甘薯病毒病原学研究进展

综述了近30a来国内外关于甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯脉花叶病毒、甘薯轻斑驳病毒、甘薯黄矮病毒、甘薯凹脉病毒，甘薯裉绿缩病毒、甘薯叶斑病毒、甘薯裉绿斑病毒、甘薯类花椰菜叶病毒等13种甘薯病毒病原在侵染症状、粒体形态、传播、理化性状等方面的研究发展。     

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

[目的]以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯G病毒（Sweetpotato virusG,SPVG）基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障.[方法]根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系.[结果]分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97％,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99％.分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象.以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致.[结论]用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测.     

甘薯羽状斑驳病毒单克隆抗体研制成功

甘薯羽状斑驳病毒(Sweet Potato Feath-ery Mottle Virus,SPFMV)可随甘薯传播,并可蚜传。在世界甘薯产区广泛流行。往往和其它病毒、类菌原质体及某些飞虱传致病因子共侵染引致甘薯矮化、花叶、丛枝、块根外部裂纹、块根内部木栓等症状,在某些国家和地区造成甘薯     

甘薯羽状斑驳病毒RT-PCR检测

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）外壳蛋白（CP）基因的核苷酸序列设计并合成特异性引物,建立SPFMV的RT-PCR检测程序。特异性和重复性实验结果表明,该方法能够检测SPFMV,具有很好的特异性和重复性。并对PCR产物进行测序鉴定,结果与报道的序列同源性为88.3%和98.6%,证实所扩增的片段是病毒基因的部分片段。     

甘薯病毒的2种指示植物检测法

近2年来，我省大面积推广甘薯脱毒苗，推广速度超常规，已取得可喜成绩。为确认脱毒种薯和种苗是否带毒，现在有几种方法：(1)甘薯病毒症状学诊断法，此法受品种、不同生长阶段、环境因素限制，且隐性症状不易发现。(2)血清学检测法，此法适合大样本，从理论上讲准确度相对较高，但甘薯常常是交叉感染几种病毒，所以理想的诊断盒也不易生产，当然成本也较高。(3)电镜检测法。这是目前较理想的定性检测法，但技术难度大，要专门设备。(4)指示植物检测法。这是大家公认的，最常用的方法，当然它只能反映是否带病毒，而不能指感何种病毒。现将我院脱毒中心采用的2种方法分别介绍于后：     

甘薯羽状斑驳病毒分子生物学研究概况

近些年来甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）分子生物学有了较深入的研究。如整个基因组的全序列、整个基因组作为一个可译框架（ORF）的某些精细结构和特点、各个功能蛋白的结构和功能（如蚜传机理）、基因组组分与其它马铃薯Y病毒属（PVY）成员的同源性比较、该病毒在PVY属病毒成员的分类地位等都有所涉及。了解这些为利用分子生物学手段对赢余中病毒进行鉴定、检测和加强抗SPFMV病毒基因工程的研究，开辟甘薯等抗病毒育种新途径具有重要意义。     

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，提高检测灵敏度，实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物，采取单因素优化试验，对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg²⁺、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化，恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析，SYBR Green I可视化显色，结果表明：SPFMV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3 0.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO₄ 1.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3...     

应用GAR-HRP进行甘薯病毒NCM-ELISA检测试验

分别采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 (GAR -HRP)和碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔抗体(GAR -AP) ,对甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯潜隐病毒 (SPLV)、甘薯轻斑驳病毒 (SPMMV)及甘薯褪绿病毒(SPCFV)进行NCM -ELISA检测 ,结果表明 ,采用GAR -HRP进行NCM -ELISA检测对于SPFMV、SPLV、SPM MV、SPCFV同样有效 ,且特异性高 ,重现性好 ,在某些方面优于GAR -AP。对于国内危害甘薯的SPFMV、SPLV等主要病毒 ,采用GAR -HRP进行ELISA检测更加经济有效 ,是切实可行的     

山东省甘薯病毒复合侵染的分子鉴定

为明确山东省甘薯病毒种类及发生现状,本研究对7个甘薯种植区进行调查及样品采集,通过RT-PCR/PCR技术分析山东省甘薯病毒种类及侵染类型。结果显示,140份甘薯样品中感染甘薯病毒的样品有133份,共检出7种甘薯病毒,其中甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)检出率最高;由多种病毒复合侵染的甘薯样品占77%,单个甘薯样品中最多检出6种病毒,复合侵染组合共33种。表明山东甘薯病毒复合侵染情况严重,是威胁甘薯生产发展的重要因素。     

