嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育

[目的]确定嗜热蛋白酶生产菌DPE7的系统发育地位。[方法]通过PCR方法扩增出嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因片段,并对其进行了克隆和测序。[结果]对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,相似性高于99%的序列中大部分是泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列,其中与Geobacillus toebii T1680的16 S rRNA基因序列相似性达99.60%。对菌株DPE7和其他13株泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列进行系统发育分析,菌株DPE7与其中的4株泥土芽胞杆菌聚类在一起。[结论]经16 S rRNA基因序列同源性比较和系统发育分析,确定菌株DPE7为泥土芽胞杆菌。     

产N-羟基异戊巴比妥的芽胞杆菌筛选

采用液相-四级杆飞行时间质谱的方法筛选产N-羟基异戊巴比妥(N-Hydroxy Amobarbital)的芽胞杆菌菌株。通过分析73株芽胞杆菌菌株发酵液中胞外化合物成分,筛选出合成N-Hydroxy Amobarbital的4株芽胞杆菌,为栗褐芽胞杆菌Bacillus plakortidis(FJAT-8757)、内生芽胞杆菌Bacillus endophyticus(FJAT-10010)、米氏解硫胺素芽胞杆菌Aneurinibacillus migulanus(FJAT-14205)和休闲地芽胞杆菌Bacillus novalis(FJAT-14227),该成分在发酵液中的相对含量分别为6.04%、4.85%、1.61%和1.61%,ATPA与色谱库检索得分(Score)分别为96.25、94.33、96.72和94.91。     

一株产蛋白酶地衣芽孢杆菌的分离与鉴定

[目的]对产蛋白酶的地衣芽孢杆菌进行分离与鉴定。[方法]从饲料样品中筛选出产蛋白酶的菌株,对其进行形态和生理生化特征鉴定,并构建该菌株的16S rDNA系统发育树。[结果]分离到的菌株GW201205与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的生理生化特征相同,且其16S rDNA序列与B.licheniformis相似性最高。[结论]可将试验分离到的菌株GW201205初步鉴定为B.licheniformis。     

产羟基喹啉基乙酮芽胞杆菌的筛选与分析

芽胞杆菌是一类重要的生防微生物,能产生多样的抗菌物质。为了挖掘产喹啉类抑菌物质的菌株资源,以56个芽胞杆菌菌株为试验材料,运用液相色谱-四级杆飞行时间质谱(LC-QTOF-MS)技术对其发酵产物进行检测,对质谱数据进行分子特征提取和Metlin谱库比对。结果表明:筛选获得6株产羟基喹啉基乙酮(Quinacetol)的芽胞杆菌,分别是土壤芽胞杆菌FJAT-14232 (Bacillus soli)、枯草芽胞杆菌FJAT-8784 (Bacillus subtilis)、波茨坦短芽胞杆菌FJAT-10006 (Brevibacillus borstelensis)、浸麻类芽胞杆菌FJAT-14204 (Paenibacillus macerans)、嗜碱芽胞杆菌FJAT-10014 (Bacillus alcalophilus)和米氏解硫胺素芽胞杆菌FJAT-14205(Aneurinibacillus migulanus)。6株芽胞杆菌中的羟基喹啉基乙酮占各自总代谢物的相对含量均高于1.17%,且与Metlin谱库匹配得分均大于95.35。其中,土壤芽胞杆菌FJAT-14232(Bacillus soli)中的羟基喹啉基乙酮相对含量最高,占其总代谢物相对含量的1.68%。嗜碱芽胞杆菌FJAT-10014 (Bacillus alcalophilus)的谱库检索得分最高,为99.13。本研究为微生物来源的喹啉类抑菌剂的开发与利用提供菌种资源和数据支持。     

一株脂肪酶产生菌的筛选鉴定及其酶学性质研究

分离筛选脂肪酶高产菌株,为生物降解富含油脂的工业及生活污水提供菌种资源.从校园食堂附近土壤中分离微生物,结合中性红油脂平板筛选法与三丁酸甘油酯平板透明圈法筛选脂肪酶高产菌株.根据菌株形态特征、生理生化特性以及分子生物学特征鉴定高产菌株,进而利用酸碱滴定法定量测定脂肪酶酶活,探究该菌株产生脂肪酶的最适酶促反应温度、pH值等酶学性质.研究结果表明,筛选获得的脂肪酶产生菌SLB-1为革兰氏阳性芽孢杆菌;硝酸盐还原呈阳性,能够水解淀粉和液化明胶;基于16SrDNA的系统发育分析结果表明SLB-1菌株与登录号为NR116240甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)处于同一最小分支,故将SLB-1菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,命名为B.methylotrophicus SLB-1,该菌株产脂肪酶的最适培养时间是24h,酶促反应的最适温度为30℃,最适pH值为7.0.本研究分离鉴定了脂肪酶产生菌Bacillus methylotrophicus SLB-1,且由该菌所产生的脂肪酶为中性常温酶.     

