红龙鱼源β-溶血性嗜水气单胞菌AH的分离及其对机体铁代谢的影响

对具有典型败血症病症的染病红龙鱼进行病原菌分离鉴定分析。从其肝脏中分离得到病原菌菌株AH,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定为嗜水气单胞菌。通过多重PCR检测确认该嗜水气单胞菌AH属于β-溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。此外研究嗜水气单胞菌AH侵染红龙鱼后对其机体铁代谢的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌AH,在侵染后不同时间点收集红龙鱼的血液和肝脏组织,分别采用分光光度计法和电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry,简称ICP-AES)法检测红龙鱼血清和肝脏中的铁含量,同时采用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导子和转录激活因子3基因(stat3)表达量进行检测。结果表明,侵染嗜水气单胞菌AH后,红龙鱼血清中铁浓度明显降低,在24、48h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组差异没有达到显著水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量在一定时间范围内显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但在各时间点的表达量均高于对照。由结果可知,机体通过调节铁调素基因(hepc)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁含量,并增加储存铁含量来应对细菌的侵染。     

嗜水气单胞菌感染对团头鲂肝脏铁代谢的影响

为研究细菌感染对鱼类肝脏铁代谢的影响,以团头鲂为研究对象,通过腹腔注射嗜水气单胞菌,在感染后不同时间点取团头鲂的血液和肝脏组织,分别采用分光光度法和ICP法检测血清和肝脏中的铁含量,采用实时荧光定量PCR法对铁代谢调节相关基因——铁调素(hepc)、白细胞介素6(il-6)、JAK/STAT信号通路的蛋白质酪氨酸激酶3(jak3)、信号转导子和转录激活因子3(stat3)等表达量进行检测。结果显示:感染嗜水气单胞菌后,团头鲂血清中铁浓度明显降低,在12、24h时显著低于对照组,总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁含量相对于对照组虽没有达到显著性差异水平,但仍有明显升高。肝脏中hepc基因的表达量显著上升;il-6、jak3和stat3基因表达量开始均有所上调,随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。试验结果说明,机体通过调节hepc等铁代谢相关基因的表达,进而降低自身游离铁和增加储存铁来应对病原菌的感染。     

大鲵抗菌肽基因KK1/KK5/KK8对嗜水气单胞菌的侵染响应

【目的】探究大鲵(Andrias davidianus)抗菌肽家族基因对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染的响应,为揭示抗菌肽家族基因的功能提供理论依据。【方法】通过腹腔注射嗜水气单胞菌感染大鲵后,采用Trizol提取组织总RNA,反转录合成cDNA,再以实时荧光定量PCR(qPCR)分析抗菌肽家族3个基因(KK1、KK5和KK8)在大鲵皮肤和肝脏器官的表达响应情况。【结果】经腹腔注射嗜水气单胞菌后,抗菌肽基因KK1、KK5和KK8在大鲵皮肤组织中的相对表达量在攻毒后12~36 h均显著高于注射PBS的对照组(P0.05,下同);而在肝脏组织中,抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量分别在攻毒后24、12和24 h时显著高于对照组,其他时间点均低于对照组,说明这3个抗菌肽基因在早期积极响应嗜水气单胞菌的侵染,但相对于皮肤组织,其高表达量持续时间较短。【结论】抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水气单胞菌侵染大鲵时积极作出应答,尤其在皮肤组织中的特异表达对启动机体天然免疫应答抵抗病原微生物感染具有重要作用。     

食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因的多重PCR检测技术研究

本研究目的是建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)的技术。气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌重要的毒力因子。多重PCR技术被应用于检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本,包括鲤鱼片,水,鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片。该研究使用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16srRNA基因(356个碱基对)。所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因 (130个碱基对)。26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

不同鳊鲂属鱼类群体的形态差异分析

运用3种多元统计方法对我国鳊属长春鳊(Parabramis.pekinensis)、鲂属团头鲂(Megalobrama.amblycephala)、东江三角鲂(Megalobrama.terminalis)、钱塘江三角鲂(Megalobrama.terminalis)、厚颌鲂(Megalobrama.pellegrini)和广东鲂(Megalobrama.hoffmanni)6个群体的可数性状、可量性状和框架性状的形态学差异进行了分析。结果显示,鳊鲂属鱼类6群体在侧线鳞数、侧线上鳞数、侧线下鳞数、背鳍条数、胸鳍条数、腹鳍条数、臀鳍条数等7项形态可数性状上的差异不显著(P0.05)。对9项可量比例参数和20项框架比例参数的聚类分析结果表明,团头鲂与同属的厚颌鲂、三角鲂亲缘关系较近,这3个鲂属种群与鳊属长春鳊形态差异较大,与同为鲂属的广东鲂形态差别最大;另外,聚类分析表明三角鲂的2个地理群体(东江三角鲂、钱塘江三角鲂)也存在一定的形态差异。判别分析构建了鳊鲂属鱼类6群体的判别函数,其综合判别率为93.7%。主成分分析提取的前2个主成分的累积贡献率为77.9%,其中主成分1的贡献率为70.9%,对鳊鲂属鱼类群体间形态学差异起决定性作用的特征集中在背腹轴方向。     

