马尾松PmEMF2基因的克隆及表达分析

以马尾松(Pinus massoniana)为研究材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得Pm EMF2基因全长,该基因完整开放阅读框全长2 184 bp,编码727个氨基酸。生物信息学分析表明,Pm EMF2基因含有EMF2基因保守的VEFS-Box和C2H2结构域。系统进化分析表明,马尾松Pm EMF2与白云杉(Picea glauca)和无油樟(Amborella trichopoda)等裸子植物的亲缘关系较近,EMF2类基因基本能按裸子植物、单子叶植物和双子叶植物分开。表达分析表明,Pm EMF2基因在不同组织中均有表达,在嫩茎和嫩叶中的表达量较高,Pm EMF2在雌球花发育中均表现为先升后降的表达趋势,说明Pm EMF2基因参与调控了马尾松雌球花发育。     

马尾松谷胱甘肽过氧化物酶PmGPX6基因cDNA克隆及转化拟南芥耐旱性初步研究

[目的]克隆马尾松谷胱甘肽过氧化物酶基因,并对其进行功能研究。[方法]采用RACE技术克隆基因c DNA序列,实时荧光定量PCR检测基因在马尾松干旱胁迫下的表达模式,花序浸泡法转化拟南芥,并对转基因与野生型拟南芥的生长表型和根系生长进行分析。利用荧光显微镜技术对转基因拟南芥不定根进行GFP荧光检测。[结果]克隆到1个871 bp的GPX基因全长c DNA序列,命名为Pm GPX6。Pm GPX6包括513 bp的完整开放阅读框,编码170个氨基酸残基。Pm GPX6蛋白与油松Pt GPX蛋白同源性达95%。Pm GPX6在马尾松根中高表达,茎、叶中表达量低。在干旱胁迫下,Pm GPX6在根、茎、叶中的表达量均在第15天达到最大,随后出现下降趋势。过表达Pm GPX6与野生型拟南芥植株在正常水分条件下表型与根长差异不大,但在干旱胁迫下,转基因植株根系更长。转基因拟南芥根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光,表明Pm GPX6基因能高效表达。[结论]推测Pm GPX6可能参与马尾松干旱胁迫应答。     

马尾松紫色酸性磷酸酶基因PmPAP1的克隆与表达模式分析

[目的]研究马尾松紫色酸性磷酸酶基因功能及其对低磷胁迫的应答。[方法]采用RACE法克隆马尾松紫色酸性磷酸酶(PAPs)家族成员Pm PAP1,利用软件和数据库,对基因结构功能进行多重分析预测,检测其接种外生真菌及低磷胁迫下的表达模式。[结果]表明,Pm PAP1基因c DNA全长2 520 bp,开放阅读框1 869 bp,编码622个氨基酸残基,具紫色酸性磷酸酶保守结构域特征,属于高分子量PAPs。Pm PAP1有信号肽,无跨膜区,推测定位于细胞质基质或细胞器基质中,它与莲(Nelumbo nucifera)、无油樟(Amborella trichopoda)的亲缘关系最近,相似性分别达71%和69%,进化关系古老、保守性强。时空表达分析表明,Pm PAP1的表达受外生菌根诱导,在不同组织中均有表达,其根中的表达量显著高于茎和叶。在菌根化和非菌根化的幼苗中,Pm PAP1的表达均受基质中磷含量的影响,表现为低磷条件下高效激活,高磷条件下其表达反而受到抑制。低磷胁迫下根系中酸性磷酸酶活性持续增高,说明其活性与磷供给水平和时间有相关性。[结论]首次克隆鉴定了1个受外生菌根诱导的马尾松紫色酸性磷酸酶基因,其参与了对低磷胁迫的应答,为深刻认识马尾松耐低磷的分子机制、遗传改良提供了新信息和新思路。     

马尾松纤维素合成酶基因PmCesA2的克隆及其植物表达载体的构建

为了探究马尾松木材形成的分子机制,以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松CesA2基因的全长cDNA序列(命名为PmCesA2),序列长度为3 500 bp,包含一个长为3 174 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码1 057个氨基酸.序列分析表明:PmCesA2序列与已报道的火炬松CesA2基因(AY789651.1)的相似性达98％.将全长基因克隆到载体pBI121质粒的SnaBI,Sacl双酶切位点之间,构建正义表达栽体pBI121-PmCesA2.     

