不同种源多穗柯主要生物活性成分与矿质元素含量变异分析

【目的】阐明多穗柯主要药用活性成分与矿质元素的种源遗传变异规律。【方法】对设置在江西省分宜县多穗柯全分布区的5个种源试验林植株叶部根皮苷、三叶苷、总黄酮、有机碳、氮、磷和钾元素含量进行测定、分析。【结果】不同种源多穗柯叶部根皮苷、三叶苷、总黄酮、有机碳、全氮、全磷含量差异均存在极显著差异(P <0.01)。不同种源根皮苷含量变异范围为16.03~64.35 mg·g-1,三叶苷含量变异范围分别为4.76~29.97 mg·g-1,根皮苷含量变异范围为61.59~81.05 mg·g-1,其中重庆北碚为根皮苷、有机碳、全磷和全氮含量高的种源,与其他种源相比根皮苷含量最高,四川米易三叶苷含量最高,江西分宜总黄酮含量最高。多穗柯根皮苷含量随日照时数增加呈显著降低趋势(P <0.05),三叶苷含量随无霜期增加呈显著降低趋势,总黄酮含量随经度增加呈极显著增加的趋势,随降水量增加呈显著增加的趋势;根皮苷与全氮含量呈极显著正相关关系,有机碳与全钾含量呈显著负相关关系;聚类分析表明,5个多穗柯种源可划分为2个类群,高根皮苷、高总黄酮、低三叶苷类群和低根皮苷、低总黄酮和高三叶苷类群。【结论】多穗柯根皮苷、三叶苷、总黄酮和主要矿质元素含量具明显种源变异,重庆北碚、四川米易和江西分宜的多穗柯为优良种源。     

野生多穗柯主要活性成分及其含量变化

为了充分利用野生多穗柯资源,并对其人工定向培育提供科学依据,采用高效液相色谱法(HPLC),对广西田林、巴马、德保和那坡产的野生多穗柯中含量高且具有重要生物活性的根皮苷和三叶苷等指标进行测定。高效液相色谱条件为乙腈-0.04%甲酸(28∶72)等度洗脱,流速0.8 m L/min,检测波长285 nm。结果表明,根皮苷和三叶苷含量的线性关系良好。广西产的野生多穗柯,同一植株上的嫩叶和老叶中2种活性成分的含量变化具有一定的规律性:从嫩叶到老叶,根皮苷含量增加,三叶苷含量却大幅度下降;三叶苷和根皮苷总含量较高的3株多穗柯样品分别为DB-26、TL-08和BM-03的嫩叶,其总含量分别为21.73%、21.21%和19.39%。     

刺五加过氧化氢酶基因的克隆与表达分析

为了深入了解过氧化氢酶(catalase,CAT)基因在刺五加抗逆反应及次生代谢中的作用,采用RACE技术克隆到刺五加CAT基因的cDNA全长序列,并通过RT-PCR法检测了CAT在刺五加不同生长发育时期和器官中的表达情况。刺五加CAT基因cDNA全长1 840 bp,开放阅读框长1 479 bp,编码492个氨基酸的蛋白。该蛋白包含CAT家族的标志性序列,定位于过氧化物酶体。刺五加CAT基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P0.05)。其中盛花期的表达量最高,是最低量果实基本成熟期的1.28倍;各器官中,叶柄的表达量最高,是茎最低量的1.48倍。     

慈竹木质素合成酶基因4CL RNAi载体构建与烟草转化

根据慈竹4-香豆酸辅酶A连接酶(Na4CL)全长cDNA序列,通过RT-PCR从慈竹幼笋cDNA中扩增约600 bp的保守片段。DNAMAN多重比对分析表明,该目标片段与3条烟草4CL基因同源性达84.08%。将目标片段插入到pSK-int中间表达载体中,获得pSK-4CL-RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pBI121中,构建该基因的shRNA表达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草(K326)。对获得的抗性再生植株的PCR检测分析初步表明该基因已插入烟草基因组中。     

