基于SLAF-seq技术的白皮松SNP分子标记开发

  目的  在白皮松全基因组范围内开发大量特异性SNP分子标记,为白皮松关键基因定位、分子标记辅助选择和种质资源评价提供足够多的分子标记资源。  方法  本研究以5个群体的共52份白皮松资源为材料,选择火炬松基因组为参考基因组,利用特异性位点扩增片段测序技术（SLAF-seq）,在多态性SLAF标签上开发大量特异性SNP位点,并过滤出一批高质量SNP位点用于白皮松不同群体的遗传多样性分析。  结果  通过序列对比分析,共获得23 597 049个SLAF标签,其中具多态性的SLAF标签有370 659个,共开发得到1 291 290个白皮松群体SNP。在缺失率小于20%、次要等位基因频率（MAF）大于5%的条件下,对所有SNP位点进行过滤,共得到346 840个高一致性的白皮松群体SNP,占SNP总量的26.9%,其中包含9个仅在北京鹫峰（JF）群体中存在变异的SNP位点、148个仅在陕西蓝田（LT）群体中存在变异的SNP位点、425个仅在甘肃麦积山（MJS）群体中存在变异的SNP位点、1 466个仅在陕西午子山（WZS）群体中存在变异的SNP位点、4个仅在山西柏洼山（BWS）群体中存在变异的SNP位点。基于过滤后的346 840个SNP分子标记在5个白皮松群体中进行的遗传多样性分析表明,白皮松不同群体间的遗传多样性存在显著差异,其中MJS和WZS群体的遗传多样性水平相对较高,JF群体的遗传多样性水平相对较低。  结论  研究结果表明,利用SLAF-seq技术可以实现全基因组范围内大量SNP标记位点的开发,且开发的SNP标记在白皮松不同群体中表现出较为丰富的遗传多态性,为白皮松种质资源鉴定、QTL定位、遗传连锁图谱构建以及重要性状的关联分析等研究奠定了基础,对今后白皮松种质资源保护和分子标记辅助选择育种具有重要意义。      

基于SRAP分子标记的流苏树天然群体遗传多样性研究

  目的  揭示我国不同地区流苏树（Chionanthus retusus）天然群体的遗传多样性，更好地为合理保护和开发利用提供科学依据。  方法  采用相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术对不同地区的7个流苏树天然群体的62份样品进行了遗传多样性和群体遗传结构研究。  结果  （1）7个流苏树天然群体具有较高的遗传多样性，8对SRAP引物共扩增出1 728条清晰条带，其中1 649条具有多态性，PPB（多态性条带比例）为95.43%；群体间的有效等位基因数为 1.213 7，Nei’s基因多样性指数为 0.153 7，Shannon’s信息多样性指数为0.268 0。（2）流苏树天然群体存在较高水平的种群内遗传变异和较低水平的群体间遗传变异（Gst = 0.133 6），7个流苏树天然群体间存在较高水平的基因交流（Nm = 3.243 7）。（3）流苏树群体间的遗传相似系数介于0.898 0 ~ 0.973 6之间，平均值为0.934 4，经Mantel检验（r = 0.288，P = 0.205）及群体间的聚类证明群体间的遗传距离与地理距离之间无明显相关性；62份流苏树初级种质聚类结果表明大部分种质表现为同一群体的多数个体聚在一起，部分种质存在不同群体间的个体聚在一起的现象，表现出群体间遗传变异相对稳定而种群内的遗传变异水平相对较高的特点，与基因多样性分析结果一致。  结论  综合多因素分析推测，太行山地区可能是我国流苏树种质资源的主要产区。      

