基于高通量转录组测序筛选马尾松抗松材线虫病相关基因

[目的]研究马尾松抗松材线虫病相关基因,为解析马尾松抗性机理和高抗马尾松早期选择提供理论依据。[方法]对高抗和易感2种马尾松基因型接种松材线虫,在接种后第1、15和30天取样进行转录组高通量测序,通过对高抗和易感马尾松差异基因识别以及富集分析,以筛选与抗松材线虫病相关的组成型差异基因。[结果]对高抗和易感马尾松接种松材线虫后的转录组进行比较,在接种后第1、15和30天分别获得2 866、679和1 657个差异基因,且在接种松材线虫后不同时间点间,共有差异基因相对较少。对差异基因进行GO富集分析,结果显示:在接种后第1、15和30天,最显著的生物学进程是氧化-还原过程,而GO项刺激反应、转录调节以及香叶基二磷酸代谢过程也显著富集。对这几类GO项相关基因进一步分析,发现接种后3个时间点GO项刺激反应中共包括26个R基因,除了2个R基因外,其它R基因表达皆为组成型,在接种松材线虫和对照间差异不显著,而GO项转录调节中仅2个差异基因被nr注释为ERF转录因子,其余为未知基因。接种松材线虫后,ERF转录因子在高抗马尾松上的表达量始终高于易感马尾松上的表达量,且在接种松材线虫和对照间表达量变化不显著,也为组成型基因表达。GO项香叶基二磷酸代谢过程中,GGPPS 3个基因也在高抗马尾松上具有更高表达量,为组成型基因表达。这些基因中TIR-NBS-LRR基因(c65785.graph_c0)、ERF转录因子(c78073.graph_c0)和3个GGPPS基因在高抗马尾松中表达量较高,而在易感马尾松中表达量较低,甚至为0,可作为开发分子标记的候选基因用于鉴定抗性马尾松。[结论]高抗和易感马尾松在接种松材线虫后第1天其表达量差异达到显著水平的基因最多,其中,LRR基因、ERF转录因子和GGPPS与马尾松的抗性相关,部分TIR-NBS-LRR基因、ERF转录因子和GGPPS有望被开发为鉴定高抗马尾松的分子标记。     

砧木及抗性马尾松松脂组分对松材线虫的响应

[目的]通过对马尾松接种松材线虫,分析接种前后松脂化学组分的变化,为马尾松抗松材线虫病的研究提供理论基础。[方法]以浙江省临海市5年生马尾松无性系为研究对象,提取接种前和接种松材线虫1、7、15 d的不同砧木(马尾松砧木和湿地松砧木)、不同抗性(高抗和易感)马尾松的松脂组分,分析各松脂组分含量及动态变化;利用松脂内所得有效萜类对松材线虫实施外源处理,测定松材线虫存活率。[结果]从不同砧木(马尾松砧木和湿地松砧木)、不同抗性(高抗和易感)马尾松中检出19种主要化学组分,其中,α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、海松酸、山达海松酸、长叶松酸/左旋海松酸、去氢枞酸、枞酸和新枞酸含量较高。接种松材线虫1 d时马尾松砧木中β-月桂烯含量显著高于湿地松砧木(p<0.05);接种松材线虫7 d与15 d时上述组分含量在不同砧木间无显著差异。不同抗性马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、龙脑、长叶烯、α-石竹烯、反式-β-金合欢烯和新枞酸含量在接种松材线虫后变化规律不同,接种松材线虫1 d时高抗马尾松中α-蒎烯和β-蒎烯含量显著高于易感马尾松;接种松材线虫7 d时高抗马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯...     

