一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究

利用简并PCR和TAIL-PCR技术从嗜酸性真菌Bispora betulina中克隆得到一个酸性木聚糖酶基因xyn11BB。该基因全长1 207 bp,含有三段内含子、一段外显子和一个终止密码子,编码由297个氨基酸组成的蛋白质,推测蛋白质含有一个CBM1结构域。将不带原基因信号肽编码序列的cDNA基因以正确阅读框架克隆到表达载体pPIC9上,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中诱导表达,其表达活性达121.15 U/mL。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为4.5,在酸性条件下具有良好的活性和稳定性,可作为饲料用酶的备选。     

链霉菌Streptomyces sp. S9木聚糖酶基因xynBS9的克隆表达及性质分析

通过设计简并引物和构建基因组文库的方法从链霉菌Streptomyces sp.S9中克隆得到β-l,4-木聚糖酶基因xynBS9。该基因全长1 023 bp,编码340个氨基酸。将不带原基因信号肽编码序列的xynBS9以正确阅读框架克隆到表达载体pET-22b(+)上,并在大肠杆菌BL2l(DE3)中诱导表达。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和疏水柱纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为60℃,最适pH为6.5,在碱性条件下具有良好的稳定性。     

来源于链霉菌Streptomyces fradiae var.k11的抗蛋白酶甘露聚糖酶的基因克隆与鉴定

通过设计简并引物和TAIL-PCR的方法从Streptomyces fradiae var.k11中克隆得到一个β-1,4-甘露聚糖酶编码基因manS221,其全长1359 bp,编码452个氨基酸,前端28个氨基酸为预测信号肽.构建表达载体pET-28a-manS221并转化大肠杆菌BL21(DE3),特异性表达manS221基因,重组的甘露聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析纯化.酶学性质分析表明,重组甘露聚糖酶最适温度为52℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0～9.0的范围内有良好的稳定性,并且对中性蛋白酶具有高抗性.这些优良的性质使得ManS221在食品、饲料和纺织工业生产中具有良好的应用前景.     

来源于链霉菌Streptomyces fradiae var. k11的抗蛋白酶甘露聚糖酶的克隆

通过设计简并引物和TAIL-PCR的方法从Streptomyces fradiae var. k11中克隆得到一个β-l,4-甘露聚糖酶编码基因manS221,其全长1 359 bp,编码452个氨基酸,前端28个氨基酸为预测信号肽。构建表达载体pET-28a-manS221并转化大肠杆菌BL2l（DE3）,特异性表达manS221基因, 重组的甘露聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析纯化。酶学性质分析表明,重组甘露聚糖酶最适温度为52℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0~9.0的范围内有良好的稳定性,并且对中性蛋白酶具有高抗性。这些优良的性质使得ManS221在食品、饲料和纺织工业生产中具有良好的应用前景。     

枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质

为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B(Gen Bank登录号AY340789)在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌(Bs916/p XYNB2),并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0~5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6~7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

特异腐质酶Humicola insolens Y1耐热型木聚糖酶基因的克隆及酶学性质分析

利用简并PCR和TAIL PCR从嗜热特异腐质霉Humicola insolens Y1中克隆得到一个新的耐热型木聚糖酶基因xynD。该基因全长1 104 bp, 共编码367个氨基酸，不含有内含子，N端的22个氨基酸为信号肽。成熟蛋白在毕赤酵母中进行了重组表达，重组蛋白经超滤和离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明，XynD的最适pH为6.0，在pH 4.0～7.0可以保持80%以上的酶活性，在pH 5.0～10.0具有良好的pH稳定性。最适作用温度为70℃，在60℃条件下保持稳定。多数金属离子对XynD酶活力没有明显的影响。麦芽汁降解实验表明，XynD与商用β 葡聚糖共同作用可以提高麦芽的过滤速率(45.7％)并降低粘度(81％)。因此XynD在酿酒业，特别是啤酒制造业具有潜在的应用价值。     

唾液腺特异性表达木聚糖酶转基因猪检测

研究分别测定11头唾液腺特异性表达木聚糖酶(xyn B)转基因猪的饲料表观消化率和38头木聚糖酶(xyn B)转基因猪的生长性能指标。结果表明,与非转基因猪相比,转xyn B基因猪对饲料营养成分的表观消化率和生长性能均无显著差异。     