刺五加鲨烯合酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

为了了解刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)的表达特点及其对刺五加中皂苷含量的影响情况,以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术,分析了SS基因在刺五加不同生长发育时期不同器官中的表达量及茉莉酸甲酯对其表达的影响情况;还利用SPSS 17.0软件分析了SS基因的表达量与刺五加中皂苷总含量的相关性。结果表明,在刺五加的整个生长期中,SS基因的表达量呈现出"低—高—低—高—低"的变化趋势:萌芽期(4月26日)该基因的表达量最低,而盛花期(6月26日)该基因的表达量最高,为萌芽期的3.11倍;SS基因在刺五加根中的表达量显著高于茎、叶和叶柄中的表达量(P<0.05),其在茎中的表达量最低,仅为根中表达量的51.88%。茉莉酸甲酯可提高SS基因的表达量,但其与对照组的差异未达到显著水平。刺五加中的皂苷总含量与SS基因的表达量间呈现出同升同降的变化趋势,存在极显著的正相关关系(P<0.01)。文中初步判定,鲨烯合酶是刺五加皂苷生物合成的关键酶。     

毛竹PeAP2基因及其启动子的克隆与表达初步分析

APETALA2(AP2)基因在植物生长发育过程中发挥着重要作用.利用RT-PCR和RACE方法,从毛竹中克隆到1个AP2同源基因的全长cDNA序列,命名为PeAP2.序列分析表明:PeAP2基因全长1 750 bp,其中,5′端非编码区106bp,3′端非编码区174 bp,开放阅读框1 470 bp,编码1个489 aa的蛋白,该蛋白含有2个AP2结构域,属于AP2/EREBP家族的AP2亚家族.PeAP2蛋白与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有着较高同源性,其中,与二穗短柄草的AP2蛋白同源性最高,达74.85％.实时定量PCR分析显示:PeAP2基因在毛竹的根、茎、叶、鞘和节5种器官中均有表达,其中,叶片中的表达丰度最高,鞘中次之,而在根、茎、节中的表达丰度接近,均较低.利用hiTAIL-PCR方法克隆获得了PeAP2上游启动子区序列1 359 bp,分析显示其含有光、激素等多种信号应答相关的作用元件.     

七彩虹竹4-香豆酸辅酶A连接酶基因(Ih4CL)的克隆及功能分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶,在上游调控木质素代谢、黄酮代谢。本研究根据转录组数据设计的1对特异引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法从七彩红竹1年生红秆中克隆到4-香豆酸辅酶A连接酶基因Ih4CL,该基因包含1 677bp完整的c DNA开放阅读框,编码558个氨基酸;生物信息学方法对Ih4CL编码的氨基酸蛋白序列进行的分析表明,Ih4CL与禾本科植物4CL蛋白具有较近的亲缘关系,其中与短花药野生稻的同源性达88%;荧光定量PCR检测结果显示Ih4CL基因在七彩红竹的嫩叶中的表达量明显低于茎秆中的表达量。     

银杏IspF基因的克隆与功能分析

采用RACE技术,从银杏中获得MEP途径中的第5个酶2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(IspF)基因的全长cDNA,命名为GbIspF(GenBank登录号:EF062579).该基因cDNA全长为897 bp,包含720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸残基的蛋白,在GbIspF的N-端有一个长为59个氨基酸残基的质体转运肽;序列多重比对表明GbIspF与其他植物IspF同源.利用半定量RT-PCR对GbIspF进行组织表达谱分析,结果表明GbIspF在银杏根、茎、叶、果中均有表达,但表达量差异较大,在叶中表达量最高,在根中表达量最低.功能互补分析表明GbIspF能推动工程菌XL1-Blue pTrcGbIspF pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbIspF具有典型的IspF基因功能.     