一株香蕉枯萎病生防解淀粉芽胞杆菌的分离、鉴定及其拮抗物质研究

以致病力存在分化的香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)菌株群为靶标,从发病香蕉园香蕉根际土壤中分离获得一株芽胞杆菌R21g9,平板抑菌能力测定结果显示,R21g9不仅对香蕉枯萎病菌的不同菌株具有较强的抑制能力,还对西瓜枯萎病病原菌(F.oxysporum f.sp.niveum)、芒果蒂腐病病原菌(Botryodiplodia theobromae Pat)和新月弯孢霉(Curvularia lunata)等植物病原真菌有较强的抑制作用.利用生理生化和分子生物学方法对该菌开展鉴定研究,API系统将该菌鉴定为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis);利用16S rDNA序列开展的系统发育分析仅能确定该菌为枯草芽胞杆菌组成员,不能鉴定到种;利用gyrB基因序列开展的系统发育分析将R21g9鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).拮抗机制研究结果显示,R21g9对真菌的作用方式为抑菌,抑菌物质存在于发酵上清中,可以被10％～90％的硫酸铵沉淀.对硫酸铵沉淀的粗提物进行抑菌活性检测发现40％、50％、60％、70％和80％饱和度硫酸铵沉淀物具有强的抗菌活性,主要拮抗物质可以被50％饱和度硫酸铵盐沉淀,此沉淀物的抑菌率最高,可以达到95.65％.     

产芽孢乳酸菌Lsp-1的抗逆性及产酸产消化酶能力分析

[目的]本研究考察嗜酸乳杆菌(L.a)和地衣芽孢杆菌(B.lich)的融合子产芽孢乳酸菌Lsp-1的抗逆性、产乳酸能力和产消化酶的能力。[方法]通过对Lsp-1和其亲本菌株L.a、B.lich的耐酸耐胆盐能力、产乳酸、产消化酶(蛋白酶、淀粉酶)、产丁二酮能力以及胆固醇清除能力的对比,比较Lsp-1与两亲本菌株的差异。[结果]在pH 2.0或含0.3%胆盐的MRS培养基中培养2.5 h后,Lsp-1的活菌数比亲本菌株L.a和B.lich高10～100倍。B.lich不产乳酸,Lsp-1的产乳酸量48 h后与L.a基本相同。各菌株产胞外中性蛋白酶能力B.lich(8.84 U·mg~(-1))>Lsp-1(5.54 U·mg~(-1))>L.a(4.59 U·mg~(-1));产胞外酸性蛋白酶能力B.lich(4.74 U·mg~(-1))>Lsp-1(3.30 U·mg~(-1))>L.a(2.54 U·mg~(-1));产淀粉酶能力(透明圈直径/菌落直径)B.lich(5.03)>Lsp-1(2.70)>L.a(2.32);产丁二酮能力L.a(10.25μg·mg~(-1))>Lsp-1(8.21μg·mg~(-1)),B.lich没有检测到;胆固醇清除能力Lsp-1(19.7%)显著高于两亲本菌株。[结论]Lsp-1抗逆性提高增强了其肠道存活率和定植能力,融合子遗传了L.a的高产酸能力和B.lich的高产消化酶能力,为其抑制病原菌生长和提高肠道吸收率等提供了保障。     

蜡状芽胞杆菌群16S rDNA分析

蜡状芽胞杆菌群主要包括炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis).GenBank已有这个群的8个菌株完成了全基因组序列测定.对这8株蜡状芽胞杆菌群菌株中98条16S rDNA的序列进行相互BLAST比较,发现在同一基因组内各个16S rDNA拷贝全局相似度最低为96.47%,在不同基因组间16S rDNA局部片段比对最小相似度达到99.72%,对应片段长度也有1417 bp.这点充分说明,该群的细菌完全共用同一种16S rDNA,根据16S rDNA给细菌分类的特点,它们应该属于同一个种.在亲缘关系上,枯草芽胞杆菌离蜡状芽胞杆菌群最近.     

