猪源奇异变形杆菌分离与鉴定及16S rRNA基因序列同源性分析

为了解奇异变形杆菌在猪群中感染情况,2016年9-12月从河南省规模化猪场采集病料,进行奇异变形杆菌的分离、鉴定及药敏试验;将分离菌株16SrRNA基因序列与GenBlank中其他不同来源且同源性匹配较高的奇异变形杆菌菌株构建系统发育树。结果表明:从河南省规模化猪场18起病例中,共分离3株奇异变形杆菌,分别命名为Ly、Ymh和Hbqx;与其他12株奇异变形杆菌的同源性分别为99.1%~99.4%、99.4%~99.8%和99.4%~99.9%,Ly、Ymh和HbqX间同源性为99.3%~99.4%。其中,Ly与KF051776(中国深圳株)、KC456539(中国云南株)同源性最高,为99.4%;Ymh与HQ259932(中国河北株)同源性最高,为99.8%;Hbqx与KC456539(中国云南株)同源性最高,为99.9%。3株奇异变形杆菌对青霉素、氨苄西林、卡那霉素、阿莫西林、多西环素、恩诺沙星、多粘菌素、氯霉素、萘啶酸和磺胺异恶唑均耐药,对其他药物耐药性不同。     

水产品中8株特殊生化型奇异变形杆菌的分离鉴定

[目的]探讨水产品中8株特殊生化型奇异变形杆菌的分离与鉴定。[方法]从8个批次的鱼粉和冻黄鳍金枪鱼样品中分离到8个菌株,通过表型观察、生化鉴定和16s rDNA及rpoB系统进化分析对其进行了鉴定,并对细菌鉴定的方法选择、减少变形杆菌检测鉴定偏差进行了探讨。[结果]从水产样品中分离的8个菌株经鉴定确认为奇异变形杆菌,且它们的生化特征与典型菌株均存在差异。其中,64285等6个菌株鉴定为KCN阴性的奇异变形杆菌,64284菌株鉴定为KCN阴性、木糖阴性的奇异变形杆菌,20932菌株鉴定为鸟氨酸脱羧酶阴性、KCN阴性的奇异变形杆菌,它与典型的奇异变形杆菌相差较大,是一种非常罕见的生化型。[结论]该研究为变形杆菌的准确鉴定以及预防因其引起的疾病提供科学依据。     

EDTA对黏菌素体外抗菌活性的影响

采用微量肉汤稀释法研究了膜通透性促进剂EDTA对黏菌素体外抗菌活性的影响。结果表明:经PCR扩增,在受试的85株沙门菌和大肠杆菌菌株中,有23株检测到mcr-1基因,但未检出mcr-2～mcr-10阳性菌株; EDTA可增强除天然耐药的奇异变形杆菌和摩氏摩根菌以外的所有菌株(mcr-1阳性菌株、mcr-1阴性菌株和标准株)对黏菌素的敏感性,且增强黏菌素抗菌活性的作用随EDTA浓度的加大而增强;与60、30 mg/L的EDTA联用后,黏菌素对分离菌株的最小抑菌浓度(MICs)均显著降低,且沙门菌和大肠杆菌对黏菌素的耐药率均显著下降。因此,EDTA在≥30 mg/L的浓度下,可有效增强黏菌素对mcr-1阳性和mcr-1阴性菌株的抗菌活性。     

兔多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性研究

从病死兔肝脏中分离获得1株两极着色、革兰氏阴性球杆菌,根据发病情况、病理变化、菌株形态特征、培养特性、生理生化特性及其16S rRNA序列测定结果,确定为兔多杀性巴氏杆菌。通过动物试验证实,该分离菌株具有较强的致病性;药敏特性检测结果表明,该分离菌株对常用抗生素有较强的耐药性,在所检测的22种抗生素中仅对氟苯尼考、头孢氨苄、磺胺六甲氧嘧啶、头孢噻肟、洛美沙星、菌必治等8种抗生素高度敏感,因此防治时应进行药敏试验筛选敏感药物;耐药基因检测发现,该分离菌株携带有多种耐药基因,与药敏试验结果一致。     

1株兔肺源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药分析

为了解四川某养兔场疑似金黄色葡萄球菌感染病例的病原菌及其药物敏感性,采集兔肺脏的化脓灶样品进行细菌分离纯化、染色镜检、培养特性、生化试验、16SrDNA序列鉴定及分离菌株的药敏试验和耐药基因检测。结果表明,分离鉴定出1株对小鼠具有致病性的金黄色葡萄球菌,药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌分离菌株具有多重耐药性,仅对头孢哌酮、头孢拉定、头孢噻吩、哌拉西林4种药物敏感,其他15种药物均耐受。耐药基因PCR检测结果显示,meca、aac(6′)/aph(2′)、 aph(3′)-III、 ant(4′,4′′)、 plw043耐药基因呈阳性,耐药表型和基因型相一致。     

