卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)热休克蛋白HSP30基因的克隆与组织表达

[目的]获得卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)HSP30基因并探讨其组织表达.[方法]采用RACE的方法从卵形鲳鲹脾组织克隆HSP30基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析在健康鱼及哈维氏弧菌感染后HSP30基因的组织表达.[结果]HSP30基因cDNA序列全长913 bp,包含5′非编码区(5′UTR)89 bp、3′非编码区(3′UTR)188 bp,开放阅读框(ORF)636 bp,编码211个氨基酸.预测其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子质量为24.1 kD,理论等电点为5.62.HSP30包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE).系统进化分析结果显示卵形鲳鲹HSP30与高体鰤(Seriola dumerili)HSP30聚为一支.卵形鲳鲹HSP30基因在各组织中均有不同程度的表达,其中肝组织中表达量最高,其次为皮肤、肌肉、脾、心、肾,其他组织的表达量较低.哈维弧菌侵染卵形鲳鲹后,肝、脾和肾组织中HSP30基因mRNA表达量均升高,肝组织中变化最显著.[结论]成功克隆了卵形鲳鲹HSP30基因,为进一步揭示卵形鲳鲹HSP30的抗菌免疫应答机制提供了理论依据.     

大足黑山羊卵泡抑素cDNA的克隆、序列分析及组织表达

 【目的】旨在克隆大足黑山羊卵泡抑素（follistatin）的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异。【方法】采用RT-PCR方法从大足黑山羊卵巢组织总RNA中克隆出follistatin的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用real-time PCR技术检测follistatin基因在不同组织中的表达。【结果】序列分析表明,大足黑山羊follistatin的cDNA序列全长为1 217 bp,包括该基因完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）1 035 bp,编码344个氨基酸。与牛的核苷酸序列比对同源性高达98%。real-time PCR结果表明,follistatin基因能在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢和垂体中检测出来,在肾脏中表达量相对较高,在垂体中表达量较低。肾脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;心脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;其余各组织间follistatin mRNA含量差异均不显著（P＞0.05）。【结论】成功克隆出大足黑山羊follistatin基因cDNA序列,该基因在肾脏中的表达高于其它组织。     

盐度突变对黄条鰤幼鱼渗透调节功能的影响

为探讨盐度突变对黄条鰤Seriola aureovittata幼鱼渗透调节功能的影响,试验设计了35、29(对照)、15、10、5、0共6个盐度组,分别将体质量为80～120 g的黄条鰤幼鱼放入不同盐度下进行120 h的盐度突变试验,分别在试验的6、12、24、48、72、96、120 h对黄条鰤幼鱼鳃丝中Na~+/K~+-ATP酶活力,尿、血浆、血清中Na~+、K~+、Cl~-含量,以及尿和血浆渗透压的变化进行测定分析,并观察了盐度急性处理对黄条鰤幼鱼存活和渗透相关组织结构的影响。结果表明:盐度0条件下,黄条鰤在25 min时出现部分死亡, 50 min时全部死亡,其他各盐度组未出现死亡;盐度5、10、15试验组随着处理时间的延长,黄条鰤鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力逐渐降低,总体上与对照组有显著性差异(P0.05),盐度35组随着处理时间的延长,鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力呈先上升后降低的趋势, 96 h后保持稳定且与48 h时无显著性差异(P0.05),各盐度组鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力在72 h或96 h后根据盐度的不同呈现"U"形分布;从尿、血浆、血清中Na~+、K~+、Cl~-浓度变化看,盐度5、10、15组,在6～72 h内各离子浓度持续降低,整体上与对照组有显著性差异(P0.05),并在96 h达到最低值后保持稳定,盐度35组随处理时间的延长各离子浓度均上升,在120 h达到峰值;从渗透压的变化看,盐度5、10和15组中尿和血浆渗透压随盐度降低和处理时间的延长显著降低(P0.05),而盐度35组尿和血浆渗透压随处理时间的延长而显著升高(P0.05),渗透压在72 h后开始趋于稳定,在各处理时间点上均显著高于对照组(P0.05);即在低盐度(5、10、15)下,随着时间的延长鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力,尿、血浆、血清中Na~+、K~+、Cl~-浓度,以及尿和血浆的渗透压均持续下降,上述大部分测定指标均在96 h后趋于稳定,而在高盐度(35)下各项指标总体呈上升的趋势;扫描电镜观察显示,与对照组相比,盐度5处理组的幼鱼鳃丝根部弯曲、小片粘连表面褶皱增多,皮肤分泌大量黏液物质,肾脏表皮露出大量颗粒状物质,而盐度35处理组损伤较轻。研究表明,黄条鰤幼鱼对盐度变化有较强的渗透调节能力,通过改变体液中离子含量及鳃丝Na~+/K~+-ATP酶活力来调节渗透压以适应环境盐度的变化。     