多重PCR技术检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因研究

气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌的重要毒力因子。为建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)的技术,本文采用多重PCR技术检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本(包括鲤鱼片、水、鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片),并用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。结果表明,所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16S rRNA基因(356个碱基对),所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因(130个碱基对),26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

三角鲂MHCⅠα基因全长cDNA克隆与生物信息学分析

主要组织相容复合体（major histocompatibility complex,MHC）是一类具有高度多态性的分子,在脊椎动物的先天免疫应答中起到重要作用。根据已报道鱼类的MHCⅠα基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆三角鲂MHCⅠα基因cDNA序列全长,命名为Mete-UAA,并对其进行生物信息学分析。结果显示,Mete-UAA全长为2 102 bp,包含1 044 bp的开放阅读框,编码347个氨基酸。编码的MHCⅠα蛋白质预测分子量为38 699.18,等电点5.23,含有16个氨基酸组成的信号肽,具有亲水性,定位于细胞膜上,具有1个N-糖基化、3个O-糖基化和39个磷酸化的潜在位点。氨基酸序列同源性比对发现,Mete-UAA氨基酸序列与团头鲂同源性最高为75.79%,与草鱼同源性稍低于团头鲂,为75.25%。Mete-UAA具有MHCⅠα的典型结构特征,包含1个前导肽、3个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区。二级结构分析显示,Mete-UAA蛋白质中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为25.94%、9.22%、26.80%和38.04%。基于转录组学分析表明,感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后三角鲂MHCⅠα基因表达呈总体下降趋势。本研究从三角鲂肝中成功克隆MHCⅠα基因,分析了其生物信息学特征,为后续研究MHCⅠα参与调控三角鲂先天免疫应答的机制提供理论基础。     

溶血性嗜水气单胞菌XF-6的分离鉴定及其对鲥鱼机体免疫功能的影响

【目的】本文研究了湖北省武汉市一些养殖场鲥鱼发病原因以及致病菌对其免疫因子的影响。【方法】采用划线培养方法对染病鲥鱼进行了病原菌分离鉴定,从其肝脏中分离得到病原菌XF-6,经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定,为嗜水气单胞菌。用多重PCR方法确认嗜水气单胞菌XF-6属于溶血性嗜水气单胞菌,含有气溶素基因(aer A)和溶血素基因(ahh1)。同时研究了嗜水气单胞菌XF-6侵染对鲥鱼机体免疫功能的影响,通过腹腔注射嗜水气单胞菌XF-6,在侵染后不同时间点采集鲥鱼的血液和肝脏,分别采用分光光度计法和ICP-AES法检测血清和肝脏铁浓度,运用实时荧光定量PCR法对铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)的表达量进行检测。【结果】侵染嗜水气单胞菌XF-6后,鲥鱼血清中铁浓度明显降低,在12、24、48 h时显著低于对照组;血清中总铁结合力有所上升,但没有达到显著水平;肝脏中铁浓度相对于对照组没有达到显著性差异水平,但仍有升高。肝脏中hepc基因的表达量在6、12、24 h时显著上升;肝脏中il-6基因的表达量在12、24、48 h时显著上升、肝脏中jak3基因的表达量在12、24 h时显著上升,肝脏中stat3基因的表达量在6、12、24 h时显著上升。这4种基因表达量随后有所下降,但各时间点的表达量均高于对照。【结论】鲥鱼机体通过调节铁调素基因(hepc)、白细胞介素基因(il-6)、JAK3/STAT3信号通路的酪氨酸激酶3基因(jak3)、信号转导和转录激活因子3基因(stat3)等铁相关基因的表达,进而降低自身游离铁浓度和增加储存铁浓度来应对病原菌的侵染。     

嗜水气单胞菌毒力因子及病害控制技术研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于弧菌科气单胞菌属,是水产动物的重要病原菌,其危害的产生与外毒素、胞外酶及粘附因子等毒力因子的分泌与表达相关,该菌感染疾病的控制方法主要有免疫控制和药物控制。为降低水产养殖过程中的抗生素药物使用和确保水产品的安全性,利用益生菌制剂来控制嗜水气单胞菌的危害将成为水产养殖生态防治的重要方向。该文主要对嗜水气单胞菌的致病因子以及危害控制方面的研究进展进行了概述。     