禽源奇异变形杆菌超广谱β-内酰胺酶基因的分子特征

【目的】研究禽源奇异变形杆菌携带超广谱β-内胺酰酶基因的亚型和blaCTX-M基因的上下游环境。【方法】对分离、鉴定的奇异变形杆菌进行药物敏感性试验、ESBLs产酶确证试验、耐药基因检测和接合试验;利用PCR定位技术（PCR mapping）分析blaCTX-M的基因环境。【结果】ESBLs确证试验表明,21株禽源奇异变形杆菌有10株是阳性表型。PCR扩增和测序结果表明,最常见的ESBL基因是blaCTX-M-14 (n=6) , blaOXA-1 (n=6), 其次是blaCTX-M-65 (n=4),同时也检测到了blaOXA-10 (n=1),没有检测到blaSHV。序列分析表明,禽源奇异变形杆菌携带blaCTX-M的上游普遍存在ISEcp1B,下游均为IS903D。【结论】首次在禽源奇异变形杆菌中检测到了blaCTX-M-65,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因在禽源奇异变形杆菌中已不在少见。     

鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素耐药性及耐药基因检测

为更好地了解鸡源致病性大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因分布,从陕西省部分规模化养鸡场的病、死鸡中经分离鉴定得到158株致病性大肠杆菌。采用K-B药敏纸片法检测致病性大肠杆菌分离株对4种四环素类药物的药敏性,PCR方法检测3种四环素类耐药基因,用DNAStar软件对获得的耐药基因序列与GenBank中的相关序列进行比对。结果显示,鸡源致病性E.coli分离株对四环素、金霉素、土霉素以及多西环素的耐药率分别为88.6%、77.2%、87.3%、50.6%,3重以上耐药菌株占78.5%。四环素类耐药基因tetA、tetB的检出率分别为81.4%、20.7%,未检测到tetC基因。结果表明,鸡源致病性E.coli对四环素类抗生素普遍具有耐药性,且以多重耐药为主;耐药基因tetA的检出率与其耐药性呈正相关。     

禽源奇异变形杆菌质粒介导AmpC酶基因型检测与质粒分析

【目的】研究禽源奇异变形杆菌携带ampC基因的分型和bla_CMY-2阳性接合质粒pC12的序列结构,为防控多重耐药禽源奇异变形杆菌的传播提供理论基础。【方法】利用头孢西丁三维试验和PCR方法对21株奇异变形杆菌进行AmpC酶的检测和基因分型研究;对bla_CMY-2阳性菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和接合试验;利用高通量测序技术获得pC12的核苷酸序列并进行比较分析。【结果】头孢西丁三维试验表明21株禽源奇异变形杆菌中有6株产AmpC酶。6株产AmpC酶奇异变形杆菌对氨苄西林、头孢西丁、多西环素、氟苯尼考、粘菌素全部耐药,而对头孢他啶、阿米卡星全部敏感。耐药基因PCR扩增和测序结果表明,6株菌均携带bla_CMY-2,检出率为28.6%。接合试验表明,1株奇异变形杆菌C12接合成功并获得接合子,其余5株接合不成功。PFGE分型结果表明,酶切图谱分为3个型别,bla_CMY-2在禽源变形杆菌中存在垂直和水平传播。测序结果表明菌株C12含有一个1b型IncC质粒,其全长161 319 bp,GC含量为52.45%,预测有161个开放阅读框,提交NCBI并获得序列号MT320534。该质粒包含3个耐药区：第一个抗生素耐药区（antibiotic resistance islands,ARI-B）携带floR、tet(A)、strA、strB和sul2;第二个耐药区是一个典型的ISEcp1-bla_CMY-2-blc-sugE结构,其中的ISEcp1被一个插入的IS10R截断;第三个耐药区（ARI-A）是一个杂合的Tn1696tnp-pDUmer转座子,包含一个1类整合子基因盒（aac(6')-Ib-cr|arr3|dfrA27|aadA16）和汞抗性基因簇merEDBAPTR,其插入到质粒骨架产生两个重复序列TTGTA,该耐药区也是1型IncC耐药区变化最大的区域。【结论】6株产AmpC酶禽源奇异变形杆菌均携带bla_CMY-2,其酶切图谱分为3个PFGE型别,其中一株菌携带了一个流行的bla_CMY-2阳性1型IncC可接合质粒。广宿主的IncC质粒是bla_CMY-2、tet(A)、floR等多个耐药基因及整合子的重要载体之一,该质粒在动物源奇异变形杆菌的传播扩散进一步增加了治疗该菌感染的难度,应引起足够的重视。     