针叶矿质营养元素与松材线虫病感病的关系

用ＩＣＰ仪测定１０个有代表性种源的马尾松针叶的矿质营养元素,同时对这１０个种源接种松材线虫,结果发现不同种源的抗性差异显著。马尾松不同时期的矿质元素含量与马尾松对松材线虫的抗性关系不一样,其中休眠期针叶内的Ｍｎ,Ｆｅ,Ｃｏ含量与抗性呈正相关,而Ｎｉ含量与抗性呈负相关。     

不同松树感染松材线虫后NO和核酸酶变化与其抗病性的关系

以黑松、马尾松和火炬松为研究对象,对其接种松材线虫后4,12,24,48,72,96和120 h的NO和核酸酶的活性进行测定.3种松树接种松材线虫后,针叶内NO平均含量的积累为火炬松＜马尾松＜黑松,这种差异在12 ～48 h尤为明显;48h后较其割伤处理(CK1)的增加幅度为火炬松＞马尾松＞黑松.同时3种松树接种后的核酸酶变化趋势存在差异,单链核酸酶活性在4～48 h为火炬松＞马尾松＞黑松,而火炬松双链核酸酶活性在4～96h时却一直低于马尾松和黑松,这表明不同松树体内单链或双链核酸酶的活性变化与其抗病性有关.且3种松树在接种松材线虫后,表现出症状的时间顺序为黑松最早,马尾松次之,火炬松最晚.这表明NO和核酸酶的变化与松树感染松材线虫后的病程发展密切相关.     

黑松和马尾松苗受松材线虫侵染后部分化学物质的响应

为研究松材线虫侵染对寄主植物生理生化物质代谢的影响,以黑松和马尾松4 5年生苗为实验材料,测定了接种松材线虫对2种寄主植物的营养物质和次生代谢物质含量的变化及其规律。结果显示:接种松材线虫初期,黑松和马尾松的总糖含量均较高,随接种时间的延长,总糖含量呈不断下降趋势;黑松的可溶性糖含量一直降低并明显低于对照,马尾松的可溶性糖含量在侵染前期与对照相比变化不明显,而15 d后快速降低;黑松和马尾松的可溶性蛋白含量侵染前期均低于对照,后升高,再降低;黑松的单宁含量明显高于对照,马尾松的单宁含量接种第1天略低于对照,第3天后开始升高;黑松和马尾松的总酚含量均在侵染前期高于对照,而后降低。这些物质的变化趋势显示松材线虫侵染不同寄主植物的生理反应。     

松材线虫入侵对马尾松树光合特性的影响

[目的]明确松材线虫入侵对马尾松树针叶光合特性、光合响应曲线、主要光合响应指标及碳氮元素含量的影响,以期在光合生理水平上提供松材线虫病的早期快速诊断技术,为林业管理者采取快速防治措施提供科学的理论依据。[方法]本研究选取健康期、感病中期和感病末期马尾松树为研究对象,利用Li-6400XT便携式光合测定仪和稳定同位素质谱仪,分别测定不同感病阶段马尾松树针叶光合特性及所测针叶样品的C%、N%和δ~(13)C含量。[结果]健康马尾松树在松材线虫胁迫条件下,可显著降低其针叶的净光合速率、蒸腾速率及气孔导度,其数值大小均表现为:健康期感病中期感病末期;不同感病阶段马尾松的暗呼吸速率数值之间的差异也达到极显著水平,其数值的大小表现为:感病中期健康期感病末期;健康期马尾松的光补偿点显著低于感病中期的光补偿点,但是其光饱和点显著高于感病中期的光饱和点。此外,不同感病阶段马尾松树针叶的平均C素含量变化不大,但平均N素和平均δ~(13)C含量则会显著下降。[结论]松材线虫侵染健康马尾松树后,可降低其对外界光照条件的适应能力,致使其光合特性显著下降;感病马尾松树针叶N素损失是导致马尾松光合能力显著下降的一个主要原因;感病马尾松树针叶气孔导度下降是导致其针叶δ~(13)C含量下降的主要原因,同时亦说明松材线虫的入侵会显著降低马尾松树针叶的水分利用效率。     