海栖热袍菌极端耐热木聚糖酶B的提纯

克隆并在大肠杆菌中表达的海栖热袍菌的 xyn B基因 ,其表达产物木聚糖酶 B的 C 末端带有 6×His标签 ,研究了这种基因重组酶的提纯方法。通过对粗酶提取液的热变性处理 ,Ni NTA亲和柱层析和离子柱层析 ,最终得到了电泳纯的木聚糖酶 B,提纯倍数 4 4.4 ,得率 11。SDS PAGE法测定木聚糖酶 B的相对分子质量为 4 2 ku,与理论推算值 4 2 333u相吻合     

嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变

为了进一步提高嗜热真菌(Thermomyces lanuginosus DSM10635)本已较耐热的木聚糖酶1YNA的热稳定性。利用重叠延伸PCR技术从嗜热真菌基因组DNA中扩增获得了木聚糖酶1YNA的基因xyl,将其插入到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中,构建了重组表达质粒pET-22b(+)-xyl。该质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)后获得了能成功表达的工程菌。工程菌表达木聚糖酶1YNA的最适温度为65℃,最适pH值为6.0。其在75℃,pH值为6.5的条件下失活处理30min后还残存有30%的酶活,与嗜热真菌生产的木聚糖酶特性相近。在对该木聚糖酶的N端氨基酸序列进行定点突变后发现,T4A、T4G、T4R均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响,其中T4G突变体的耐热性有变弱的趋势。     

基于响应曲面法优化蜂胶的乙醇提取工艺

蜂胶具有优良的保健效果,一直被作为功能食品而加以应用。为了满足实际生产中提高蜂胶产品质量和生产效率的要求,在充分模拟实际生产条件的基础上,利用响应曲面法对蜂胶提取率和总黄酮含量的影响因素（提取时间、乙醇浓度、固液比、提取次数、提取温度）进行了分析。结果表明,针对本实验中采用的蜂胶毛胶样品,回归模型预测的蜂胶提取率达到38.324 6%,总黄酮含量达到199.776 0 mg/g;最佳提取条件为提取时间24 h,乙醇浓度95%,固液比1∶10,提取次数2次,提取温度为室温。为了达到指导实际生产的目的,试验结论须得到生产车间的实际检验。     

木聚糖酶的稳定性研究

 研究了GXC木聚糖酶的稳定性。结果发现:木聚糖酶具有较好的热稳定性和pH 稳定性,对金属离子不敏感,耐储存,对胰蛋白酶的耐受性大于胃蛋白酶。     

毛栓菌木聚糖酶理化性质及动力学研究

从威海市玛珈山上获得毛栓菌（Trametes trogii）,在对其产酶条件研究的基础上,主要研究pH、温度、无机离子对毛栓菌木聚糖酶活性和稳定性的影响,以及该酶底物浓度效应和Km值测定。结果表明：在pH 6.81左右酶活性最高,pH在5.60-9.18范围内体现较强的稳定性.最适酶解温度为40℃,酶液在50℃以下有较好的热稳定性,Na^＋、Mn^2＋对木聚糖酶有激活作用,而Cu^2＋、Fe^3＋、Ca^2＋则抑制木聚糖酶活性,表观Km值为1.25×10^-2g·L^-1。     

嗜热木聚糖酶酶学性质研究

[目的]研究嗜热木聚糖酶的酶学性质.[方法]考察了基因工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64所产嗜热木聚糖酶反应的最适温度、最适pH,嗜热木聚糖酶的热稳定性、pH稳定性,以及不同金属离子对酶活力的影响.[结果]嗜热木聚糖酶的最适反应温度为110℃左右,最适pH为6.6,具有较广的pH稳定范围和非常好的热稳定性,高浓度的Mn2+、Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,Cu2+、Zn2+以及低浓度的Mn2+对该酶有抑制作用.[结论]研究可为嗜热木聚糖酶的广泛应用提供参考依据.     