雄性榧树遗传多样性的SSR荧光标记分析

  目的  旨在利用SSR荧光标记对榧树雄株5个野生居群的121个单株进行遗传多样性及群体遗传结构分析,为榧树雄株遗传背景、种质资源评价和优良种质筛选提供参考。  方法  采用CTAB法提取榧树基因组DNA,设计引物,通过荧光引物PCR扩增方法,利用毛细管电泳检测技术检测榧树雄株的多态位点。  结果  24对引物共检测到85个等位基因,变幅为2~7个,平均每个标记有3.542个,其中平均有效等位基因有1.915个。5个居群的平均Nei’s遗传多样性指数为0.365,平均Shannon’s信息指数为0.608。5个居群中,多态位点百分比为75.00%~95.83%,平均为82.50%,居群遗传多样性从大到小依次为嵊州居群、临安居群、富阳居群、黄山居群、淳安居群。居群间的基因流为4.172,遗传分化系数为0.096,遗传分化程度很低。聚类分析结果表明:5个居群的遗传相似度为0.865~0.978,平均为0.932。  结论  雄性榧树居群的遗传多样性较丰富。榧树雄株的遗传变异主要存在于居群内,但居群间也存在一定的基因交流。5个居群可以分为3大类群,这与表型的遗传多样性分析结果比较相似。图4表6参32     

基于RAD-seq技术的金银花SSR标记开发及鉴定

  目的  通过开发特异性高的多态性分子标记位点,以弥补金银花在简单重复序列（SSR）标记方面的匮乏,推动金银花在遗传资源管理及良种鉴定等方向的研究,为后续全基因组测序及组装策略奠定基础。  方法  运用RAD-seq技术对2份金银花样品进行简化基因组测序,利用MISA软件识别contig上的SSR序列并对各类型序列特征进行归纳分析,进而设计引物并利用生物信息学的方法进行引物筛选和有效性检测。  结果  对‘九丰一号’和‘亚特’金银花进行简化基因组测序,分别获得27.805 Mbp和42.560 Mbp干净读长。在组装的45 850个基因序列中共检测到46 999个SSR位点,其中单核苷酸重复单元比例最高（49.15%）,六核苷酸重复单元最少（0.20%）。SSR位点的重复基序以（A/T）n为主,具有偏向性。除单碱基和二碱基重复类型外,SSR位点基序的重复次数集中在5 ~ 6次,且随重复次数增加,SSR位点重复类型出现的频率呈下降趋势。金银花基因组SSR序列长度介于10 ~ 310 bp之间,随重复次数增加,各SSR序列出现的频率逐渐下降。利用Primer3.0成功设计出38 507对SSR引物,设计成功率为81.93%。对挑选的35对SSR引物进行多态性分析,等位基因数、观测杂合度和多态性信息含量（PIC）的平均值分别为5.057、0.363和0.568,其中高多态信息位点26个,中度多态信息位点9个,均未偏离哈迪–温伯格平衡。  结论  利用RAD-seq技术可实现SSR标记的大量开发和多态性SSR引物的筛选,并为金银花在遗传多样性分析和种质鉴定等相关方面的研究提供数据支持。      

黑果枸杞基因组SSR标记开发及遗传多样性分析

【目的】开发黑果枸杞基因组SSR标记并验证其有效性,为黑果枸杞SSR分子开发应用提供依据。【方法】利用Illumina Hiseq 2500测序平台对2年生的黑果枸杞Lr-01无性系的基因组进行PE150测序,用MISA软件对获得的基因组序列进行检索与分析。在此基础上,以18份宁夏枸杞、1份中国枸杞、23份黑果枸杞和6份其他枸杞种质为供试材料,利用Primer 3.0设计SSR引物,进行SSR引物筛选和多样性验证。【结果】在黑果枸杞中共检索到2 326条Scaffolds, 含有2 494个SSR位点,每5.29 kb就有1个SSR位点,优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的59.18%,27.11%和11.75%。重复基元类型共21种,其中类型最多的为单核苷酸重复A/T,占总数的56.05%;其次为二核苷酸重复AT/AT,占总数的12.35%。从设计的SSR引物中,随机挑选合成150对引物进行PCR扩增,筛选出10对高多态性SSR引物,分析其在48份枸杞种质中遗传参数,结果共检测到186个等位基因,平均为19个;观察杂合度、期望杂合度和多态信息含量平均值分别为0.615,0.834和0.817。UPGMA聚类分析结果表明,48份枸杞种质被分为2个类群,其中类型Ⅰ包括23份种质,全部为黑果枸杞;类型Ⅱ包括25份种质,主要为宁夏枸杞。分析结果显示,48份枸杞种质群体结构和群体种质资源遗传结构均可分为2个类群,与聚类分析结果基本一致。【结论】通过高通量测序技术开发黑果枸杞SSR标记是一种简单而高效途径,这些SSR标记为黑果枸杞种质资源的遗传多样性分析及遗传图谱构建等研究提供了可靠的标记选择。     