无细菌松材线虫对马尾松的致病性

【目的】探讨松材线虫及其伴生细菌在松材线虫病中的作用,为其致病机制研究及病害防治提供理论依据。【方法】以5年生温室健康马尾松盆栽苗为材料,人工接种无菌松材线虫和带菌松材线虫(8 000条·株-1),观察松苗萎蔫情况,并于接种5、10和30天后取茎段横切面观察松脂分泌情况,对接种20天后的茎段组织解剖结构进行显微观察,接种后30天对植株取样进行线虫再分离,统计线虫在树体内种群增殖情况。【结果】无菌松材线虫和带菌松材线虫均能引起5年生马尾松盆栽苗发病,且症状一致,接种35天后致萎蔫率均达到90%,对照植株保持健康状态;茎段横切面观察结果显示,无菌松材线虫接种5天后松脂停止分泌,10天后茎段开始出现少量空洞,30天时空洞化严重;带菌线虫接种5天后尚有少量松脂分泌,10天松脂分泌停止,30天后茎段产生空洞;对照松树松脂分泌正常,茎段横切面完整平滑。石蜡切片结果显示,2组线虫接种致萎蔫松树茎段的组织解剖结构均发生显著变化,皮层及木质部细胞、髓心细胞大多破碎变形,树脂道上皮细胞破碎解体。无菌松材线虫在松苗体内种群增殖速率高于带菌松材线虫,萎蔫松苗体内线虫数量分别为(8 105±5 661)条·g-1和(4 317±1 896)条·g-1,但二者差异不显著(P=0.361 9)。【结论】无菌松材线虫和带菌松材线虫接种均能使5年生马尾松苗发病,无菌化处理未使松材线虫失去对马尾松苗的致病性,松材线虫的致病性与其伴生细菌无关。     

钙浓度对马尾松幼苗生长和生理特征的影响

[目的]在不同供Ca2+水平下对马尾松幼苗生长及生理特性进行研究,以确定适宜马尾松生长的钙浓度,为马尾松人工林培育及合理施用钙肥提供参考。[方法]以半年生马尾松幼苗为试材,采用温室内砂培,研究不同供Ca2+水平(0.0、0.4、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol·L~(-1)(CK))对马尾松生长及生理指标的影响。[结果]不同供Ca2+水平处理5个月后,在Ca2+水平为1.0、2.0 mmol·L~(-1)时,马尾松幼苗的株高增量和地径增量较高,其中,2.0 mmol·L~(-1)Ca2+水平的株高增量和地径增量最高。马尾松幼苗对Ca2+水平适应能力强弱顺序为2.01.00.43.00.04.0 mmol·L~(-1)(CK)。在不同生长期内,随着供Ca2+水平的增加,马尾松针叶中ROS(O2-产生速率、H2O2浓度)、MDA含量、抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性、抗氧化物质(GSH、As A)含量、脯氨酸含量均先降低后增加,最小值均在1.0 mmol·L~(-1)或2.0 mmol·L~(-1)处理中;类胡萝卜素含量先增加后降低,其最高值均在2.0 mmol·L~(-1)处理中。马尾松幼苗的株高增量和地径增量与类胡萝卜素含量关系不明显,而与其他生理指标均呈显著负相关。[结论]马尾松幼苗适宜在1.0 2.0 mmol·L~(-1)Ca2+水平的环境中生长。在马尾松林地中,应对土壤有效钙含量进行测定,并结合植株的生长和生理特征进行综合评价后,科学合理施肥以提高生产力。     

松材线虫病树早期诊断的研究：Ⅱ松树品种,接种量及线虫来源对 …

１９９７－１９９８年用不同量的松材线虫接种黑松和马尾权,用３个来源的松材线虫接种马尾松,用松材线虫接种７种松种,接种后对松树的流胶情况定期进行观察。     

松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢的相关性

【目的】通过比较松材线虫CYP450基因和寄主萜烯类物质代谢的时间特异性,研究松材线虫解毒相关CYP450基因与寄主蒎烯类物质代谢之间的相关性,为该病致病机制的深入研究提供基础。【方法】松材线虫接种5年生马尾松后,通过实时定量PCR研究松材线虫CYP450基因和寄主萜烯合成酶基因表达模式,同时通过气相色谱法检测寄主松树主要萜烯类物质代谢规律。【结果】松材线虫接种5年生马尾松后,松树蒎烯合成酶基因分别在第6天和第21天上调表达,而寄主松树体内α-蒎烯和β-蒎烯也具有2个峰值,分别在第9天和第27天时含量最高。松材线虫CYP-33C9基因在第12天和第15天大量表达,CYP-33C4基因在接种后第21天表达量最高。【结论】松材线虫的入侵引起松树蒎烯合成酶基因上调表达,生物合成大量蒎烯类物质,松材线虫CYP450基因响应松树蒎烯类物质的大量积累而上调表达。因此,根据松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢在时间上的相关性,推测CYP450基因可能参与了松材线虫蒎烯类物质代谢过程,可能是松材线虫致病相关基因之一。     