桔小实蝇14-3-3基因的克隆和表达谱分析

【目的】克隆桔小实蝇14-3-3蛋白的基因(Bactrocera dorsalis14-3-3,Bdor14-3-3),研究Bdor14-3-3mRNA在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其是否参与了桔小实蝇的发育过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆Bdor14-3-3;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法,研究Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其编码区长度为747 bp,编码248个氨基酸残基。氨基酸序列一致性分析表明,在昆虫纲中,桔小实蝇与刺舌蝇14-3-3蛋白的序列一致性最高,为98.8%,与豌豆蚜的序列一致性最低,为85.4%。实时荧光定量PCR分析表明,Bdor14-3-3 mRNA在桔小实蝇不同组织和发育时期都有表达;在雌虫头(去除触角)和翅中的相对表达量均较高,分别是触角的1.39和1.44倍;在雄虫胸和后足中的相对表达量均较高,分别是前足的1.28和1.23倍。在蛹的早期发育过程中Bdor14-3-3 mRNA表达量逐渐升高,到7 d蛹期相对表达量达到最高峰,是10 d蛹的4.91倍。【结论】克隆获得了Bdor14-3-3基因,其表达的14-3-3蛋白可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其在蛹的发育过程中Bdor14-3-3可能发挥着重要作用。     

西伯利亚鲟 MHCⅡβ基因克隆、组织分布及细菌感染后的表达变化

为研究鲟鱼主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因的分子特征和表达,利用RACE技术克隆获得了西伯利亚鲟Acipernser baerii MHCⅡβ cDNA序列1443 bp,包括开放阅读框(OFR)801 bp,编码184个氨基酸。Blast分析显示,由MHCⅡβcDNA基因推导的氨基酸序列同其他物种的一致性为46%～83%,通过Smart站点分析,该序列具有SMART MHC_Ⅱ_beta结构域、SMART IGc1结构域和跨膜螺旋结构域;实时定量分析表明,正常情况下MHCⅡβ mRNA在西伯利亚鲟10种组织中均有表达,其中脾、头肾和血液中表达量较高,皮肤和肉中表达量极低(P0.05);感染维氏气单胞菌Aeromonas veronii 40 h后,脾脏中MHCⅡβ mRNA的表达量显著低于未感染的对照组(P0.05),直至93 h时恢复至对照组水平且有显著性变化(P0.05)。研究表明,MHCⅡβ基因参与了西伯利亚鲟的免疫反应。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色.     

荸荠淀粉合成酶AGPase的基因克隆及表达分析

【目的】克隆荸荠ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因EdAPS1的cDNA序列,并分析其序列特征及其在荸荠不同组织和球茎发育过程中的表达情况,为研究荸荠淀粉生物合成机制提供理论依据。【方法】通过RT-PCR技术从荸荠球茎中克隆EdAPS1基因的cDNA序列,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用实时荧光定量PCR技术检测EdAPS1基因在荸荠不同组织和球茎发育过程中的表达情况。【结果】克隆获得的EdAPS1基因cDNA序列全长1716 bp,包含1个1521 bp开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。EdAPS1蛋白分子式为C_(2469)H_(3896)N_(672)O_(746)S_(23),相对分子量为55.67 kD,等电点为5.98,具有NTP_transferase和PbH1结构域。同源性和系统进化树分析结果表明,EdAPS1蛋白与不同植物相应蛋白的同源性在68.80%～86.91%,其中与油莎草相应蛋白(ALL29329.1)的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析结果表明,EdAPS1基因在荸荠不同组织中均有表达,其中在球茎的表达量最高,与在其他组织的表达量差异显著(P0.05,下同),尤其在球茎发育后期的表达量更高,且显著高于球茎其他发育时期。【结论】从荸荠中成功克隆了EdAPS1基因,可为后续阐明荸荠淀粉生物合成机制及培育高淀粉荸荠品种提供参考依据。     