苹果属观赏海棠McDFR的克隆及不同叶色品种间的表达差异

以苹果属观赏海棠品种‘王族’叶片总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得1个1247bp的二氢黄酮醇-4-还原酶基因的cDNA序列,其基因编码区共1021bp,存在3个ORF,编码348个氨基酸,命名为McDFR。基因序列全长2396bp,有5个内含子,所有内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则。使用实时荧光定量PCR和紫外可见光分光光度计,对4种不同叶色类型的观赏海棠品种‘火焰’(绿色类叶片)、‘绚丽’(新叶有色类红色叶片)、‘高原之火’(新叶有色类红色叶片)和‘王族’(常色类紫色叶片)幼叶和功能叶中的McDFR表达及其花色苷和类黄酮的含量进行测定分析,结果表明:McDFR在4个品种的幼叶和功能叶中均有表达,McDFR表达量与花色苷积累有一定的相关性,McDFR在幼叶中表达量高于功能叶;在4个品种中,McDFR在‘高原之火’幼叶中表达量最大。幼叶中的类黄酮含量高于功能叶,McDFR表达量也大于功能叶。在功能叶中,除绿色叶品种‘火焰’外,类黄酮含量越高,McDFR的表达量越大,说明McDFR对苹果属观赏海棠叶片花色苷、类黄酮代谢途径及色泽形成具有重要作用。     

梅花花青素苷调控基因PmMYB1的分离及功能分析

【目的】花青素苷是梅花花色形成的重要色素,R2R3-MYB是花青素苷合成调控的关键转录因子。从梅花中分离出1个R2R3-MYB调控因子PmMYB1,通过分析其序列特征并转入烟草进行功能鉴定,为探明梅花花青素苷合成调控机理及今后梅花花色分子育种奠定基础。【方法】根据梅花基因组数据设计引物,采用RT-PCR方法从梅花花瓣中分离PmMYB1基因,利用DNAMAN软件预测氨基酸序列,通过多序列比对和系统进化树构建分析其保守序列并进行功能预测,通过构建表达载体将PmMYB1基因转入烟草,分析转基因烟草的表型及花青素苷含量的变化,并利用实时荧光定量RT-PCR技术测定该基因及烟草内源花青素苷合成通路基因在转基因植株不同器官中的表达量,综合分析以上数据鉴定PmMYB1基因的功能。【结果】从梅花中分离得到全长为729 bp具有完整编码区的PmMYB1基因序列,该序列编码242个氨基酸。序列分析表明该蛋白具有保守的MYB结构域及花青素苷调控MYB蛋白特征基序,并且含有与bHLH转录因子相互作用的保守基序,可能需要bHLH蛋白协同表达共同完成花青素苷的合成调控。多序列比对和进化分析结果显示PmMYB1与其他已鉴定功能的花青素苷调控MYB蛋白有很高的同源性,其中与樱桃李的PcMYB10和欧洲甜樱桃的PaMYB10一致性分别为92%和91%。转基因烟草试验表明过表达PmMYB1基因显著提高了转基因植株花冠中花青素苷的含量(P0.05),使其花冠颜色明显加深,实时荧光定量RT-PCR试验结果表明PmMYB1基因在转基因植株花中表达量高于叶中,过表达PmMYB1基因明显上调了烟草花中7个内源花青素苷合成通路结构基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3′H、NtDFR、NtANS、NtUFGT及2个调控基因NtAn1a和NtAn1b的表达量。【结论】在烟草中过表达PmMYB1基因能够显著上调转基因植株花中内源花青素苷合成通路结构基因和调控基因的表达,从而促进了其花中花青素苷的积累并导致花色加深,表明该基因在花青素苷合成过程中起重要调控作用。     

Full length cDNA cloning and expression analysis of annexinA2 gene from deer antler tissue