黄曲霉毒素B1高效降解菌株的筛选鉴定及其降解

以香豆素为唯一碳源,利用微生物去毒法,初步筛选出32株生长良好的活性菌株,再添加AFB1标准品(菌液毒素终质量浓度2.5μg/m L),通过高效液相色谱(HPLC)检测AFB1降解率,结果显示,从鸡粪中分离并命名为F6的菌株高效降解黄曲霉毒素B1,降解率达83%。对菌株F6进行细胞形态及生理生化特性鉴定,初步判断为芽胞杆菌属,16S rRNA序列同源性比对分析,与蔬菜芽胞杆菌国际标准株ATCC700005(登录号NR043325.1)核苷酸同源性为99.3%,由此可确定,F6菌株为蔬菜芽胞杆菌,命名为Bacillus oleronius GX01(登录号KP297896)。分离菌株F6发酵液各组分,检测得上清液AFB1降解率达83%,而菌悬液、胞内液的AFB1分别仅为22.8%、17.4%,初步鉴定其降解活性成分可能为胞外酶。     

产挥发性物质芽胞杆菌对枇杷炭疽病菌的抑制作用及其鉴定

采用二分隔特殊平板研究芽胞杆菌挥发性物质对枇杷炭疽病菌Colletotrichum acutatum的抑制作用。研究结果表明,筛选得到的8株芽胞杆菌菌株中,抑菌效果最好的菌株为FJA T-4748,抑菌率达90.06％;其次为FJAT-10011,抑菌率达54.99％。经16S rDNA序列鉴定结合菌落形态观察,确认这8株芽胞杆菌分别为解木糖赖氨酸芽胞杆菌 Lysinibacillus xylanilyticus、波茨坦短芽胞杆菌 Brevibacillus borstelensis、短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis、土壤短芽胞杆菌 Brevibacillus agri、阿氏芽胞杆菌 Bacillus aryabhattai、美丽短芽胞杆菌Brevibacillus formosus及简单芽胞杆菌Bacillus simplex。本研究筛选的产挥发性物质芽胞杆菌菌株可为枇杷采后炭疽病的生物防治提供菌株参考。     

一株中度嗜盐菌新种LYG2#的分离与鉴定

[目的]对一株从连云港青口卤水中分离纯化出的细菌LYG2#进行分类学鉴定。[方法]通过16S rRNA基因序列比对、系统发育分析和一系列生理生化指标测定对该细菌LYG2#进行鉴定。[结果]该菌为革兰氏阴性菌,菌落形态为圆形,粉红色。电镜下观察菌体为螺旋状,长1.50~2.00μm,宽0.24μm。LYG2#最适生长盐浓度为9.6%,最适生长温度为32℃,最适pH为8.5。通过16S rRNA基因序列比对,发现其与Spiribacter salinus M19-40~T的相似度最高,为95.98%。菌株LYG2#在中国科学院的保藏号为CGMCC 1.12136,Gen Bank序列登录号为JQ087462。[结论]分离的菌株LYG2#为一株中度嗜盐菌,是Spiribacter属的一个新种资源。     

斑点叉尾鮰烂鳃病病原柱状黄杆菌的分离及鉴定

[目的]对从斑点叉尾鮰烂鳃病中分离的病原菌进行分类学地位鉴定。[方法]采用人工感染确定其病原性,常规生理生化鉴定和16SrRNA基因序列分析方法进行分析。[结果]该菌株为革兰氏阴性杆菌,滑行运动,无鞭毛,菌体大小为(0.3～0.5)μm×(5～10)μm,过氧化氢酶反应阳性,不能发酵和利用葡萄糖等多糖,不水解酪氨酸,不产生吲哚。所测16SrRNA基因序列经BLAST分析表明,与GeneBank上登录的柱状黄杆菌的16SrRNA序列同源性最高,其相似性达98.2%。基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树表明,菌株GHS061212与柱状黄杆菌(AY841899)聚为1个分支,且置信度较高,为71.0%。[结论]菌株GHS061212被鉴定为柱状黄杆菌,这是国内首次报道斑点叉尾鮰烂鳃病病原为柱状黄杆菌。     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定

[目的]鉴定1株高产甘露聚糖酶菌株。[方法]以高产甘露聚糖酶的菌株为对象,采用形态观察、生理生化试验及16S rDNA系统发育分析手段对其进行鉴定。[结果]该菌株在牛肉膏蛋白培养基上培养24h后,菌落表面粗糙,不透明白色,革兰氏阳性,杆状,能形成芽孢,表明其属于芽孢杆菌属。对F1-5进行生理生化特征鉴定,结果表明,其为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。PCR扩增获取该菌的16S rDNA基因。经BLAST同源序列比对,结果显示,菌株F1-516SrDNA与枯草芽孢杆菌的16S rDNA具有99％的同源性,表明F1-5为枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为甘露聚糖酶工业化开发应用奠定了基础。     

一株产抗霉菌活性物质的海洋细菌鉴定

[目的]为了研究柄海鞘体内的微生物能否产生具有抗菌功能的活性物质。[方法]从烟台海域的柄海鞘中筛选到一株细菌,命名为N2。采用透明圈法进行抑菌试验,同时进行菌落形态、常规生理生化研究和细菌鉴定系统测试。为了进一步确定菌株N2的分类学地位,测定其16S rRNA基因序列,与相关细菌种属相应序列的同源性进行比较,并构建系统发育树。[结果]菌株N2具有抑制霉菌生长的特性;菌株N2属于革兰氏阳性菌,杆状,具有鞭毛,菌落呈乳白色,菌株N2与Bacillus属细菌的特征相似;菌株N2与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最近,相似性达99%。[结论]菌株N2可鉴定为枯草芽孢杆菌,可以将其作为潜在的海洋有益菌应用于抗肿瘤和植物病害的防治。     

