CODEHOP在线简并引物设计与杉木4CL基因片段克隆

利用CODEHOP设计4CL酶的简并引物,利用设计的3对简并引物进行RT—PCR,从杉木幼茎中克隆到2个长度分别为502bp和536bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过Blastx检索与Genbank进行同源性比对后,发现2片段都与其它植物的4-CL基因具有较高的氨基酸序列同源性。研究表明,该程序设计的简并引物可信性强,阳性率高。该基因的成功克隆将为研究杉木木质素的合成提供科学依据。     

慈竹木质素合成酶基因4CL RNAi载体构建与烟草转化

根据慈竹4-香豆酸辅酶A连接酶(Na4CL)全长cDNA序列,通过RT-PCR从慈竹幼笋cDNA中扩增约600 bp的保守片段。DNAMAN多重比对分析表明,该目标片段与3条烟草4CL基因同源性达84.08%。将目标片段插入到pSK-int中间表达载体中,获得pSK-4CL-RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pBI121中,构建该基因的shRNA表达载体,并利用农杆菌介导法转化烟草(K326)。对获得的抗性再生植株的PCR检测分析初步表明该基因已插入烟草基因组中。     

cDNA末端扩增技术的研究进展

cDNA末端扩增技术是一种以PCR反应为基础,快速获得已知cDNA序列3′端和5′端的方法,是克隆全长cDNA序列的主要手段之一。本文从RACE原理出发,对RACE技术3个关键步骤(反转录、TdT加尾、PCR扩增)的优化和改良措施进行了透彻分析,并详细阐述RACE的最新研究进展———“电子”cDNA克隆。     

多穗柯4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆和表达分析

为了克隆多穗柯4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate-CoAligase,4CL)基因,了解其表达情况,从而为深入研究4CL基因分子功能及黄酮类化合物生物合成奠定基础,依据多穗柯转录组测序结果,设计特异性引物,PCR扩增得到4CL基因cDNA全长序列,利用相关软件进行生物信息学分析;采用qRT-PCR法检测4CL基因在不同器官中的表达情况,使用SPSS18.0软件分析其表达量与根皮苷含量间的关系。结果表明:多穗柯4CL基因cDNA全长1704bp,包含长1629bp的开放阅读框,编码含542个氨基酸的蛋白质。该蛋白定位于细胞质中,属亲水性蛋白。多穗柯4CL基因在除根以外的各个器官中均有表达,且表达量与根皮苷含量间呈极显著的正相关关系(P<0.01)。     

金桂芳樟醇合成酶基因的克隆与序列分析(英文)

以金桂的花器官为试材,设计芳樟醇合成酶基因简并引物,通过逆转录PCR、快速扩增cDNA末端技术和Blastn分析等,获得金桂芳樟醇合成酶基因的全长cDNA序列,命名为OfLis(Osmanthus frangrans vat.thunbergii linaiool synthase,GenBank登录号FJ645727).OfLis,基因全长cDNA长度为2 003 bp,包含1个1 731 bp的开放阅读框,编码576个氨基酸.序列分析表明:OFLis具有单萜烯类合成酶基因典型的保守结构域,即DDXXD和(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE;具有多数单萜烯类合成酶活性必需的RR(X)8W功能基团.OfLis推导氨基酸序列的预测分子质量和等电点分别为67.29 ku和5.26;疏水性分析结果表明其大部分氨基酸区域为亲水结构.氨基酸水平上,OfLis与薰衣草芳樟醇合成酶基因的相似性最高,为63.6%,与山字草芳樟醇合成酶基因的相似性最低,为19.0%.逆转录PCR结果表明:整个花期内OfLis基因在花瓣、雌蕊和雄蕊中均有表达,而在萼片和叶片中不表达.研究结果为香味植物的育种、品种改良及香味成分的调控提供理论基础.     