马尾松不同种源氨基酸含量与抗松材线虫病的关系

在选出和验证抗病马尾松种源的基础上,研究了马尾松不同抗病性种源的树体内氨基酸含量的差异。结果表明,抗病种源在接种松材线虫前后均比较感种源含有较少的组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等９种游离氨基酸。它们与感病指数均呈正相关,这说明游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松材线虫病。１１种固态氨基酸的含量与感病指数有负相关性,说明其含量较高的种源具较强抗病性能。     

马尾松钙调素基因的克隆及响应松材线虫侵染的表达特征

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的严重病害,引起重大的经济和生态损失。钙调素(CaM)是真核生物中Ca2+主要传导蛋白,本研究采用RT-PCR方法,首次从马尾松中克隆获得CaM,命名为pmCaM,并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明:pmCaM完整的开放阅读框核苷酸序列为450bp,编码149个氨基酸的蛋白质;该蛋白含有4个EF-hand结构域,具有钙调素的典型特征,与其它植物的CaM蛋白均有较高同源性。实时荧光定量PCR分析显示:接种松材线虫后30 180 min时间段,马尾松苗根、茎、叶器官中的pmCaM均下调表达,但不同器官间显著下调表达的时间点存在差异;同时,不同器官pmCaM表达量变化均存在特异的随时间发展的波动特征,其中发现,根茎pmCaM在松材线虫接种45 min时均处于表达量高峰。本研究结果显示pmCaM表达响应了松材线虫侵染,揭示pmCaM可能参与了调控松材线虫-马尾松互作早期的钙信号响应。     

马尾松没种源氨基酸含量与抗松材线虫病的关系

在选出和验证抗病马尾松种源的基础上，研究了马尾松不同抗病性种源的树全内氨基酸含量的差异。结果表明，抗病种源在接种松材线虫前后均比较感种源含有较少的组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等９种游离氨基酸。它们与感病指数均呈正相比，这说明游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松材线虫病。１１种固态氨基酸的含量与感病指数有负相关性。说明其含量较高的种源具有较强抗病性能。     

马尾松抗松材线虫病的验证及黑松感病进程

对马尾松22个种源以及黑松和刚松4次接种松材线虫Barsaphelenchusxylophilus。马尾松、刚松无1株感病;黑松接种后40天感病率为20%,感病指数7.5,第257天感病株率100%,感病指数90.0,死亡率为33.3%。302天时极大部分频死状态,1年后全部死亡。     

接种用松材线虫分离种群的筛选

自2001年10月以来开展了“马尾松松材线虫抗性育种技术的开发”的项目工作，为选拔马尾松松材线虫抗性候补树，确保接种用的松材线虫虫源，对松材线虫分离种群的繁殖、致病力和增殖能力作了研究。对不同地区采取由松材线虫致死的19棵当年枯死木样品，用贝曼漏斗法从中分离出19个松材线虫分离种群，在25℃条件下，成功培养16个分离种群。在2a生黑松苗上进行接种，测定松材线虫的致病力。55d后在野外试验区的感病率为26．1％～97．6％，大棚试验区的感病率为84．4％～100％，野外与大棚内的加权平均感病率差20％以上，显示出松材线虫致病力由气温增高和土壤干燥而增强。分别对16个分离种群以相同的接种头数在PDA培养，其繁殖面积的快慢不同；以大量繁殖为目的，在同量的小麦培养基中以相同的接种量，各自的繁殖量也不同，每培养皿的繁殖量为98万～176万头。根据试验结果，选用致病力最强、繁殖力较强的广朱3B松材线虫分离种群作为接种用松材线虫的接种虫源。     