外源IAA对马尾松幼苗茎干次生生长的影响

【目的】对2年生马尾松幼苗进行不同浓度IAA喷施处理,结合生理生化、形态解剖结构及转录组水平变化等综合分析,揭示外源IAA对马尾松苗期茎干次生生长的影响机制,为阐明马尾松苗期茎干次生生长的分子调控机制奠定基础,可以为培育速生高产的马尾松新品系提供一定的理论参考。【方法】对2年生马尾松幼苗进行不同浓度IAA(0、1、50、100 mg·L-1)喷施处理,处理160天后进行生长指标、解剖结构、生理生化指标的测定;通过高通量转录组测序鉴定差异表达基因,对差异表达基因进行GO和KEGG功能分析。【结果】IAA处理对2年生马尾松的地径、细胞生长(木质部、韧皮部厚度以及木质部细胞层数)、木材主要成分(木质素、纤维素及半纤维素含量)及内源激素含量(生长素、赤霉素及油菜素内酯)具有显著的促进作用(P0.05);通过Illumina测序技术对对照组和IAA处理的6个cDNA文库进行测序,最终得到IAA处理后差异表达基因778个(包括482个上调表达基因和296个下调表达基因),GO分析表明这些差异基因主要富集于细胞成分、分子功能和生物过程中共计22个类别,KEGG分析表明它们参与了64种不同的途径,并筛选出与马尾松次生生长相关的差异表达基因(BRL1、GASA6、CAD和CESA2等)。【结论】IAA处理能够改变内源激素含量,促进细胞分裂,增加木质素、纤维素和半纤维素积累,从而促进马尾松茎干的次生生长。     

马尾松PmPIN1基因的克隆及功能分析

【目的】PIN1基因通过调控生长素极性运输的方式在植物根系生长发育中发挥作用。对马尾松PmPIN1基因进行全长克隆和功能分析,有助于在分子水平揭示马尾松的生根机制。【方法】运用PCR和RACE技术成功克隆马尾松PmPIN1基因cDNA序列;利用生物信息学软件分析PmPIN1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;通过实时荧光定量分析PmPIN1基因在10年生马尾松幼根、1年生枝条、新叶、花中的表达量差异;利用农杆菌侵染法将PmPIN1基因转入烟草获得转基因植株,比较转基因烟草与转pCAMBIA-1302空白载体烟草之间的表型差异;用激光共聚焦显微镜观察PmPIN1-GFP荧光蛋白在转基因烟草根中的表达模式;酶联免疫法测定野生型和转基因烟草的根、根茎结合处及叶中的生长素含量;用不同浓度的生长素极性运输抑制剂1-N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)处理野生型与转基因烟草,分析烟草根、根茎结合处、叶中的生长素含量变化;利用PEG介导法将16318-hGFP-PmPIN1重组载体转化至拟南芥原生质体中进行亚细胞定位分析。【结果】PmPIN1基因全长2914bp,包含2085bp的ORF,编码的蛋白由695个氨基酸组成,N端与C端均有膜运输蛋白。系统进化树显示马尾松与油松在发育树同一支上。通过实时荧光定量发现PmPIN1在不同组织中的表达量差异达到极显著,1年生枝条与幼根中表达量较高,花中最低。农杆菌介导法转化烟草获得的转基因烟草,较转空载烟草株高增长,生根量增加且根系变长。激光共聚焦显微镜观察得出转基因烟草根部中间有明显绿色荧光富集现象。酶联免疫法测定结果表明转基因烟草根、根茎结合处生长素含量高于野生型,且叶较根和根茎结合处减少。不同浓度NPA处理后,野生型烟草根中生长素含量变化达极显著,且生长素含量随NPA处理浓度的增加而减少;处理浓度为10nmol·L~(-1)时,叶中生长素含量最高;处理浓度为2nmol·L~(-1)时,根茎结合处生长素含量增加较多。不同浓度NPA处理后,转基因烟草不同部位生长素含量变化均未达到极显著。亚细胞定位分析表明PmPIN1蛋白主要分布于细胞膜上。【结论】马尾松PmPIN1与油松PIN1亲缘关系最近。PmPIN1属于膜蛋白。PmPIN1转基因烟草可能提高生长素由地上部位向地下部位的运输能力,减少NPA对生长素含量变化的影响,表明PmPIN1可能调控生长素的极性运输;PmPIN1-GFP绿色荧光富集在根部中间部位,PmPIN1在幼根中表达量较高,转基因烟草较转空载植株发根量多,根长长。研究结果表明PmPIN1基因可能在根系发育中发挥重要作用。     