美洲黑杨木质素合成关键基因的克隆及反义表达载体的构建

以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。经质粒PCR和双酶切分析,确定获得了pBI—4CLp—a4CL—aCAD反义植物表达载体。     

木聚糖酶基因xynⅠ的克隆和序列分析

以宇佐美曲霉E001总RNA为模板,采用RT- PCR等技术扩增了木聚糖酶基因(xyn I)的cDNA全序列(GenBank登录号DQ302412).该cDNA全长 881 bp,其中5′和3′端非编码区分别为97和 106 bp,信号肽编码区 111 bp,成熟肽编码区 567 bp 编码188个氨基酸组成的木聚糖酶Xyn I.以E001基因组DNA为模板,采用单侧PCR等技术扩增了xyn I的DNA全序列(GenBank登录号DQ302413).该DNA全长 1 098 bp,含启动子序列、内含子和外显子等核苷酸序列.将xyn I cDNA所推导的Xyn I一级结构与GenBank中报道的其它相关序列进行了同源性比较.结果表明,E001 Xyn I是一种新的木聚糖酶,且具有第G/11家族木聚糖酶的共同特征.     

浅黄根须腹菌γ-actin基因的克隆及表达分析

以油松的优良外生菌根真菌即浅黄根须腹菌为对象,用简并 PCR 法和 RACE 技术分离其γ－肌动蛋白基因( Rl-act)的全长 cDNA序列。该全长序列为1339 bp,包含一个1128 bp 的开放阅读框( ORF),编码375个氨基酸,5'端非翻译区(5'UTR)95 bp,3'UTR长度116 bp。Port Param 软件在线分析结果表明,该cDNA所编码的蛋白质理论等电点为5.01,相对分子质量为94.929 kD,具有真菌γ-actin 基因3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明,Rl-act序列与12种担子菌 actin 序列同源性均在97%以上,与同为外生菌根真菌的双色蜡蘑actin的亲缘关系最近。Rl-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致,验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

七彩虹竹4-香豆酸辅酶A连接酶基因(Ih4CL)的克隆及功能分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶,在上游调控木质素代谢、黄酮代谢。本研究根据转录组数据设计的1对特异引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法从七彩红竹1年生红秆中克隆到4-香豆酸辅酶A连接酶基因Ih4CL,该基因包含1 677bp完整的c DNA开放阅读框,编码558个氨基酸;生物信息学方法对Ih4CL编码的氨基酸蛋白序列进行的分析表明,Ih4CL与禾本科植物4CL蛋白具有较近的亲缘关系,其中与短花药野生稻的同源性达88%;荧光定量PCR检测结果显示Ih4CL基因在七彩红竹的嫩叶中的表达量明显低于茎秆中的表达量。     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

Cloning of vacuolar H<Superscript>+</Superscript>-ATPase subunit c genes from Japanese iris,and functional characterization in yeast

Five different isoforms (IrlVHA-c1-c5) of V-ATPase subunit c (VHA-c) were cloned from a Japanese iris (Iris lactea Pall. var. chinensis Fisch. Koidz) cDNA library using degenerate primers PCR and the 5'-RACE technique. The sequence analysis showed the open reading frame (ORF) of the IrlVHA-c1 c5 to be 495 bp, corresponding to a protein of 164 amino acids. Among the five isoforms, IrlVHA-c1 and IrlVHA-c2 are completely homologous. The IrlVHA-c protein is localized at the vacuolar membrane as indicated by a g...     

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株全基因组序列

油桐尺蛾核型多角体病毒广西株基因组序列由Sanger测序的方法得到。拼接后获得了121 268 bp序列,GC含量为36.76%。以长度不小于50 aa的序列认定为功能基因,共预测到131个开放阅读框,通过Blast比对,其中87个能注释到功能基因。对基因组序列进重复序列分析,共发现SSR位点174个,同源重复序列1个。在SSR位点中,包含6种长度的重复基序,且以富含AT的重复基序为主。同源重复序列两端为一59 bp片段或其一部分组成的重复序列,两端分别重复12次和7次,中间则为一段与重复片段无关的236 bp片段。与武汉株相比,广西株病毒在37个核心基因中有4个存在蛋白序列长度上的差异,而在其他非核心基因中有6个基因仅存在于一个病毒株中,另有13个基因存在蛋白序列长度上的差异。     