不同种源蒙古栎遗传变异

分析蒙古栎EST序列和叶绿体全基因组SSR位点信息,开发SSR引物,对蒙古栎群体遗传变异进行分析,为蒙古栎分子标记辅助育种奠定基础。利用est-trimmer、CAP3对蒙古栎EST序列处理,通过perl结合MISA、Primer3和Electronic PCR查找SSR位点,设计引物并筛选验证。EST序列中发现SSR位点163个,主要重复类型为二核苷酸。叶绿体基因组上88个SSR位点以单核苷酸重复为主。7对引物共检测到37对等位基因,平均等位基因数（N_a）=5.286,Shannon’s信息指数（I）=1.291,期望杂合度（H_e）=0.622,多态性信息含量(P_IC)=0.692;群体间遗传分化系数(F_st)=0.147,基因流（N_m）=1.933;AMOVA分析表明,种源间遗传变异占10.216%。蒙古栎种源群体间存在中等水平的遗传分化,其遗传变异主要来源于种源内,且种源间的遗传变异与地理距离无显著相关性。基于EST序列及叶绿体基因组SSR位点信息,有效开发SSR引物,为...     

2021 年 7 期目录

  目的  白皮松作为我国濒危的乡土树种,具有重要的经济和园林观赏价值,为进一步开发和利用白皮松种质资源,本研究基于EST-SSR标记对北京地区3个不同种源地的白皮松群体遗传多样性开展评价。  方法  以白皮松转录组数据为依据,对其微卫星位点进行筛选并设计合成了96对引物,并对北京温泉苗圃栽培收集的3个不同种源地（北京、山东、山西）的白皮松群体,共60个植株开展遗传多样性分析,对其群体内与群体间的遗传结构进行评价。  结果  96对引物中共筛选获得了5对多态性引物,其观察杂合度、期望杂合度、多态性信息含量和等位基因位点个数变化范围分别为0.203 ~ 0.433、0.211 ~ 0.530、0.187 ~ 0.484和2 ~ 5。3个白皮松样本群体中等位基因数量、有效等位基因数量、香农信息指数、观察杂合度和固定指数变化范围为2.400 ~ 3.000、1.516 ~ 1.761、0.484 ~ 0.606、0.295 ~ 0.362和?0.075 ~ 0.081,平均值分别为2.677、1.632、0.560、0.333和?0.007。遗传分化系数和基因流变化范围分别为0.021 6 ~ 0.115 3和1.399 6 ~ 11.340 0,平均值分别为0.090 2和2.521 2。AMOVA分析显示遗传变异主要来自于群体内,群体间差异较小,仅占据11%。  结论  本研究共获得了5对多态性的白皮松EST-SSR引物,可用于后续白皮松群体遗传多样性分析和分子标记辅助育种工作;北京温泉苗圃栽培收集的3个不同种源地的白皮松群体分析结果表明,当地现有收集的白皮松种源群体遗传相似度较高,在未来种质资源保存和苗木繁育工作中应考虑增加其他种源地的白皮松群体。      

半夏SSR分子标记开发与遗传多样性

对半夏转录组数据进行分析,设计开发SSR引物,利用筛选出的SSR引物分析不同居群间半夏的遗传多样性,为半夏分子标记辅助育种提供支撑。结果显示:筛选出的19对多态性较高的引物在17个半夏居群中共检测到49个多态性位点,具有较高的多态性;利用UPGMA作图共将17个半夏居群分为3个类群;通过分子方差分析(AMOVA)发现半夏居群内的变异达到88%,说明群体与群体间的差异相对较小,遗传变异主要来源于个体间;居群间平均分化系数Fst为0.124,居群间基因流Nm值为1.765,表明居群间能正常地进行基因交流,且居群间遗传分化受基因流的影响较大。本研究利用SSR技术开发的19对SSR引物在不同半夏居群间具有一定的通用性、多态性,能将17份半夏材料明确区分。     