ANXA2（AnnexinA2）, a calcium-dependent phospholipid bind- ing protein, is involved in various Ca2＋-related biological activities. In the present study, full-length cDNA of ANXA2 was isolated from the velvet antler tip tissue of sika deer （Cervus nippon hortulomm）; the amino acid sequence and gene expression was analyzed by using bioinformatics and real-time reverse transcdptase polymerase chain reaction （RT-PCR） techniques. Nucleotide sequence analysis reveals that the full-length cDNA of the ANXA2 gene was 1372 bp, of which 1020 bp was in the opan-reading frame （OR.F） encoding 339 amino acids; its relative mo- lecular weight was 38.3 kDa; and isoelectrie point was 6.72. Sequence analysis indicates that the protein includes four conserved tan- dem-duplication ANX domains. The gene-aceession nucleotide sequence number in GenBank is JX315571. Expression analysis by RT-PCR re- veals that ANXA2 gene expression has a significant positive correlation with the antler-tissue mineralization process, indicating that this gene may play an important role in the regulation of antler-tissue mineraliza- tion.     

山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶 DXR基因的克隆和SNP分析

在转录组测序结果分析基础上,以山鸡椒cDNA 为模板,克隆得到山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR 基因cDNA 全长,以山鸡椒基因组DNA 为模板,设计引物、扩增拼接后获得山鸡椒DXR 基因全长,命名为LcDXR。序列分析表明,LcDXR cDNA 全长为1 501 bp,5'非编码区长34 bp,3'非编码区长53 bp,开放阅读框长1 413 bp,预测编码含有470个氨基酸残基的蛋白质,等电点为6.62,分子量为51.12 kD。LcDXR 基因全长为12 601 bp,其中外显子12 个,内含子11 个。对来自10个种源的LcDXR 基因编码区单核苷酸变异位点进行分析表明:在cDNA 区间内共发现10 个SNP(single nucleotide polymorphism)位点,其中有4 个单核苷酸变异导致了所编码的氨基酸的改变,为了分析氨基酸突变导致的蛋白质精细结构的变化,利用Swiss-PDB Viewer 模拟4 个突变位点氨基酸残基的替换。其中江西安远(AY)的突变Lys119Thr 引起了氢键的变化,推测可能对酶的活性产生影响。研究结果为深入研究山鸡椒脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶的活性和功能奠定了基础,同时为山鸡椒遗传育种提供理论依据。     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSUS1的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从毛白杨成熟木质部cDNA文库中分离出PtSUS1 cDNA全长,并进行了测序和序列分析。结果表明:克隆的毛白杨PtSUS1 cDNA片段总长为2703bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为2415bp,可编码长度为805个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtSUS1、水稻OsSUS1的蛋白质氨基酸序列同源性分别为83.4%,75.7%。组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtSUS1在成熟木质部表达丰度最高,在成熟叶片、根部和正在发育的木质部表达丰度中等,在韧皮部和形成层有少量表达,在嫩叶与顶端分生组织中表达丰度最低。在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtSUS1序列进行比对和分析,共检测到235个单核苷酸多态性(SNP)位点,SNP频率为1/25bp,多样性指数π为0.00924。在外显子区域,共检测到66个SNP位点,其中55个为同义突变,10个为错义突变,1个为无义突变。在编码区内,非同义突变与同义突变的比率<1,这一结果显示在毛白杨物种演化过程中,纯化选择是PtSUS1基因内同义SNP位...     

毛白杨纤维素合酶基因PtCesA_4的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

组合利用生物信息学和RT-PCR方法,首次从毛白杨未成熟木质部cDNA中分离出PtCesA4cDNA全长,并进行测序和序列分析,结果表明克隆的毛白杨PtCesA4 cDNA片段总长为3 757 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为3 129 bp,可编码长度为1 042个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥AtCesA4、水稻OsCesA,和火炬松PtCesA2的蛋白质氨基酸序列同源性分别为80.3%,78.9%和75.6%.组织特异性Realtime-PCR结果显示,PtCesA4基因在杨树根、茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PtCesA4在成熟叶片、未成熟木质部和成熟木质部中表达丰度最高,在根部和顶端分生组织表达丰度中等,在树皮和韧皮部有少量表达,在形成层中表达丰度最低.在此基础上,组合利用MEGA3.1和DnaSP4.50.4软件对毛白杨40株基因型个体的PtCesA4序列进行比对和分析,检测到153个单核苷酸多态性(sinsh nueleotide polymorphism,SNP)位点,SNP频率为1/35 bp,多样性指数π/0.005 02.其中51个是常见SNPs,102个为罕见SNPs.在这些SNPs中,有118个属于转换,35个属于颠换.在外显子区域,共检测到69个SNP位点,其中59个为同义突变,10个为错义突变.对PtCesA4基因内SNPs进行的连锁不平衡分析结果显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部迅速衰退,因此,在毛白杨中,基于PtCesA4基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的.也是不必要的.研究结果为毛白杨PtCesA4基因的连锁不平衡作图及其基因辅助毛白杨木材纤维性状的分子育种提供了理论依据.     

