李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是在桃（Prunus persica）上进行基因沉默的主要手段，现有VIGS体系效率较低，亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase）基因PpPDS为指示基因，探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明，在侵染方式上，叶片注射是有效的方式；李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）载体（pCaRNA1/2和pCaRNA3）优于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）改造后的TRV载体（pTRV1和pTRV2）；温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高；苗龄为5～6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高，达到85%；菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数，选择桃叶绿素合成基因（PpGluTR和PpPOR）为目标基因进行验证，结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制，叶片颜色变化明显。这些结果表明优化...     

白菜NRT2基因的克隆及表达模式分析

 以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种‘苏州青’为试材,采用RT-PCR技术,获得1个高亲和硝酸盐转运蛋白基因（NRT2）的cDNA序列,全长1 593 bp,推断其编码530个氨基酸,命名为BcNRT2。序列分析表明：BcNRT2基因与甘蓝型油菜BnNRT2基因和拟南芥AtNRT2.1基因核苷酸序列的相似性分别为98%和90%,氨基酸序列的相似性分别为99%和95%,表明植物中NRT2基因保守度较高。实时定量PCR表达分析表明,BcNRT2在白菜根部的表达量最高,为诱导型表达。低浓度NO^₃-（0.2 mmol · L^-1 KNO₃）处理0.5 h后其表达量迅速上升,BcNRT2可能为NO₃^-感受器。高浓度NO₃^-（20 mmol · L^-1 KNO₃）处理后其表达量更高,持续时间较长,可能是受到低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1.1的调控而产生的高水平响应。原生质体的瞬时表达显示,BcNRT2蛋白位于细胞膜上。     

茄子TRV-VIGS体系的优化及SmIAA19基因功能初步分析

以经过改造的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体PYL156为工具,采用叶片注射法侵染茄子（Solanum melongena L.）叶片,通过表型比较、TRV病毒分子检测和荧光定量PCR技术分析,探究环境温度、植株大小、目的基因插入片段大小对茄子TRV-VIGS沉默体系的影响。结果表明,昼夜温度为（25 ± 3）℃和（20 ± 2）℃时,接种茄子幼苗子叶的植株沉默效果明显,侵染后植株叶片中目的基因表达量与阴性对照相比明显降低;早春日光温室和秋季日光温室条件下,侵染植株表型性状和基因表达量差异不显著。沉默片段大小为200 bp左右时目的基因的沉默效果最好;侵染茄子幼苗子叶期植株出现明显病毒斑,而接种6周龄真叶则无明显表型差异。用茄子生长素诱导基因（SmIAA19）为靶基因对其进行验证,结果表明显著抑制了SmIAA19的表达,其在叶片中的表达量和生长素含量均显著降低,表明SmIAA19是1个与生长素代谢途径相关的基因。     

西瓜抗病毒RNAi植物表达载体的构建

为了研究转化同一种病毒的不同基因在转基因西瓜中引发RNA沉默的效果以及利用RNA沉默培育抗多种病毒的策略,以pFGC5941为骨架质粒,分别构建了ZYMV cp、nib和Hc-Pro基因的反向重复植物表达载体pFIRZYMVCP、pFIRZYMVNIb和pFIRZYMVHc-Pro;利用重叠延伸PCR的方法,首先构建了含有CMV cp、WMV cp和ZYMV cp部分基因片段的CWZ cp三价基因,采用该三价基因构建了CWZ cp基因的反向重复植物表达载体pFIRCWZ CP。研究首次在国际上构建了西瓜转基因抗病毒RNAi植物表达载体,为探讨RNA沉默在转基因抗病毒西瓜中的应用奠定了基础。     

病毒诱导的基因沉默在番茄组织中的特异性分析

 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是植物基因功能研究的新技术。以组成型表达gusA基因的转基因番茄为材料,通过VIGS技术沉默gusA基因,对VIGS在番茄中的组织特异性进行了初步分析。结果表明,VIGS技术能有效地诱导gusA基因在番茄植株的叶片、花、果实、侧枝、主茎及茎分枝点等部位和组织中沉默,证明VIGS在番茄中具有较强的系统性沉默特征。     