基于SSR分子标记的154份桃品种遗传多样性分析

利用简单重复序列(SSR)分子标记对桃种质资源的遗传多样性和群体结构进行分析，构建桃品种的分子数据库，为桃品种的鉴定提供技术依据。利用10个SSR标记对154份桃品种进行指纹采集，通过聚类分析和群体结构分析研究其遗传多样性。结果表明，10对SSR引物共检测出140个等位变异，变异范围为8～27;共获得304个基因型，变化范围为17～59;引物多态性信息含量(PIC)变化范围为0.510 9～0.824 2,申请品种保护和登记的品种遗传多样性较已知品种低。根据Nei’s遗传距离进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析，供试品种可划分为5个大类，各品种间的遗传距离在0.029 3～1.000 0之间，其中2对品种未区分开。对供试品种进行群体结构分析，发现可以划分为4个亚群，大部分材料的亲缘关系比较单一。方差分析结果表明，10%的遗传变异来自群体间，72%的遗传变异来自群体内部，群体内的变异大于群体间。154份桃品种的遗传多样性水平适中，群体间的遗传分化程度处于中等水平，同一育种单位的品种遗传距离较近。研究结果可为不同类型桃育种创新、分子指纹数据库的构建及品种鉴定提供参考依据。     

中国和印度黍稷的遗传差异分析

利用SSR标记分析黍稷种质资源的遗传多样性,以揭示不同来源黍稷种质资源的亲缘关系和遗传群体结构差异,为黍稷起源进化研究奠定基础。采用80对黍稷特异性SSR标记对56份黍稷材料进行PCR扩增,通过进行遗传参数、聚类、主成分、遗传结构等分析,评估不同群体间的遗传多样性,以探讨遗传结构差异。结果表明,中国黍稷资源的多样性指数(0.846 7±0.152 8)和多态性信息含量(0.445 8)均高于印度资源(0.838 0±0.143 5,0.394 8),遗传多样性更丰富;根据UPGMA聚类,将56份材料划分为4个类群,其中,类群Ⅰ有21份,主要包括印度黍稷,其他类群主要为中国黍稷;利用Structure进行群体遗传结构分析,结果显示,56份材料被划分为3个群组,其中,类群ⅰ和类群ⅱ主要包括印度黍稷,类群ⅲ主要包括中国黍稷;主成分分析结果表明,56份黍稷材料共划分为5个类群,这5个类群划分界限清楚,种群结构明显,不同的黍稷有严格的地理分布。     

基于荧光SSR标记的毛白杨核心种质构建

  目的  研究毛白杨核心种质的取样策略，在进行相应的遗传分析基础上，构建核心种质，分析其遗传多样性，为毛白杨种质资源库建设、引种和新品种选育提供科学依据，亦为其他树种核心种质构建提供参考。  方法  基于16对荧光SSR引物，利用毛细管电泳技术分析272份毛白杨和白杨杂种种质不同取样比例的遗传多样性参数。根据期望杂合度，计算每个样品对总体遗传多样性的贡献值，然后对所有样品根据贡献值从大到小进行排序。通过比较贡献率最高的前50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%和15%取样比例获得的平均有效等位基因数（Ne）、平均Shannon信息指数（I）、平均期望杂合度（He）等，分析核心种质的代表性，确定其合适的取样比例。  结果  随着取样比例的降低，Ne、I和He值均在升高，均大于原始种质相应数值，而且He值均大于0.5，表明具有丰富的遗传多样性，而原始种质的He值小于0.5。按照25%取样比例，得到前68名种质，其中包含18份杂种种质以及所有省份选出的部分优异种质。所得到的Ne、I和He分别是2.761、1.094和0.539，均大于原始种质的相应值2.075、0.825和0.432。t检测结果表明，核心种质与原始种质的遗传多样性无显著差异，表明这68份种质在遗传多样性方面具有可靠的代表性，可以作为核心种质。北京的种质与河北的种质遗传一致度最高，为0.997；与山西次之，为0.990。  结论  毛白杨核心种质的最佳取样比例是25%，最佳取样范围为20% ~ 40%，如果种质资源数目较大，可以适当降低至15%，如果基数较小，可以升高至45%。He、Ne、I等均表明这些核心种质具有丰富的遗传多样性。杂种种质遗传变异丰富，聚合了亲本的优良等位基因，首次从分子水平证明了杂种种质是毛白杨遗传改良的重要育种资源。建议相关部门或者育种者要高度重视白杨杂种种质的收集、保存和再利用。      