Expression and Characterization of a Thermostable Xylanase Gene xynA from a Themophilic Fungus in Pichia pastoris

The gene of xylanase (xynA) was amplified by RT-PCR from the total RNA of a themophilic fungus Thermomyces lanuginosus SY2. The sequence analysis showed that gene coding region of mature peptide contained 0.585 kb, which coded 194amino acids. The putative amino acid sequence and DNA sequence of xylanase from T. lanuginosus SY2 (GenBank no.:GU166389) were 98.97 and 99.49% identical to the other T. lanuginosus (GenBank no.: U35436). A recombinant plasmid pPIC9K-xynA was constructed by inserting gene xynA into Pichia pastoris secretory vector pPIC9K. Linearized pPIC9K-xynA was transformed into P. pastoris GS115 with the method of electroporation. The recombinant strain was identified by G418 selection and confirmed by PCR analysis. It was induced by 1.0% methanol at 28℃ to express the recombinant xylanase. The results showed that the recombinant xylanase was secreted into extracellular fermentation liquid. The highest enzyme activity of 113.5 IU mL-1 and protein content of 889.7 μg mL-1 were detected for 216 h of induction. The optimal pH value and temperature of the enzyme activity was 5.5 and 65℃, respectively. The xylanase activity retained above 80% from pH value 2.5 to 8.5 for 48 h. The enzyme activity was above 85% at incubation temperature of 55℃.     

赭绿青霉 Sp1菌株木聚糖酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

[目的]从土壤中分离筛选获得了一株具有高产木聚糖酶能力的真菌Sp1.[方法]经过28S rDNA测序鉴定为赭绿青霉(Penicillium ochro-chloron ).通过对摇瓶发酵条件优化试验及酶特性研究.[结果]该菌株的最适产酶条件为:2;(W/V)粗制木聚糖+0.5;葡萄糖为碳源,0.44; KNO3+0.06;蛋白胨为氮源,发酵起始pH为5.0,150 mL三角瓶装液量为40 mL,转速为220 r/min,28 ℃下培养72 h木聚糖酶酶活可达387 U/mL.将菌株Sp1发酵所得粗酶液经过纯化后研究其酶学特性,酶最适反应pH为4.0,最适反应温度为55 ℃,在40 ℃,pH 2.2～6.0,酶活性稳定.终浓度为0.01 mol/L的Na+ 、K+ 和Zn2+ 对酶活有促进作用.[结论]所筛选的Sp1菌株具有较好的应用前景.     

产木聚糖酶菌株的分离及木聚糖酶的固定化

从草鱼肠道中分离筛选出6株产木聚糖酶的菌株,从中挑选产酶量最大的菌株测定酶液活力,并采用壳聚糖、海藻酸钠等固定游离酶.结果表明,与游离酶相比,壳聚糖固定酶的最适pH向碱性方向偏移,海藻酸钠固定酶的最适pH向酸性方向偏移.与游离酶相比,固定化酶有较高的最适温度和较强的热稳定性.     

木聚糖酶的特性研究

对里氏木霉GXC菌株所产的木聚糖酶特性作了研究.结果表明:该酶的最适温度为55℃,最适pH5.3.pH稳定范围较广,热稳定性在40℃以下.酶的最大反应速度为526μmol/(min*mg)，米氏常数为3.42mg/mL.Cu2+，Zn2+,Fe2+和Fe3+对酶有抑制作用,而Co2+和Mn2+能提高酶的活性.     

酸性木聚糖酶产生菌株的筛选和酶学性质分析

【目的】从自然环境筛选出可用于饲料工业加工用途的酸性木聚糖酶产生菌株。【方法】通过富集培养定向筛选技术,从土壤中分离获得18株产木聚糖酶菌株,挑选其中5株进行摇瓶发酵。对产酶最高的菌株S8-3进行初步鉴定,同时分析该菌株产生的木聚糖酶的酶学性质。【结果】经初步鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger);该菌株发酵液的木聚糖酶活性高达628.43 U•mL-1;木聚糖酶的最适作用温度为45℃,最适pH为4.5,在70℃保温30 min后酶活力仍为60%以上,在 pH 3.0—7.0内稳定性较好。【结论】预期该菌株产的木聚糖酶具有用于饲料添加剂的潜力。