甘薯无病毒苗的组培快繁

甘薯属无性繁殖作物,甘薯田间繁殖很易感染病毒,造成产量和品质大幅度下降。椐报道脱毒三代与未脱毒的产量差异不显著。而且脱毒薯在田间应用年限越长,单株薯重越轻。通过组培快繁不但提高繁殖系数,而且避免了病毒的感染,保持品种种性。岳薯1号、梅营1号淀粉含量均达20%以上,产量超过45000kg/hm2;紫薯80是一个深受欢迎的、有广阔市场前景的紫色品种。组培快繁对这3个无毒甘薯品种生产具有重要意义。1　材料与方法于4～6月份采集岳薯一号、梅营一号、紫薯80无毒甘薯苗茎尖,用自来水冲洗0.5～1.0h。置于超净工作台上用无菌滤纸吸干水分后,…     

甘薯脱毒苗病毒嫁接检测技术研究

对脱毒茎尖苗嫁接检测方法进行了研究。结果表明 :以巴西牵牛作为砧木指示植物 ,其播种嫁接时间可在春秋两季进行 ,在砧木的 1～ 6片真叶期均可采用插接法和靠接法进行嫁接检测。     

血清学检测甘薯病毒制样技术研究

以甘薯叶片、叶柄和茎作样本，分别用研磨提取液和印渍法制样，采用ＮＣＭ－ＥＬＩＳＡ方法检测ＳＰＦＭＶ。结果表明３个品种的叶片提取液法平均阳性率为２９．３％，用叶柄印渍法可提高到９３．３％。后者明显提高了检测效果和可靠性，达到嫁接指示植物法的检测水平，而且采样制样简便快速，更适宜大量样本检测。     

湖北省主栽甘薯品种病毒种类的血清学检测

对湖北省2个甘薯主产区内3个甘薯主栽品种,共计39份样本甘薯病毒病采用硝酸纤维膜酶联免疫检测法(NCM-ELISA)检测。结果表明,39份测试甘薯样本中,1个样本感染了甘薯退绿病毒(SPCFV),检出率为2.56%;18个样本感染了甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV),检出率为46.15%;4个样本感染了甘薯潜隐病毒(SPLV),检出率为10.26%;1个样本感染了甘薯G病毒(SPVG),检出率为2.56%。3个主栽甘薯品种中,鄂薯6号病毒检出率最高,为66.67%;其次为徐薯22,病毒检出率为45.45%;福薯18的病毒检出率为43.75%。不同产地甘薯主栽品种带毒状况调查表明,鄂州主产区病毒病种类最多,病毒检出率最高。在5种受测目标病毒中,SPFMV的发生和危害最为严重,其单个采样点的样本感染率最高为52.12%;其次为SPLV,单个采样点的样本感染率为20.00%。2个主产区检测样品均未检测到甘薯退绿矮化病毒(SPCSV),但并不意味SPCSV在2个主产区没有发生,因此有待进一步大范围调查验证。     

甘薯资源抗(耐)病毒的鉴定

2001~2002年采用嫁接法接种对“国家种质广州甘薯圃”保存的162份甘薯资源进行病毒抗性的鉴定,结果表明所有资源在指示植物Ipomoea setosa上显示出带毒症状,但是资源的病毒病潜育期之间存在着差异,甘薯地上部分不显症并不意味不带病毒。     

0.1%大黄素甲醚防控甘薯病毒病害介绍

一、研发背景甘薯病毒病害(SPVD)是由甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)同时感染甘薯并互作时,产生的甘薯病毒病害,是世界范围内对甘薯产业危害最大的病害之一。     

侵染甘薯的马铃薯Y属病毒及其分子生物学研究进展

对甘薯羽状斑驳病毒、甘薯病毒Y、甘薯病毒G、甘薯潜隐病毒、甘薯轻型斑点病毒、甘薯脉花叶病毒6种侵染甘薯的马铃薯Y属(Potyvirus)病毒及其分子生物学进行了综述,并对甘薯病毒的鉴定及甘薯脱毒种苗的检测进行了展望.     

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin,UBI）和组蛋白（histone,H2B）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型（WA）。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3-556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。