5种中草药提取物对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果(摘要)(英文)

[目的]研究5种中草药提取物对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的体外抑菌效果。[方法]以鱼类常见病原菌嗜水气单胞菌为供试菌,测定了5种中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用,并测定了其中效果较好的中草药的治愈率,确定了其最佳用药剂量。[结果]在相同试验条件下,5种中草药中五倍子(Rhuschinensis Mill)、石榴皮(Punica granatum L.)和诃子(Terminalia chebula Retz)对嗜水气单胞菌有较强的抑菌效果,其中五倍子抑菌效果显著高于其他几种中草药(P0.05)。五倍子治疗由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症的最佳治疗剂量为:0.5mg/ml五倍子药液药浴40min,治愈率为100%。[结论]该研究为鱼类暴发性细菌病的防治提供了科学的用药依据。     

碳酸氢钠对嗜水气单胞菌致病性及其主要毒力相关基因表达的影响

为探讨碳酸氢钠对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响,利用荧光定量PCR技术,以未添加碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为对照组,添加0.024、0.048、0.072、0.096和0.120 mol/L碳酸氢钠的嗜水气单胞菌为实验组,对嗜水气单胞菌的3个主要毒力基因——溶血素基因(AHH-1)、气溶素基因(Aer A)和弹性蛋白酶基因(ahyB)进行相对表达分析。结果表明,5个实验组嗜水气单胞菌的AHH-1、AerA和ahyB表达量均显著低于对照组。且随着碳酸氢钠浓度的增加,基因表达呈逐渐下调趋势。人工感染结果表明,添加碳酸氢钠培养的嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量明显比对照组高,而且随着碳酸氢钠浓度的增加,嗜水气单胞菌对斑马鱼的半致死量呈现逐渐加大的趋势,表明毒力逐渐减小。     

蛭弧菌对鲤感染嗜水气单胞菌

以不同浓度的蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)(简称Bd)Bd-9-25922 投放水族箱中,对鲤用浸泡法进行人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydropila)(简称SC)SC-96-24试验,并观察蛭弧菌与病原菌、水质状况及鱼类发病情况变化之间的关系.试验结果表明,蛭弧菌对嗜水气单胞菌有较强的裂解和净化作用,对水中氨氮有一定的降解作用,并且对鲤感染嗜水气单胞菌所致暴发性出血病有明显的预防作用.     

嗜水气单胞菌脂肪酸生物合成途径相关蛋白的耐药性

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila是一种广泛存在于水体与土壤的人-畜-鱼共患病原菌。本课题组前期研究发现生物被膜状态下嗜水气单胞菌在抗生素金霉素的胁迫下,脂肪酸生物合成途径中相关蛋白表达上升,但具体特性与功能尚不明确。为进一步探究这些蛋白在抗生素胁迫下的变化规律与功能,设计引物克隆乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶α亚基(AccA)、乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(AccD)、酰基载体蛋白质合成酶(FabB)以及丙二酸单酰辅酶A酰基载体蛋白酰基转移酶(FabD)。通过比较各高表达菌株在金霉素作用下的生存率,来分析相关蛋白的耐药特性。结果表明,高表达AccD、FabB和FabD蛋白能够显著提高细菌在抗生素胁迫下的生存率,而高表达AccA蛋白则只在前期提高细菌存活率。此研究揭示脂肪酸生物合成途径相关蛋白在细菌的耐药过程中起重要作用,也为后续研究嗜水气单胞菌的耐药机制提供了实验依据。     

鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究

研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;P5抗血清被动免疫红鲫,攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好,进化保守。成功克隆表达、纯化P5蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度0.5 mmol/L,32℃诱导8 h。Western blotting验证P5抗血清特异性较好,效价达到1∶1 600,ELISA显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用,表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%,具有良好的免疫保护作用。Western blotting发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用,表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白P5是一种保护性抗原,有望作为防治嗜水气单胞菌感染的疫苗候选成分。     