油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE、交错PCR等技术,获得了油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长cDNA克隆。该基因cDNA序列全长1 901 bp,含有一个1 599 bp的ORF,编码533个氨基酸残基。BC蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58 509.3 u,含两个跨膜结构域,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中发现12个α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构。该基因已登录到GenBank,并被命名为co-bc。     

山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶 DXR基因的克隆和SNP分析

在转录组测序结果分析基础上,以山鸡椒cDNA 为模板,克隆得到山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR 基因cDNA 全长,以山鸡椒基因组DNA 为模板,设计引物、扩增拼接后获得山鸡椒DXR 基因全长,命名为LcDXR。序列分析表明,LcDXR cDNA 全长为1 501 bp,5'非编码区长34 bp,3'非编码区长53 bp,开放阅读框长1 413 bp,预测编码含有470个氨基酸残基的蛋白质,等电点为6.62,分子量为51.12 kD。LcDXR 基因全长为12 601 bp,其中外显子12 个,内含子11 个。对来自10个种源的LcDXR 基因编码区单核苷酸变异位点进行分析表明:在cDNA 区间内共发现10 个SNP(single nucleotide polymorphism)位点,其中有4 个单核苷酸变异导致了所编码的氨基酸的改变,为了分析氨基酸突变导致的蛋白质精细结构的变化,利用Swiss-PDB Viewer 模拟4 个突变位点氨基酸残基的替换。其中江西安远(AY)的突变Lys119Thr 引起了氢键的变化,推测可能对酶的活性产生影响。研究结果为深入研究山鸡椒脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶的活性和功能奠定了基础,同时为山鸡椒遗传育种提供理论依据。     

Cloning of <Emphasis Type="Italic">XET</Emphasis> gene from <Emphasis Type="Italic">Anthocephalus chinensis</Emphasis> and its plant expression vector construction

A full-length cDNA sequence of xyloglucan endotransglycosylase gene (XET), abundantly expressed in the cambium of Anthocepha-lus chinensis was cloned by conserved PCR, rapid-amplification of cDNA ends and by chromosome walking. Analytical results of the DNA sequence show that a 912 bp complete open reading frame (ORF) encoded a 303-amino acid protein was in the 1205 bp full cDNA sequence. The deduced amino acid sequence of AcXET, which contained the conserved specific EIDFE catalytic site sequence to XETs was homologous to the other known XET proteins. In order to study the gene function of AcXET and obtain transgenic plants, a plant expression vector pBIAcXET was constructed by recombinating the AcXET fragment from the cloning vector pMD19AcXET and the binary vector pBI121 between the XbaI and SmaI sites. The fragment of AcXET gene was inserted between the CaMV 35S promotor and the coding region of the GUS gene in pBI121. The identification results show that the plant expression binary vector pBIAcXET was constructed successfully. These results lay the foundation for studying the molecular mechanism of AcXET gene during wood formation.     

Identification of early-flower-related ESTs in an early-flowering mutant of trifoliate orange (Poncirus trifoliata) by suppression subtractive hybridization and macroarray analysis

To increase our understanding of the genes involved in flower development in citrus, we identified genes differentially expressed between juveniles and adults of an early-flowering mutant of trifoliate orange (precocious trifoliate orange, Poncirus trifoliata L. Raf.) by suppressive subtractive hybridization (SSH) and macroarray hybridization analyses. Based on dot blot analysis, we confirmed that the juvenile subtracted cDNA library comprised genes upregulated during floral induction, inflorescence development and flowering. A total of 190 nonredundant expressed sequence tags were identified that were related flower development. The temporal and spatial expression patterns of four SSH-enriched genes were studied in adult precocious trifoliate orange by real-time PCR. Among these differentially expressed genes, the expression pattern of C5-B16 was closely correlated with inflorescence development and flowering. The full-length cDNA of C5-B16 was isolated by 5' and 3' rapid amplification of cDNA ends. Sequence analysis indicated that C5-B16 is a novel gene in citrus.