLRaV-7分子检测的研发及不同变种的致病性研究提供依据。     

DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究

在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)3种方法检测卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)的比较。结果表明:DAS-ELISA的检出率明显低于RT-PCR和IC-RT-PCR方法。RT-PCR可以检测出RNA提取液为1:10-4的GLRaV-3病毒,但它受到了提取RNA难以及其它物质(如蛋白质、DNA等)干扰的影响,检测难度增加。从检测的灵敏度来看,RT-PCR和IC-RT-PCR比DAS-ELISA灵敏;并且,IC-RT-PCR比其它两种方法较快,整个过程仅需8h。     

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

 葡萄卷叶伴随3型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3）和葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白（coat protein,CP）基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing,VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。     

葡萄试管苗热处理脱毒技术研究

为加快培育葡萄优良品种无病毒苗木,提高脱毒效率,开展了葡萄试管苗热处理脱毒技术研究。将携带葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄斑点病毒(GFkV)、沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄卷叶相关病毒-1(GLRaV-1)和葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)的8个葡萄品种试管苗进行恒温热处理,对分离成活的62个茎尖进行RT-PCR和ELISA检测。结果显示,62个茎尖中,29个茎尖脱除了上述5种病毒,葡萄卷叶相关病毒-1、葡萄斑点病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶相关病毒-2和沙地葡萄茎痘病毒的脱毒率分别为81.8%、80.0%、78.1%、75.0%和61.5%。采用试管苗热处理结合茎尖培养方法可获得良好的脱毒效果,适用于葡萄无病毒原种母本树的培育。     

山东省葡萄几种主要病毒病调查及检测研究

对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性样品率33.6%,阳性品种率73.8%,其中资源圃样品阳性率32.7%,生产园样品阳性率34.0%。对检测到阳性样品辅以RT-PCR法验证,2对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340 bp片段、CP基因842 bp片段。GLRaV-1-、2-、3的检测结果表明:鲜食品种3种病原的阳性样品率分别为33.7%、7.1%、62.2%,酿酒品种阳性样品率分别为35.1%、16.2%、54.1%,综合3种病毒的阳性样品率为76.3%,品种感染率87.7%。通过该类研究对推动国内葡萄无毒化生产有重要意义。     

葡萄卷叶病毒3 RT-PCR检测技术研究

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)RT-PCR检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的PCR,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1/LC 2引物进行RT-PCR检测,病毒检出率高于PU/PD引物和EL ISA方法。建立了规范、灵敏、稳定、快速、经济的GLR aV-3RT-PCR检测技术体系。     

基于RT-PCR检测对6个香味葡萄品种感染病毒状况的分析

为明确我国6个香味葡萄品种感染病毒的状况,2018—2019年采用RT-PCR方法,对来源于13个省(市、自治区)的212个样品进行了14种葡萄病毒的检测。结果显示:‘阳光玫瑰’‘玫瑰香’‘巨峰’‘夏黑’‘水晶葡萄’‘着色香’的带毒株率分别为93.22%、67.74%、82.98%、63.33%、27.27%、43.48%;以上各品种检出的病毒种类数分别为13、10、10、8、3、3种,其中分布较广的为沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄斑点病毒(GFkV)和葡萄卷叶相关病毒3(GLRaV-3)。     

葡萄病毒病研究进展

综述了近5年来国际葡萄病毒病最新确立的病毒属、鉴定的新种及几种重要葡萄病毒形态、基因组、病原、病毒检测技术及防治策略。葡萄病毒已由1999年的17个属,47种增加到2003年的20个属,55种。其中葡萄病毒属(Vitivirus),凹陷病毒属(Foveavirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)和葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)为新确定的4个属。已完成葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄斑点病毒(GFkV)的全序列测序(2001年)。新发现葡萄卷叶相关病毒-9号(GLRaV-9)(2002年)。新增加GLRaV-8和葡萄D病毒(GVD)的单克隆抗体和沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)的多克隆抗体。RT-PCR技术已成功地应用于GRLaV-1、GRLaV-2、GRLaV-3、GRLaV-4、GRLaV-5、GRLaV-6、GRLaV-7、GVB、GVA、GVD、GRSPaV、葡萄拟卷叶病毒(GFkV-likeviruses)、GFLV和南芥菜花叶病毒(ArMV)等病毒及葡萄病毒属(Vitivirus)和凹陷病毒属(Foveavirus)病毒的检测。GFLV、ArMV、GVA及GVB和GVA、GFLV、GLRaV-2、GLRaV-3外壳蛋白(CP)基因已分别导入到欧洲葡萄(Vitisvinifera)和沙地葡萄(Vitisrupestrsis)及其他砧木中,目前仍在检测阶段。     