山东规模化兔场致病性大肠杆菌耐药性分析

为探寻规模化兔场肉兔腹泻病频发的原因,笔者从山东青岛、潍坊、临沂、莱芜四地区,分离到22株致病性大肠杆菌,对分离菌株进行了同源性和抗生素耐药分析,发现所分离22株致病性大肠杆菌同源性具有明显的地域性,8重耐药菌株占比18.18%,7重耐药菌株和6重耐药菌株占比均为22.73%,占比22.73%,5重耐药菌株占比高达59.09%。可见,山东地区规模化兔场大肠杆菌已出现严重耐药性,这也是兔场腹泻病频发的主要原因之一。     

郑州市售畜禽肉中分离菌对β-内酰胺类的耐药及毒力特征

采用微量肉汤稀释等方法分离鉴定了郑州市市售83份猪肉样和56份鸡肉样中的细菌,并研究了这些细菌对β-内酰胺类药物的耐药性及所携带的毒力基因。分别从47.0%的猪肉样和66.1%的鸡肉样中检出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或奇异变形杆菌。这4种分离菌对氨苄西林、头孢噻呋、头孢噻肟和头孢他啶均呈现出一定的耐药性,其中奇异变形杆菌的耐药性最强。PCR检测及序列分析结果表明:大肠杆菌主要携带TEM和CTX-M基因。毒力基因的检测结果显示:5株产CTX-M大肠杆菌携带的毒力基因种类均在5种以上。     

郑州市售畜禽肉中分离菌对β-内酰胺类的耐药及毒力特征

采用微量肉汤稀释等方法分离鉴定了郑州市市售83份猪肉样和56份鸡肉样中的细菌,并研究了这些细菌对β-内酰胺类药物的耐药性及所携带的毒力基因。分别从47.0%的猪肉样和66.1%的鸡肉样中检出大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或奇异变形杆菌。这4种分离菌对氨苄西林、头孢噻呋、头孢噻肟和头孢他啶均呈现出一定的耐药性,其中奇异变形杆菌的耐药性最强。PCR检测及序列分析结果表明:大肠杆菌主要携带TEM和CTX-M基因。毒力基因的检测结果显示:5株产CTX-M大肠杆菌携带的毒力基因种类均在5种以上。     

东北地区猪大肠杆菌mcr-1与多重耐药表型的相关性

2017年,本实验室从东北三省分离收集猪大肠杆菌239株,检测受试菌株对13种抗菌药物的多重耐药表型及耐黏菌素菌株的mcr-1携带率,并分析两者之间的相关性。结果发现有112株菌检出mcr-1,检出率为46.9%(112/239),有9株对黏菌素耐药的菌株未检出mcr-1。mcr-1阳性菌株对头孢噻呋、头孢喹肟、庆大霉素、阿米卡星、多西环素、氟苯尼考、黏菌素、恩诺沙星和乙酰甲喹的耐药率均极显著高于mcr-1阴性菌。结论:mcr-1耐药基因与猪大肠杆菌的多重耐药表型特征具有明显的相关性。     

山东省肉鸡养殖场大肠杆菌的分离鉴定及抗药性监测

近年来,由于抗菌药物广泛应用于动物和人类疾病的治疗和预防,导致各种细菌对抗生素的抗性急剧增加,尤其是大肠杆菌的多重耐药性。为了解山东省肉鸡养殖场大肠杆菌的抗药性情况,本研究于2018—2019年从山东省3个规模化养鸡场采集123份新鲜粪便样品,对其进行大肠杆菌的分离和鉴定,并利用微量肉汤稀释法对大肠杆菌分离株进行药敏试验。结果显示,从123份新鲜粪便样品中共分离到123株大肠杆菌;全部分离株对多西环素耐药,对美罗培南敏感。大肠杆菌多重耐药率为99.2%,对9种抗生素耐药的菌株多达34株。本研究结果可为养鸡场中抗生素的规范使用提供理论依据。     

猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性研究

为测定猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性和相关耐药基因分布特点,分析分离株对大环内酯类抗生素耐药的分子机制。从河南等7省份不同猪场采集来的疑似猪链球菌患病猪的脑脊液、关节液、肝等部位分离、纯化疑似菌落,采用镜检、16S rRNA基因方法鉴定猪链球菌。采用肉汤微量稀释法检测分离猪链球菌对大环内酯类抗生素红霉素、泰乐菌素、替米考星的耐药情况,采用PCR方法检测相关耐药基因(包括编码核糖体甲基化酶的erm基因ermA、ermB、ermC、ermTR和介导外排泵机制的mefA、mefE及msrD基因)分布情况。最终从573份病料分离鉴定出猪链球菌165株,分离率为28.8%。药敏试验结果显示:猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药率高达98.1%,对红霉素、泰乐菌素、替米考星耐药率分别达96.9%、95.1%、94.5%,有153株菌株对3种抗生素同时耐药。耐药基因检测发现大环内酯类耐药基因ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA、mefE、msrD检出率分别为5.4%、81.8%、13.3%、6.6%、11.5%、7.2%、5.4%,其中ermB检出率最高。除发现有93株菌株仅携带1个耐药基因外,分别有30、17、2、1个菌株分别携带2、3、4、6个大环内酯类耐药基因。在检出耐药基因的菌株中有82.5%(118/143)的菌株仅携带erm基因,有13.9%(20/143)的菌株同时携带erm以及mef、msr基因,另有3%(5/143)的菌株仅携mef、msr基因。猪链球菌对大环内酯类药物广泛耐药,大环内酯类耐药基因在猪链球菌中广泛分布,细菌的耐药性和菌株耐药基因携带情况基本呈正相关。以ermB介导的核糖体23S rRNA甲基化耐药机制占主导地位,由mefA、mefE、msrD介导的外排泵机制亦存在于分离菌株中。     

丁香酚微乳对鸽源金黄色葡萄球菌临床分离耐药株 抗生素增敏作用的研究

为探讨丁香酚微乳(Eugenol microemulsion,Em)对鸽源金黄色葡萄球菌(S.aureus)临床分离耐药株的抗菌活性及与抗生素联合的作用效果.采用MALDI质谱分析法鉴定从病鸽分离的菌株类别,以ATCC29213为质控菌株,微量肉汤稀释法测定Em和6种抗生素对临床分离株的最低抑菌浓度(MICs),微量棋盘稀释法测定Em与6种抗生素联合作用的分级抑菌浓度指数(FICI),以平板计数法检测Em及其联合多西环素(doxycycline,DOX)对临床分离S.aureus耐药株生长的抑制作用.检测结果表明,分离自病鸽心脏的S.aureus(200113-J3-H1)为环丙沙星(CIP)、黏菌素(COL)、DOX和土霉素(OXY)的多重耐药菌株;Em对该菌的MIC为0.25％,与DOX、OXY、COL和CIP联合作用时均呈现协同作用(FICI=0.125～0.281),其中对DOX的增敏作用最明显,可使其MIC降低16倍;与ENR联合则表现为相加作用(FICI=0.561).此外,从病鸽肝脏分离的E.coli(200113-J2-L5)为四环素类DOX和OXY耐药菌株;沙门菌(200113-J1-H3)CIP、恩诺沙星(ENR)、卡那霉素(KAN)、COL、DOX和OXY的敏感株,Em对这两种菌的MIC均为0.031 25％.结论表明,Em对耐药菌和非耐药菌均具有显著的抑菌活性,有望成为抗生素替代药物,且可显著增强S.aureus多重耐药菌对抗生素的敏感性,这为鸽场细菌性疾病的控制提供了参考.     

大鼠粪便中奇异变形杆菌的分离

以大鼠粪便样品为试材,经多次分离培养,获得了8个特异菌落,其直径为1～2 mm,革兰氏染色阴性。以分离菌株的基因组DNA为模板,利用细菌16S rRNA通用引物对菌株进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序。结果表明,测序结果与GenBank中已报道的奇异变形杆菌(Proteus mirabikis)菌株的序列相似性为100%。结合形态学特征,初步鉴定菌株32N、36N、20A为奇异变形杆菌。奇异变形杆菌为条件致病菌,应注意避免动物粪便对水及食物的污染。     