马尾松抗松材线虫病候选无性系的抗病性测定

为筛选抗松材线虫病强的马尾松无性系,以前期筛选获得的抗松材线虫病强的马尾松实生苗为接穗,使用湿地松作为砧木培育嫁接苗,开展无性系2次接种松材线虫抗病性测定。结果表明:使用湿地松作为砧木培育马尾松抗性无性系苗木,经过对马尾松无性系嫁接苗2次接种松材线虫测定,获得健全率较火炬松高的无性系。抗病性第1次、第2次测定的健全率超过火炬松的合格无性系分别为77.7%、66.2%,平均健全率分别为81.4%、94.5%,对照树种火炬松平均健全率分别为61.3%和82.1%,获得的无性系抗病性显著提高。为了减小误差,应该选用嫁接成活苗数量相对多的无性系间进行抗病性强弱次序评价。采用了10株以上无性系间抗病性强弱次序评价进行对照,减少了抗性强弱无性系两极分化,抗性能力中等的无性系相应增多,在选拔植株营建抗性种子园过程中应给予重视,尽量选择接种测定数量较多的高抗无性系。     

抗松材线虫病马尾松无性系种子园营建技术

松材线虫病是危害松属树种的毁灭性病害,危害严重、防治困难。安徽省从2001年开始从疫区和非疫区的马尾松林分中选择324株抗病优树以及部分广东、广西种源,通过嫁接繁殖和人工接种松材线虫的方法进行无性系抗病性测定。2011年利用筛选出的68个家系的89个高抗无性系营建了1.6 hm2抗松材线虫病马尾松无性系种子园。各家系成活率90.9%～100%,平均成活率93.6%。     

松材线虫病树早期诊断的研究 Ⅱ.松树品种、接种量及线虫来源对流胶法的影响

１９９７～１９９８年用不同量的松材线虫接种黑松和马尾松,用３个来源的松材线虫接种马尾松,用松材线虫接种７种松树,接种后对松树的流胶情况定期进行观察。结果表明,接种量小的,松树流胶异常出现得晚,全部供试松树流胶出现异常的时间长;用南京的松材线虫接种的松树和用其它来源松材线虫接种的松树相比较,其流胶异常出现得快,全部供试松树表现流胶异常的时间短;感病松树流胶异常出现后,很快全部供试松树均表现异常并死亡。中度感病松树流胶异常出现后,到全部供试松树流胶表现异常的时间长,部分死亡。抗病松树的全部供试植株表现流胶异常的时间长,而且流胶异常的等级低,无松树死亡。虽然各处理中流胶异常的时间不同,但９８％以上的供试松树在感染松材线虫后流胶均出现异常。这进一步证明了流胶法可作为松材线虫病树的早期诊断方法。冬季为清理病死树的最佳时期。     

松材线虫病的潜伏侵染及松墨天牛传播新途径

在南京用松材线虫接种 7种松树 ,于第 2a在无任何症状的松树的接种点上方 10cm处取样 ,分离线虫。结果表明松材线虫病的潜伏侵染现象比较普遍。在不同的松树品种上潜伏侵染现象有所差异。感病黑松和赤松很快死亡 ,只有在接种量小的情况下才有潜伏侵染现象发生。抗病性强的火炬松和湿地松感病后潜伏侵染现象比较普遍 ,并且样品中的线虫量也较高。而抗病性中等的马尾松和刚松感病后潜伏侵染现象的普遍性及样品中的线虫量均处于中等。短针松接种松材线虫后既不枯死 ,也无潜伏侵染现象。松墨天牛传播松材线虫的试验结果表明 ,未携带松材线虫的松墨天牛成虫在松材线虫病松枝上取食后 ,再到健康松枝上取食 ,有传播松材线虫的可能。这些结果表明在松材线虫病新病区清理病死木时 ,应采取早期诊断技术 ,把未表现症状的松树一起清除 ,以达到防治目的。     

抗松材线虫病马尾松种源化学成分与抗性机理研究(第Ⅲ报)——接种松材线虫引起抗性马尾松种源中性萜类含量变化关系的研究

通过气相色谱分析研究了高抗、中抗和敏感马尾松种源在接种松材线虫（PWN）后所引起的中性萜类（主要是倍半萜类）组分含量变化规律以及含量变化与种源抗性间相关性变化规律。结果表明，接种PWN使抗性马尾松种源中某些萜类组分如长叶烯等增多，而某些组分如反式石竹烯等减少；接种PWN使高抗种源中长叶烯与反式石竹烯含量比值先减小后增大，且超过接种前的水平，但是未改变种源的抗病特征；树木生长过程对种源抗性及本研究没有造成影响和干扰。