团头鲂TYK2基因的克隆与表达分析

以团头鲂为研究对象,克隆获得络氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)基因的ORF序列,该序列长3 489 bp,编码1 162 aa。团头鲂TYK2基因包含23个外显子和22个内含子,与大多数脊椎动物的基因结构相似。蛋白质结构域预测结果显示,TYK2包含4个结构域:B41、SH2、TyrKc(假激酶区)和TyrKc(络氨酸激酶区)。氨基酸多序列比对和系统进化分析结果均显示,TYK2在进化过程中非常保守。荧光定量PCR结果显示,在健康成鱼中,TYK2在中肾的表达量最高,其次是血液、脾脏和头肾,在肠道、脑、鳃、心脏、肌肉和肝脏中的表达量较低。感染嗜水气单胞菌后,TYK2在脾脏和肠中有相似的表达模式:在感染后4 h显著降低并达到最小值,在12 h显著上升且达到最大值(P0.05);在中肾中,在24 h极显著上升且到达最大值,在36 h极显著降低并达到最小值。以上研究结果表明,TYK2基因在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染的过程中发挥着重要的作用。     

香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

感染异育银鲫补体组分C3·C4表达研究

[目的]了解补体组分在感染性鱼类疾病中的作用,为鱼类疾病的诊断和治疗提供参考。[方法]采用不同浓度(2×106、4×106CFU/ml)的嗜水气单胞菌感染异育银鲫,利用半定量RT-PCR技术检测感染不同时间后肝脏中补体组分C3和C4的表达量。[结果]感染后4、5 h时,异育银鲫肝脏中C3的表达量均显著高于对照组。在感染后4 h时,不同浓度组之间C3的表达量无显著差异。而在感染后5 h时,感染浓度1组(注射2×106 CFU/ml嗜水气单胞菌)中C3的表达量显著高于感染浓度2组(注射4×106 CFU/ml嗜水气单胞菌)。异育银鲫肝脏中C4的表达水平远低于C3。在感染后5 h时,感染浓度1组C4的表达量显著高于对照组,其余处理组与对照组均无显著差异。[结论]补体组分C3在鱼类免疫防御系统中具有非常重要的意义。     

5种中草药提取物对嗜水气单胞菌体外抑菌效果的研究

[目的]研究5种中草药提取物对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的体外抑菌效果。[方法]以鱼类常见病原菌嗜水气单胞菌为供试菌,测定了5种中草药对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用,并测定了其中效果较好的中草药的治愈率,确定了其最佳用药剂量。[结果]在相同试验条件下,5种中草药中五倍子（Rhus chinensisMill）、石榴皮（Punica granatumL.）和诃子（Terminalia chebulaRetz）对嗜水气单胞菌有较强的抑菌效果,其中五倍子抑菌效果显著高于其他几种中草药（P〈0.05）。五倍子治疗由嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症的最佳治疗剂量为：0.5 mg/ml五倍子药液药浴40 min,治愈率为100%。[结论]为鱼类暴发性细菌病的防治提供了科学的用药依据。     

鳊鲂鱼类的染色体核型及DNA含量分析

为了解我国主要鳊鲂鱼类细胞遗传学特征,用肾细胞体内培养法分析鳊鲂鱼类染色体核型,并首次测定了广东鲂、三角鲂、长春鳊等的DNA含量。结果显示团头鲂核型为2n=24m+20sm+4st,NF=92,DNA含量为2.66 pg;广东鲂核型为2n=26m+18sm+4st,NF=92,DNA含量为2.57 pg;厚颌鲂核型为2n=26m+18sm+4st,NF=92,DNA含量为2.81 pg;三角鲂核型为2n=24m+20sm+4st,NF=92,DNA含量为2.60 pg;长春鳊核型为2n=26m+22sm,NF=96,DNA含量为2.34 pg。鲂属鱼类在进化过程中染色体核型存在着趋同性,与长春鳊核型差异明显。无论是DNA含量还是总臂数(NF)鳊鲂鱼类差异都很显著。此外,按总臂数多少划分,长春鳊为特化类群,鲂属鱼类为较原始类群。这些结果可为鳊鲂鱼类的染色体组操作和基因组学研究提供必要资料。     

厚朴酚和黄藤素对鱼类3种常见致病菌的抑制效应

采用二倍稀释法和滤纸片法,分别将厚朴酚和黄藤素两种植物活性成分配制成6种不同质量浓度的药液,并制作成药敏滤纸片,对鱼类3种常见致病菌(嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、温和气单胞菌Aeromonas sobria、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus)进行体外抑菌试验,旨在研究厚朴酚和黄藤素对鱼类3种常见致病菌的抑菌效应。结果表明:厚朴酚和黄藤素对嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌有显著的抑制作用(P0.05),厚朴酚质量浓度为3.125 mg/m L时对嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌的抑菌圈直径为(15.13±0.29)mm,(15.70±0.34)mm,具有高敏感性;随着黄藤素质量浓度的降低,嗜水气单胞菌和副溶血性弧菌抑菌圈直径逐渐减小。厚朴酚和黄藤素对温和气单胞菌均无抑菌作用(P0.05)。