番茄抗黄化曲叶病毒病相关基因ClNLR 的功能分析

 在前期通过转录组研究发现1 个NBS-LRR 类抗病基因（Solyc05g009760.1）在抗TYLCV 番茄材料‘CLN2777A’中上调表达，推测可能参与抵抗TYLCV 侵染的防卫反应的基础上，以‘CLN2777A’ 番茄为材料，通过RT-PCR 克隆该基因全长cDNA 序列，命名为ClNLR。荧光定量PCR 发现ClNLR 在番 茄‘CLN2777A’的根和叶片中高水平表达。ClNLR 在本氏烟叶片上的瞬时表达诱导了过敏性反应。病毒 诱导的基因沉默（VIGS）抑制ClNLR 基因在抗病番茄‘CLN2777A’中表达后，接种TYLCV，检测叶片 带毒量，发现VIGS 处理的番茄植株体内的TYLCV 积累量与其ClNLR 基因表达水平成反比。这些研究结 果表明ClNLR 可能为抗番茄黄化曲叶病的相关基因。     

利用农杆菌注射法鉴定番茄黄化曲叶病毒的沉默抑制子

利用农杆菌注射法鉴定了番茄黄化曲叶病毒的沉默抑制子V2。将分别携带目标基因与GFP表达载体的农杆菌共注射到本氏烟草中,2 d后GFP瞬时高量表达。西瓜褪绿矮化病毒BV1基因表达载体和空载体pBIN分别与GFP共侵染7 d后,GFP表达量由于寄主沉默机制而急剧减弱。V2基因表达载体与GFP表达载体共侵染叶片7 d后,GFP仍保持高水平表达,说明V2作为番茄黄化曲叶病毒沉默抑制子可阻止寄主的沉默机制。农杆菌注射法可快速方便筛选植物病毒沉默抑制子。     

平邑甜茶MhVPE基因ihpRNA干扰载体的构建及转拟南芥验证

 根据平邑甜茶液泡加工酶（vacuolar processing enzyme）基因MhVPE（GenBank登录号为FJ891065）cDNA序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物F1/F2和R1/R2,以pMD-MhVPE质粒为模板,分别克隆了用于构建干扰载体的正反义片段pMD-F和pMD-R。将该正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成了含有内含子发夹结构的ihpRNA表达载体pART-RNAi-MhVPE。通过农杆菌介导,用花序浸泡法转化拟南芥进行验证,经过抗性筛选和PCR检测,得到17株转基因阳性植株;半定量RT-PCR结果显示所获得的转基因拟南芥植株中AtVPE同源基因的表达量明显降低,表明该干扰载体能够有效抑制VPE基因的表达,MhVPE基因的ihpRNA干扰载体构建成功,为进一步鉴定该基因的功能奠定了基础。     

VIGS载体在果树中的应用研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物中天然存在的一种抵御外源核酸入侵的防御反应,属于转录后基因沉默现象,现在已被开发成通过改造含有目的基因片段的病毒载体来抑制植物内源基因表达的遗传技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS技术具有简便、高效、高通量的优势,近年来在果树基因功能的研究中发挥了重要作用。由于VIGS技术需要借助病毒载体来实现,所以选择适宜的病毒载体是在性状各异的果树中成功构建VIGS体系的关键。本文介绍了在果树中应用的VIGS载体及其在基因功能研究中的应用实例,并分析了病毒载体在诱导果树基因沉默时存在的一些问题及解决方法。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。     

番茄青枯病抗性两个相关基因功能的初步鉴定

对抗性番茄材料‘Hawaii 7996’分别接种强致病力青枯菌（RsH）和中等致病力青枯菌（RsM）后,利用双向电泳技术找到了两个差异表达蛋白质--谷胱甘肽S转移酶L3和Remorin 1蛋白。在利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因PDS的TRV重组病毒载体通过叶片浸润法证明VIGS体系可行后,进一步利用该技术沉默上述两个蛋白质的对应基因GST-L3和Rem-1,并用半定量RT-PCR检测沉默效果。结果表明,分别沉默GST-L3和Rem-1的番茄植株抗性减弱,在接种中等致病力青枯菌（RsM）后青枯病发病率和病情指数都明显高于对照植株,说明基因GST-L3和Rem-1与番茄对青枯病的抗性相关。     