湖南地区猪源和鸡源沙门氏菌的分离鉴定与耐药性分析

为了了解湖南地区沙门氏菌的耐药表现和基因分布情况,采集了永州、怀化、长沙等地生猪养殖场、屠宰场的猪肛门拭子样本和鸡盲肠样本进行沙门氏菌分离鉴定,并对分离的沙门氏菌进行16种常见兽用抗生素耐药性检测和血清型分析以及β-内酰胺类耐药基因型分析。结果表明:从300份猪肛门拭子样本和170份鸡盲肠样本中总计分离到沙门氏菌69株,血清凝集试验显示其中鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型,69株中的48株为鼠伤寒沙门氏菌;猪源和鸡源沙门氏菌都对四环素、氨苄西林、磺胺异恶唑具有很强的耐药性,耐药率在62%以上,其次为阿莫西林/克拉维酸、氟苯尼考,耐药率在40%左右,未有菌株对乙酰甲喹、安普霉素耐药;多重耐药性结果显示每株菌至少对1种抗生素耐药,最高出现了13重耐药菌株,尚未发现对16种抗生素全部耐药的菌株;β-内酰胺类抗生素常见耐药基因检测结果显示,耐药基因检出率普遍不高,其中Bla CTX-M检出率相对较高,为14.49%(10/69)。这表明湖南省部分地区健康来源动物样品中沙门氏菌检出率相对较高,并有一定的多重耐药情况存在,应保持监测。     

犬源大肠杆菌分离株对四环素类药物耐药性的检测

用微量肉汤倍比稀释法测定四环素类等抗菌药物对53株犬源大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(MIC),用PCR和DNA测序方法检测犬源大肠杆菌中四环素耐药基因(tet基因),了解tet基因的流行情况、分析试验菌对四环素类药物的耐药机制。结果表明:25%的分离菌呈多重耐药现象,最多对8种药物耐药。分离菌对四环素类中的土霉素、四环素、多西环素耐药率高,耐药率介于69.8%~86.1%。基因检测结果显示,犬源大肠杆菌中共检测到5种tet基因,分别为tet A、tet B、tet C、tet G、tet L基因,都属于外排泵基因,未检测到核糖体保护基因。其中tet G基因的检出率最高,共检出39株(检出率达70%),有40个菌株同时检出2种或2种以上tet基因,有3株同时检测到4种tet基因,仅有4株未检测到任何tet基因。研究表明:犬源大肠杆菌对常用抗菌药物的耐药情况十分严重,tet基因的携带率高,主动外排是犬源大肠杆菌对四环素类耐药的主要机制。     

源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性与血清型、基因型相关性分析

为了解源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌耐药性及其与血清型、基因型的相关性,在前期已鉴定血清型和ERIC基因型的基础上,采用K-B纸片法对21株沙门氏菌分离株进行21种抗生素药物敏感试验,利用PCR技术对耐药菌株进行32种耐药基因检测。结果显示,总耐药率为100%(21/21),耐2种以上抗生素的菌株占76.19%(16/21),多重耐药谱为青霉素-氨苄西林-阿莫西林-链霉素-复方新诺明,其中耐受β-内酰胺类抗生素的类别最多,耐药率最高达100%(21/21)。21株沙门氏菌均检出耐药基因,涉及blaPSE、sul1、strA、blaTEM、sul2、tetA、tetB、aph3-Ⅱa和catⅠ9种,其中blaPSE基因的检出率最高,为85.7%(8/21)。可见源自合肥地区表观健康鸡的沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药性最强,与其携带blaPSE基因有关;耐药表型测定结果与耐药基因检测结果基本一致;耐药性与具有相同来源的同一血清型、基因型相关。     

豫西地区禽源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为了解豫西地区禽源大肠杆菌的耐药情况,从豫西地区养鸡场采集130份疑似大肠杆菌病料样品,按常规方法分离细菌,对分离菌株进行生化试验、PCR鉴定、血清型鉴定及药敏试验。结果显示,共分离鉴定出98株鸡源大肠杆菌,确定86株细菌分属14个血清型,其中以O14、O141、O78、O88血清型为主,分别占分离菌株的20.93%、16.28%、13.95%、9.30%。利用K-B法药敏试验检测大肠杆菌对20种抗生素的耐药性,结果表明,分离菌对复方新诺明的耐药性最高(95.92%),其次为四环素(83.67%)、氨苄西林(81.63%)、萘啶酸(77.55%)、恩诺沙星(69.39%),对亚胺培南和多黏菌素B敏感。大部分菌株具有多重耐药性,耐药种类最多的菌株对18种抗生素耐药,9~14重耐药菌株有76株,占77.55%。可见,豫西地区禽源大肠杆菌耐药现象十分严重,严重影响了禽类大肠杆菌病的防治。