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。     

Cloning of <Emphasis Type="Italic">XET</Emphasis> gene from <Emphasis Type="Italic">Anthocephalus chinensis</Emphasis> and its plant expression vector construction

A full-length cDNA sequence of xyloglucan endotransglycosylase gene (XET), abundantly expressed in the cambium of Anthocepha-lus chinensis was cloned by conserved PCR, rapid-amplification of cDNA ends and by chromosome walking. Analytical results of the DNA sequence show that a 912 bp complete open reading frame (ORF) encoded a 303-amino acid protein was in the 1205 bp full cDNA sequence. The deduced amino acid sequence of AcXET, which contained the conserved specific EIDFE catalytic site sequence to XETs was homologous to the other known XET proteins. In order to study the gene function of AcXET and obtain transgenic plants, a plant expression vector pBIAcXET was constructed by recombinating the AcXET fragment from the cloning vector pMD19AcXET and the binary vector pBI121 between the XbaI and SmaI sites. The fragment of AcXET gene was inserted between the CaMV 35S promotor and the coding region of the GUS gene in pBI121. The identification results show that the plant expression binary vector pBIAcXET was constructed successfully. These results lay the foundation for studying the molecular mechanism of AcXET gene during wood formation.     

油桐生物素羧基载体蛋白编码基因VfBCCP的克隆与表达分析

油桐(Vernicia fordii)属于大戟科(Euphorbiaceae)油桐属植物,原产于我国,是世界上著名的木本工业油料树种.其种子榨出的桐油是品质最好的天然干性油之一.桐油具有干燥快、抗酸碱、耐冷热、防腐蚀等特性,作为重要的工业用油广泛应用于制造涂料、高级油墨、增塑剂、医药以及化学试剂等行业(黄挺,2001;Brown et al.,2005).同时油桐作为生物柴油原料树种具有良好的应用前景(钱能志等,2007;Shang et al.,2010;Chen et al.,2010).在油桐种子生长发育过程中,7月为桐油的缓慢形成期,7月底到9月初为桐油的迅速累积期,而9月初至10月中旬为桐油累积完成期(王汉涛等,1985).     

油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE、交错PCR等技术,获得了油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长cDNA克隆。该基因cDNA序列全长1 901 bp,含有一个1 599 bp的ORF,编码533个氨基酸残基。BC蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58 509.3 u,含两个跨膜结构域,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中发现12个α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构。该基因已登录到GenBank,并被命名为co-bc。     

Cloning and analysis of a new 4CL-like gene in Populus tomentosa

The phenylpropanoid enzyme 4-coumarate: coenzyme A ligase (4CL), plays a key role in general phenylpropanoid metabolism. Our investigation involves a new 4CL-like gene cloned from Populus tomentosa. This new 4CL-like gene is 1,692 bp and encodes a protein of 552 aa. After analysis of its domain, we found a highly conserved region of a 4CL gene family in this 4CL-like gene. Based on our results, we believe that this gene belongs to the family of 4CL. A recombinant vector, referred to as pET30a-4CL-like, was constructed by connecting this 4CL-like gene fragment to pET30a. After inducing it with IPTG for 3 h, the 4CL-like protein was purified by a Ni-NTA method. This 4CL-like protein has a calculated molecular weight of 60 kDa by SDS-PAGE.