普通白菜苗期耐热性鉴定方法研究

采用人工气候箱高温处理方法,分别于春、秋和夏季,在6种不同的高温条件下对10份普通白菜材料进行连续7 d的高温处理研究其耐热性。结果表明,在不同的高温胁迫下,各供试材料均会出现不同程度的热害症状,如叶片反卷、失绿等,并随着温度的升高和处理时间的延长,热害症状加剧。以春季和秋季采用37 ℃/27 ℃（昼/夜）处理幼苗4 d后调查其热害指数,可以显著反映出普通白菜各品种间的耐热性差异。而夏季采用自然温度育苗后在37 ℃/27 ℃（昼/夜）下不能显著区分普通白菜各品种间耐热性差异。     

锌处理对白菜营养品质的影响

 采用盆栽的试验方法, 研究了重金属锌(Zn) 对白菜各营养品质指标的影响。结果表明, Zn不仅极显著影响白菜地上部生物量及Zn 吸收量, 还显著影响白菜叶绿素、维生素C、还原糖、粗蛋白、粗纤维等各营养品质指标。     

光合细菌对不结球白菜生长发育和品质的影响

对光合细菌在促进不结球白菜生长发育和品质提升中的作用进行研究,结果表明,光合细菌处理可明显促进不结球白菜的生长发育。与对照相比,不结球白菜株高、叶面积、单株产量和叶片总叶绿素含量分别增加了37.35%、45.97%、57.06%和66.5%;提高了不结球白菜的品质,光合细菌处理的植株可溶性糖和Vc含量分别比对照提高了39.06%和19.73%,硝酸盐含量降低26.29%。可以看出光合细菌可明显促进不结球白菜的生长发育和品质的提升。     

大白菜温度敏感雄性不育育性转化相关XET基因的电子克隆

以从大白菜温敏雄性育性转化相关基因差异表达的分析中获得的EST-58为标签,采用电子克隆的方法对其进行延伸,并对电子克隆的结果进行RT-PCR验证,结果表明:电子克隆到1个由1197bp核苷酸组成的序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为292个氨基酸。经RT-PCR扩增,连续样品间EST-58表达的带型变化趋势与cDNA-AFLP的差异显示情况一致,且RT-PCR获得的序列与电子克隆的序列一致性达98%。用该序列在GenBank数据库中进行blastX同源性分析,确定该序列为大白菜的XET基因(GenBank登陆号为EU579461)。     

特制纳米新材料及电加温线对青菜生长和产量的影响

为比较特制纳米新材料及电加温线对青菜生长及产量的影响,设置2个纳米线处理、1个电加温线处理和空白对照,在连栋大棚内对"五月慢"青菜进行栽培试验。结果表明:纳米新材料处理与电加温线处理有效促进了早春低温环境下青菜的生长,与对照相比,青菜生长加快,叶面积增大,生长期有所提前;产量方面,T₁（纳米线1根在生长层,另1根在土表下）、T₂（纳米线2根均在土表下）、T₃（电加温线2根均在土表下）分别较对照增加了90.8%、48.8%与107.5%,增产效果显著。综合结果来看,T₃效果最优,T₁次之,部分纳米线设置在生长层对青菜的增产效果优于全部纳米线设置于土表下。     

BrVIN3.1 互作蛋白BrZAT12 在大白菜春化途径中行使功能初探

BrVIN3.1 在春化过程中通过调控BrFLC1 的表观修饰状态，进而调控其表达控制大白菜花期。本试验以BrVIN3.1 （Bra020445）为诱饵，进行酵母cDNA 文库筛选，从中筛选到它的互作蛋白BrZAT12（Bra006691）；进一步进行酵母双 杂一对一验证，证明BrZAT12 能够与BrVIN3.1 互作。采用低温处理不同花期的大白菜材料，进行表达模式分析，发现 BrZAT12 的表达模式在抽薹性状不同的大白菜材料中存在差异，在易抽薹材料中的表达量明显高于耐抽薹材料，且在耐抽薹 材料中变化幅度较小，同时BrZAT12 的表达模式与BrVIN3.1 相关。推测BrZAT12 可能在大白菜春化调控的开花途径中行使 功能。