A蛋白酶联免疫吸附法检测葡萄卷叶病毒的研究用离体微嫁接法快速检测苹果潜隐病毒

研究了用A蛋白酶联免疫吸附检测法 (PAS -ELISA)检测葡萄卷叶病毒的程序 ,提出了A蛋白、酶标A蛋白、抗体的适宜工作浓度及样品粗提液稀释倍数。通过对感病植株的幼叶、幼茎、老叶、老茎的检测研究 ,规范了PAS -ELISA检测技术。应用该技术 ,对国家果树种质资源圃郑州葡萄圃的 39份种质及郑州地区栽培的品种进行了检测 ,保存品种的带毒率 76 .9% ,抗逆性较强的东亚种群带毒率 55.6 % ,郑州地区栽培品种葡萄带毒率为 4 5.0 %。     

A蛋白酶联免疫吸附法检测葡萄卷叶病毒的研究

研究了用A蛋白酶联免疫吸附检测法（PAS-ELISA）检测葡萄卷叶病毒的程序，提出了A蛋白、酶标A蛋白、抗体的适宜工作浓度及样品粗提液衡释倍数。通过对感病植株的幼叶、幼茎、老叶、老茎的检测研究，规范了PAS-ELISA检测技术。应用该技术，对国家果树种质资源圃郑州葡萄圃的39份种质及郑州地区栽培的品种进行了检测，保存品种的带毒率76.9%，抗逆性较强的东亚种群带毒率55.6%，郑州地区栽培品种葡萄带毒率为45.0%。     

水杨酸对感染卷叶病毒‘蛇龙珠’葡萄光合作用和果实品质的影响

为了提高感染卷叶病毒的酿酒葡萄品质,试验以感染卷叶病毒的‘蛇龙珠’葡萄为试材,研究叶面喷施不同浓度水杨酸对葡萄叶片光合作用、果实品质的影响。结果表明:水杨酸处理不能显著抑制葡萄叶片中卷叶病毒的侵染,但可以提高叶片叶绿素含量和净光合速率,提高果实中转化酶活性,促进糖分积累;葡萄谢花后20 mg/L水杨酸处理显著提高了叶片叶绿素含量和1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rbuisco)活性,叶片净光合速率显著升高,同时也显著提高了果实中转化酶活性,提升果实品质。因此,葡萄谢花后适宜浓度的水杨酸处理可以通过提高叶片光合能力和果实中糖分积累相关酶活性来提高感染卷叶病毒葡萄的果实品质。     

6-BA对染卷叶病毒葡萄光合作用和果实品质的影响

以染卷叶病毒的“蛇龙珠”葡萄为试材,研究了6-BA处理对葡萄叶片光合作用和果实品质的影响.结果表明:6-BA处理不影响葡萄新生叶片中病毒的含量,但可以提高叶片中叶绿素含量、1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(简称Rubisco)和Rubisco活化酶(RCA)活性,延缓叶绿素的降解,提高叶片的光合速率.40 mg/L的6-BA处理在花后90～120 d可显著提高叶片的光合速率,最终提高果实的品质.因此,适当浓度的6-BA处理可以通过延缓因病毒侵染造成的叶绿素衰老,促进同化物运输来提高染葡萄卷叶病毒-Ⅲ的酿酒葡萄叶片光合作用和果实品质.     

我国葡萄主栽区卷叶病相关病毒种类的检测分析

田间调查200个葡萄品种,结果82个品种表现葡萄卷叶病症状,其中欧亚种群表现葡萄卷叶病症状的品种最多,发病率最高,发病症状最重;欧美杂种发病率和严重度均比欧亚种群低;未发现美洲种群的品种表现葡萄卷叶病症状.从58株表现卷叶病的葡萄上采集休眠枝条进行卷叶病毒ELISA和RT-PCR检测,葡萄卷叶病毒-1,2,3,4,5和...     

葡萄卷叶病毒Ⅲ RT-PCR检测技术研究

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,对葡萄卷叶病毒株系Ⅲ进行了检测。采用的技术流程为:通过提取葡萄叶片或韧皮部总ＲＮＡ,获得病毒的ＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ,经ＰＣＲ扩增,获得病毒ｃＤＮＡ的特征片段,并进行了序列分析。对提取的总ＲＮＡ进行了完整性和纯度检测,确定了良好的ＲＮＡ获得方法。结果表明,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增的片段序列与病毒源序列的同源性高达９９．３%,说明采用本研究确定的方法检测葡萄卷叶病毒株系Ⅲ结果可靠。     

叶面喷施壳寡糖对感染卷叶病毒葡萄果实糖分积累的影响

为了降低葡萄卷叶病毒侵染对酿酒葡萄造成的损失,提高葡萄产量和品质,以'赤霞珠'为试材,研究谢花后叶面喷施壳寡糖处理对葡萄果实糖分卸载和果实品质的影响结果表明,壳寡糖处理没有显著影响葡萄结果枝叶片中病毒的含量,但可提高果实转化酶和ATPase酶活性,促进糖分卸载速率,其中100mg/L壳寡糖(T2)在处理后40~80d显著提高了果实转化酶和ATPase酶活性,显著促进果实糖分卸载,采收时果实品质得到显著提高。因此,在谢花后,叶面喷施适当浓度壳寡糖可以通过调节转化酶和ATPase酶活性来促进果实糖分的积累,提高已感染卷叶病毒葡萄的果实品质。     

酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。