绵羊肺炎支原体P208蛋白质的分子特征分析及免疫原性

为了研究绵羊肺炎支原体P208蛋白质的结构及功能,本试验在对p208基因进行生物信息学分析的基础上,对其部分基因片段进行了克隆及原核表达,并采用Western-blot对其免疫原性进行分析。结果显示,p208基因与猪肺炎支原体黏附素p216基因、殊异支原体细胞表面蛋白基因以及絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因具有较高的同源性。重组P208蛋白以可溶性形式在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌中成功得到表达;纯化的重组蛋白与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P208蛋白质是绵羊肺炎支原体的免疫原之一。研究结果为进一步分析其功能及其应用提供了重要的依据。     

盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响

为研究盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白对体外绵羊肺炎支原体感染的影响,首先分离试验羊的淋巴细胞,分别将盘羊、巴什拜羊及其杂交羊重组ISG15蛋白和绵羊肺炎支原体加入体外培养的淋巴细胞中共同孵育,利用real-time PCR技术检测肺炎支原体16SrRNA的表达水平。结果表明,体外淋巴细胞与绵羊肺炎支原体、重组ISG15蛋白共培养12h到96h,盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平显著低于对照组(P0.05),而杂交羊重组ISG15蛋白组的肺炎支原体的16SrRNA表达水平与对照组差异不显著(P0.05)。说明盘羊和巴什拜羊重组ISG15蛋白在体外可对绵羊肺炎支原体起到抑制作用。     

绵羊肺炎支原体贵州株P113基因的克隆与生物信息学分析

为获得绵羊肺炎支原体贵州株P113基因生物信息学特征,应用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具对其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、结构和功能进行预测分析。结果显示,绵羊肺炎支原体GZ-QX1株P113基因序列大小为3 240bp,编码1 079个氨基酸,与绵羊肺炎支原体Y98标准株、四川SC01株、猪肺炎支原体P97、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种的核苷酸序列同源性分别为99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子质量约119ku的碱性蛋白,具有较多优势抗原表位;蛋白结构分析显示,P113蛋白无跨膜结构,有9个N糖基化位点,59个丝氨酸、16个苏氨酸的磷酸化位点,14种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点;蛋白功能分析认为,P113可能是某信号传导通路的信号分子,也是一种具有良好抗原性的结构蛋白。     

绵羊肺炎支原体多表位融合基因MO-meAg1的构建、表达及重组蛋白免疫原性分析

为获得具有良好免疫原性的绵羊肺炎支原体(MO)重组蛋白,利用ABCpred等软件预测分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合基因MO-meAg1,合成后将其亚克隆至表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-32a(+)-MO-meAg1。将pET-32a(+)-MOmeAg1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDSPAGE结果显示,MO-meAg1重组蛋白分子质量约34.5ku;Western blot分析结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,重组蛋白MO-meAg1具有较强的免疫原性,诱导机体产生的抗血清其间接血凝效价可达1∶128以上。获得的多表位融合蛋白MO-meAg1为绵羊支原体肺炎的免疫学诊断及新型疫苗研究奠定基础。     

绵羊肺炎支原体 p113 基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.     

猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用(英文)

[目的]研究猪肺炎支原体P97R1基因在毕赤酵母中的分泌表达及初步应用。[方法]根据Genbank中猪肺炎支原体P97R1基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白P97R1基因,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P97R1;PICZα-A-P97R1经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株GS115;将PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P97R1蛋白于发酵上清液中,并通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting对其进行鉴定。[结果]P97R1蛋白基因获得了分泌性表达,表达量达499μg/ml,而且具有良好的反应原性;同时用表达蛋白经过各项优化建立了猪肺炎支原体间接ELISA检测方法,经检测该方法具有良好的特异性和重复性。[结论]该研究为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达

通过引物定点突变PCR法,扩增了猪肺炎支原体(Mhp)168株黏附因子P97基因抗原决定簇R1区基因片段,并将该基因片段插入表达载体pET-32 a( )中构建重组质粒,再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。DNA序列分析结果表明所构建的重组质粒含有正确的目的基因。经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h,重组质粒表达的目的蛋白量可达到总蛋白的23%。W estern b lotting和ELISA试验结果证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性。     

绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。     

猪肺炎支原体不同毒力株黏附因子基因序列分析

将猪肺炎支原体不同毒力株培养获得菌体,提取基因组DNA,PCR扩增黏附因子P97基因,对PCR产物进行测序,将猪肺炎支原体不同毒力株的P97基因序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比较,分析猪肺炎支原体黏附因子P97基因变化与致病性的关系。结果表明,猪肺炎支原体黏附因子P97基因与菌株致病性有一定关系,但除P97基因之外,还有其他与致病有关的基因存在。     

猪肺炎支原体P36基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中猪肺炎支原体P36基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增出猪肺炎支原体特异性蛋白基冈P36,克隆入酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-P36.PICZα-A-P36经Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33.PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌P36蛋白于发酵卜清液中,通过SDS-PAGE电泳以及Western-blotting进行鉴定,结果表明,P36蛋白基因获得了分泌性表达,而且具有良好的反应原性,这为猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制奠定了基础.