北京山区3种栎属植物居群遗传结构与基因渐渗研究

  目的  栎属植物种间经常发生种间杂交和基因渐渗现象，特别是同域分布的同组内栎树之间，这种情况会更加频繁。本文通过对北京山区3种栎属植物居群遗传结构遗传变异与遗传结构进行研究，为了解北京地区自然分布的栎属植物种间基因渐渗情况、种质资源现状以及经营管理提供有效数据。  方法  本文使用6对SSR引物对云蒙山、上方山和北农林场同域分布的304个蒙古栎、槲树、槲栎的居群遗传多样性、遗传结构和种间基因渐渗进行了研究。  结果  共检测到等位标记105个，每个位点的平均等位标记数（Na）为17.5个，期望杂合度（He）为0.660 ~ 0.911，平均为0.838，多态性信息含量指数（PIC）为0.632 ~ 0.903，平均为0.822，3种栎树在总体水平上具有较高的遗传多样性。在种的水平上，3种栎树的平均等位标记数（Na）为12.667 ~ 14.167，期望杂合度（He）为0.743 ~ 0.849，多态性信息含量指数（PIC）为0.725 ~ 0.826，3种栎属植物的遗传多样性水平为蒙古栎 > 槲树 > 槲栎。对7个栎树居群的遗传结构分析表明，遗传变异大部分发生在居群内。通过Structure软件对3种栎树种间基因渐渗进行分析，发现槲树?槲栎、槲树?蒙古栎和槲栎?蒙古栎这3个种对间均有基因渐渗发生。  结论  在北京山区分布的蒙古栎、槲树和槲栎这3种栎属植物之间存在普遍的、复杂的渐渗杂交现象。      

利用ISSR与SRAP分子标记分析金线莲种质资源遗传多样性

  目的  研究浙江与福建等地引种、杂交与野生的金线莲Anoectochilus roxburghii样品间遗传多样性和亲缘关系,为金线莲种质资源鉴定及优良新品种(系)选育提供科学依据。  方法  以48份新鲜金线莲叶片为材料,分别采用简单重复序列扩增多态性(ISSR)与序列相关扩增多态性(SRAP)分子标记技术,各挑选11条(对)多态性好、扩增条带清晰的引物。经琼脂糖凝胶电泳成像后,统计其扩增条带数,运用NTSYS-PC 2.1和POPGENE 32软件进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析。  结果  ISSR分子标记技术共扩增出86条条带,其中多态性条带84条,多态位点百分率为97.67%;SRAP分子标记技术共扩增出88条条带,其中多态性条带86条,多态位点百分率为97.73%,ISSR和SRAP标记均表现出较高的多态性。不同样本间的遗传距离和遗传一致度表明:浙江省与福建省的金线莲种质混杂严重,而遗传多样性结果显示:福建省的金线莲种群遗传多样性更高。此外,基于ISSR和SRAP标记的UPGMA聚类结果显示:48份不同种源的金线莲依亲缘关系的远近可分为四大类,聚类的划分受到一定地域性的影响,但各地域的金线莲品种在这四大类中均互有混杂。  结论  金线莲在物种水平上遗传多样性较高,在各地区、各品种(系)间遗传交流频繁,ISSR与SRAP分子标记技术可以从分子水平上揭示浙江与福建等地金线莲的遗传多样性,且结合ISSR标记与SRAP标记的分析结果要优于单一的分子标记结果。图4表3参24     