解钾芽孢杆菌的分离·鉴定及其代谢产物分析

[目的]分离与鉴定具有解钾能力的芽孢杆菌,并对筛选出的细菌进行代谢产物分析。[方法]从土壤中分离得到1株具有解钾能力且有一定抗逆性的菌株YJ09,对其进行生理生化性质研究、16S rRNA序列分析,并考察解钾菌培养液中的组分及各组分对钾长石的分解作用。[结果]菌株YJ09为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）;解钾菌培养液中含有0.54g/L的有机酸、0.413 mg/L的氨基酸和2.80 g/L的多糖,起解钾作用的主要是多糖。[结论]该研究为具有解钾能力的地衣芽孢杆菌在微生物肥料中的应用提供了理论依据。     

山药内生菌的分离及菌种鉴定研究

[目的和方法]分别采用5种培养基对山药根根中的内生菌进行分离,得到了10株内生菌,通过形态学分析其为4种微生物,16S rRNA比对分析确定其分属为欧文氏菌属(Erwinia)和芽孢杆菌属(Bacillus),未发现放线菌和真菌.[结果]表明山药内生菌极为单调.其中,能在山药浸出液培养基中大量产生多糖的菌株SS2的16S rRNA与模式菌株Erwinia pyrifoliae Ep1/96~T 最大同源性为97.1;.[结论]极有可能为新种.     

高产胞外多糖海洋芽孢杆菌分离鉴定及其多糖抗肿瘤活性分析

【目的】明确广西北部湾海洋细菌胞外多糖（EPS）独特的抗肿瘤等生物学活性,为北部湾海域细菌EPS活性研究及开发利用提供参考依据。【方法】采集广西钦州茅尾海红树林浅层土壤样品,使用LB-苯胺蓝培养基及苯酚—硫酸法筛选EPS高产海洋细菌,基于16S rRNA序列进行菌株鉴定;通过高效凝胶渗透色谱和红外光谱测定EPS的分子量及其结构,最后使用噻唑蓝（MTT）法测定EPS对Vero细胞的毒性及抑制HeLa细胞增殖的效果。【结果】筛选出1株EPS产量为0.2917 mg/mL的菌株,命名为QLc-04,在LB-苯胺蓝固体培养基上生长形成的菌落呈白色,不透明,中央略微隆起,表面粗糙,为革兰氏阳性杆菌。QLc-04与芽孢杆菌属（Bacillus）菌株的16S rRNA序列相似性在99.45%~99.82%,其中与B. thuringiensis BT62（CP044978）的相似度最高（99.82%）,与B.cereus ATCC 14579T（AE016877）和B.mycoides DSM 2048T（ACMU01000002）相似性均为99.81%;在基于16S rRNA序列相似性构建的系统发育进化树上,QLc-04与芽孢杆菌属聚类为同一分支,因此确定QLc-04为芽孢杆菌属。QLc-04-EPS分子量约179.9 kD,属于具有吡喃型结构的多糖;QLc-04-EPS对Vero细胞无直接毒性,在10~300 μg/mL浓度范围内Vero细胞随QLc-04-EPS浓度的增加其增殖能力不断升高,但QLc-04-EPS浓度超过50 μg/mL时对HeLa细胞增殖的抑制作用显著增强（P<0.05）。【结论】海洋芽孢杆菌QLc-04经发酵培养36 h其EPS产量为0.2917 mg/mL;QLc-04-EPS为典型吡喃型多糖,分子量为179.9kD,具有显著抑制HeLa细胞增殖的作用。     

云南鬼灯檠属植物中岩白菜素含量比较

[目的]比较云南鬼灯檠属植物不同种及产地样本的岩白菜素含量。[方法]采用HPLC测定云南鬼灯檠属植物不同种及产地样本的岩白菜素含量。色谱柱为AgilentZorbaxXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm,5μm）,流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0～10 min,0%～20%A,100%～80%B）,流速为1.0 ml/min,柱温为30℃,进样量为10μl,检测波长275 nm。[结果]岩白菜素在3～48μg/ml之间与吸光度值呈良好的线性关系,相关系数为0.999 6。4个种及变种的鬼灯檠属植物样本岩白菜素含量以西南鬼灯檠平均含量最高为5.59%,七叶鬼灯檠平均含量最低为3.45%。[结论]鬼灯檠属植物不同种之间岩白菜素含量不同,同种不同居群之间的岩白菜素含量变化也明显。