基于高通量转录组测序筛选马尾松抗松材线虫病相关基因

[目的]研究马尾松抗松材线虫病相关基因,为解析马尾松抗性机理和高抗马尾松早期选择提供理论依据。[方法]对高抗和易感2种马尾松基因型接种松材线虫,在接种后第1、15和30天取样进行转录组高通量测序,通过对高抗和易感马尾松差异基因识别以及富集分析,以筛选与抗松材线虫病相关的组成型差异基因。[结果]对高抗和易感马尾松接种松材线虫后的转录组进行比较,在接种后第1、15和30天分别获得2 866、679和1 657个差异基因,且在接种松材线虫后不同时间点间,共有差异基因相对较少。对差异基因进行GO富集分析,结果显示:在接种后第1、15和30天,最显著的生物学进程是氧化-还原过程,而GO项刺激反应、转录调节以及香叶基二磷酸代谢过程也显著富集。对这几类GO项相关基因进一步分析,发现接种后3个时间点GO项刺激反应中共包括26个R基因,除了2个R基因外,其它R基因表达皆为组成型,在接种松材线虫和对照间差异不显著,而GO项转录调节中仅2个差异基因被nr注释为ERF转录因子,其余为未知基因。接种松材线虫后,ERF转录因子在高抗马尾松上的表达量始终高于易感马尾松上的表达量,且在接种松材线虫和对照间表达量变化不显著,也为组成型基因表达。GO项香叶基二磷酸代谢过程中,GGPPS 3个基因也在高抗马尾松上具有更高表达量,为组成型基因表达。这些基因中TIR-NBS-LRR基因(c65785.graph_c0)、ERF转录因子(c78073.graph_c0)和3个GGPPS基因在高抗马尾松中表达量较高,而在易感马尾松中表达量较低,甚至为0,可作为开发分子标记的候选基因用于鉴定抗性马尾松。[结论]高抗和易感马尾松在接种松材线虫后第1天其表达量差异达到显著水平的基因最多,其中,LRR基因、ERF转录因子和GGPPS与马尾松的抗性相关,部分TIR-NBS-LRR基因、ERF转录因子和GGPPS有望被开发为鉴定高抗马尾松的分子标记。     

马尾松转录组密码子使用偏好性及其影响因素

【目的】异源表达是植物蛋白功能验证和分子育种的重要手段,而密码子是异源基因高效表达的重要因素,对马尾松转录组基因编码区密码子偏好性分析可以为马尾松分子育种提供一定的理论支持。【方法】利用CodonW、EMBOSS密码子分析软件对马尾松转录组进行密码子参数分析和密码子偏好性分析,根据中性绘图、ENc-GC3s、偏倚性分析推测马尾松密码子偏好性的主要形成原因。通过比较高低表达基因样本同义密码子相对使用度(RSCU)筛选马尾松最优密码子,通过密码子使用频率比值分析马尾松与拟南芥、烟草、欧洲山杨、大肠杆菌、酿酒酵母的密码子偏好性差异。【结果】马尾松转录组编码序列(CDS)密码子平均GC含量为44. 95%,密码子第3位GC含量为38. 95%,尤为偏好A/T。高、低表达基因样本统计分析表明,马尾松转录组RSCU差异较小,筛选出TTA、CAA、TGT、GGT等27个密码子可作为马尾松的最优密码子。中性绘图、ENc-GC3s关联分析以及偏倚分析表明,马尾松密码子偏好性的形成可能主要受突变影响,其次受自然选择等多重因素共同影响。密码子使用频率分析表明马尾松密码子偏好性与烟草、拟南芥和欧洲山杨相比差异较小,与大肠杆菌差异最大,与酿酒酵母差异小于大肠杆菌。【结论】马尾松偏好第3位为A/T的密码子,筛选出27个最优密码子,其中25个密码子第3位为A/T。马尾松密码子使用偏好性形成主要受突变影响,其次受自然选择等多重因素共同影响。烟草可以作为马尾松基因异源表达的优选植物生物体,而微生物中酿酒酵母可能优于大肠杆菌。     

松材线虫侵染下马尾松针叶miRNA和mRNA的关联表达

[目的]微小RNA(microRNA,miRNA)具有靶向沉默信使RNA(mRNA)表达的功能,是基因表达的负调控因子;研究并明确马尾松在遭受松材线虫侵染下是否存类似的调控模式,对于未来探析寄主植物对病原侵染胁迫下的应激机制及获得调控马尾松抗松材线虫病的miRNA及其靶标mRNA都具有重要意义。[方法]以前期高通量测序获得的松材线虫侵染1、2、3 d的马尾松针叶mRNA和miRNA表达谱为研究对象,采用STEM软件分别分析mRNA和miRNA的表达变化模式,并运用斯皮尔曼等级相关法研究松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA与mRNA的表达关联情况。[结果]松材线虫侵染下的马尾松针叶中的miRNA呈2种显著的表达变化模式,mRNA呈8种显著的表达变化模式,且15个miRNA与其12个靶标mRNA的表达变化模式相反,符合miRNA对靶标mRNA的负调控特点,这些靶标mRNA编码具有识别病原作用的ACRE、CC-NBS-LRR基因等。[结论]松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA及mRNA均呈多种表达变化模式,且部分miRNA与靶标mRNA的表达变化模式相反,推测其中部分miRNA可能是病原识别基因的负调控因子。     

牡丹PsAP2基因的克隆及表达

以牡丹品种‘赵粉’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得1个牡丹APETALA2基因cDNA全长,命名为PsAP2,GenBank登录号为HM167511。序列分析结果表明:PsAP2全长2138bp,包含47bp的5'非编码区、557bp的3'非编码区和1个长度为1533bp编码510个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因属于AP2家族。序列比对和系统进化分析表明,PsAP2与葡萄的亲缘关系最近,相似性达70%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsAP2在根、茎、叶和四轮花器官中均有表达。花瓣中的表达量最高,叶片中表达量最低。