白及种质资源遗传多样性分析

  目的  采用简单重复序列间扩增(ISSR)和相关序列扩增多态性(SRAP)等2种标记技术分析不同种源白及Bletilla striata样本的遗传多样性水平和遗传关系,为白及种质的鉴定、分类、保护和开发提供理论依据。  方法  从100个ISSR引物和238对SRAP引物组合中筛选出多态性高、扩增条带清晰、重复性好的引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,用Popgene 32.0计算来自浙江、云南、贵州和四川等省32个不同种源白及的遗传多样性参数和遗传距离,用NTSYS-pc 2.10e进行聚类分析。  结果  从100个ISSR引物中筛选出11个多态性较好的引物,共扩增出188个条带,平均每个引物扩增出17.09个条带,其中多态性位点174个,占总扩增片段的92.20%;从238对SRAP引物组合中筛选出11对多态性较好的引物组合,共扩增出216个条带,平均每个引物扩增出19.64个条带,其中多态性位点202个,占总扩增片段的93.52%。综合ISSR和SRAP的标记结果发现:四川白及种源的遗传多样性水平最高,贵州最低;非加权组平均法(UPGMA聚类)和主坐标分析(PCoA分析)结果显示:聚为一类的白及种源大多来自同一省份,云南省与四川省白及种源的遗传距离较近,浙江省和贵州省白及种源的遗传距离较近,说明遗传距离与地理距离存在一定的重合,但并不呈正相关。  结论  本研究所选白及种源间具有较高的遗传多样性,ISSR和SRAP标记技术均可有效揭示白及的遗传多样性和亲缘关系。图4表4参25     

基于EST-SSR的广东与广西茶树资源遗传结构和遗传分化比较分析

 【目的】通过揭示茶树资源遗传多样性、遗传结构和遗传分化关系,为资源的有效保护和充分利用提供理论依据。【方法】利用109对核心EST-SSR标记对广东、广西的105份茶树核心资源进行遗传多样性和遗传分化比较分析;同时对广东和广西资源组群间、组群内白毛茶和茶种群间、种群内进行AMOVA分子方差分析,进一步剖析遗传结构,并绘制群体遗传结构图。【结果】109对核心EST-SSR标记共检测到435个等位基因,平均等位基因（NA）3.99个,平均有效等位基因（NE）为2.12,平均Nei's基因多样性（H）为0.59,平均观测杂合度（Ho）为0.32,平均期望杂合度（He）为0.46,平均多态性信息含量（PIC）为0.56。广东茶树资源遗传多样性的上述6个参数均小于广西茶树资源。广东白毛茶NA和H低于广东茶,NE、He、Ho和PIC与茶较为接近;广西白毛茶NA大于广西茶,但是NE、He和H低于茶。F-统计量分析表明白毛茶与茶种群内近交系数（Fis）、种群间近交系数（Fit）和种群遗传分化（Fst）都较低,基因流（Nm）都较高。广东白毛茶与广西白毛茶Fst为0.04,基因交流相对较低为6.26。AMOVA分析显示组群间遗传变异为3.09%,组群内种群间遗传变异为2.22%,种群内遗传变异为94.69%。群体遗传结构显示105份茶树资源可分为3个类群,类群Ⅰ由6份选育品种组成;类群Ⅱ由43份广东资源和16份广西资源组成;类群Ⅲ包括广西36份和广东4份资源。【结论】广东茶树资源遗传多样性程度低于广西。广东白毛茶遗传多样性比广东茶丰富,种群遗传分化低,存在较频繁的基因交流。广东白毛茶遗传多样性低于广西白毛茶,遗传分化相对较高,基因流较低。AMOVA分析显示遗传变异主要分布于广东、广西茶树资源群体内。