木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

建鲤极长链脂酰辅酶A脱氢酶基因cDNA克隆及相关定量表达分析

[目的]克隆建鲤(Cyprinus carpio var.Jian)极长链脂酰辅酶A脱氢酶(VLCAD)基因cDNA序列,并分析其表达情况,为揭示鲤鱼脂肪酸代谢机理提供理论依据.[方法]以建鲤为研究对象,利用RT-PCR、RACE克隆VLCAD基因的cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对VLCAD基因在不同组织、脂肪源及饥饿胁迫等条件下的表达情况进行分析.[结果]扩增获得的建鲤VLCAD基因cDNA序列全长2527 bp,包括296 bp的5’非翻译区、1974bp开放阅读框(OFR)及257bp的3'非翻译区,共编码659个氨基酸;建鲤VLCAD氨基酸序列包含FAD结合位点、底物结合位点、催化位点,具有ACADs家族的特征性结构;与鲤科类斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,达94％.建鲤VLCAD基因在性腺、肌肉、肝脏、前肠、肾脏、心脏和脑中均有表达,且以心脏的表达量最高,前肠的表达量最少.鱼油和亚麻油对建鲤VLCAD基因在肝脏和肌肉中的表达无显著影响(P＞0.05),但饥饿状态下肌肉中的VLCAD基因表达量显著高于正常状态(P＜0.05).[结论]建鲤VLCAD基因在富含线粒体且脂肪酸代谢旺盛的组织器官中高效表达,对脂肪酸β氧化起调控作用,尤其在饥饿状态下对脂肪酸氧化调控作用明显增强,能促进脂肪酸分解为机体供能.     

外源肉碱对鲤鱼背肌脂肪酸组成及其CPT I基因表达的影响

【目的】研究外源肉碱对鲤鱼背肌脂肪酸组成及其CPT I基因表达的影响,为阐明肉碱调控脂肪酸代谢的机理提供理论依据。【方法】在基础饲料中分别添加0,50,100,150,200和400mg/kg L-肉碱,进行饲养试验,60d后取鲤鱼(Cyprinus carpio)背肌样品,测定其脂肪酸组成;提取鲤鱼背肌总RNA,采用同源克隆方法扩增CPT I基因的部分序列,Real-time PCR方法测定CPT I基因mRNA表达水平的变化。【结果】外源肉碱对鲤鱼背肌脂肪酸组成有显著影响(P0.05),随饲料中L-肉碱添加量的增加,鲤鱼背肌∑SFA和∑MUFA脂肪酸含量显著升高(P0.05),∑PUFA、EPA、DHA、∑n-3和∑n-6脂肪酸含量显著降低(P0.05);同源克隆扩增获得了鲤鱼CPT I基因的部分cDNA序列(GenBank注册号为JQ361077),长度为857bp,同源性分析表明其与斑马鱼(Danio rerio)的同源性为89%。鲤鱼饲料中L-肉碱添加量为150mg/kg时,CPT I基因mRNA的表达丰度最高,为对照组的4倍。【结论】本试验条件下,外源肉碱添加量为150mg/kg时,显著影响鲤鱼幼鱼背肌脂肪酸组成和提高CPTI基因mRNA表达水平。     

铁皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛(Dendrobium officinale)豆腐柴螺二烯加氧酶(premnaspirodiene oxygenase, PO)基因,分析该基因在铁皮石斛开花期不同器官及营养生长期叶片中的表达模式,以期为进一步鉴定基因功能及探讨铁皮石斛植保素的生物合成及抗病机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆DoPO基因全长cDNA序列和开放阅读框(open reading frame, ORF),利用ProtParam进行理化性质分析,使用BLAST P在线搜索氨基酸同源性,采用MEGA 6.0构建系统进化树。利用qPCR方法分析DoPO基因在铁皮石斛开花期不同器官及不同营养生长期叶片中的表达模式。【结果】DoPO基因cDNA序列全长1 704 bp,含1个编码498个氨基酸的完整阅读框。DoPO蛋白属于p450超级家族,分子量为56.914 kD,属不稳定蛋白。系统进化分析表明,DoPO与兰科植物姬蝴蝶兰(XP 020571355)和深圳拟兰(PKA52400)PO聚为一类,与姬蝴蝶兰的PO亲缘关系最近。qPCR分析结果表明,铁皮石斛开花期,DoPO基因在叶片的相对表达量极显著高于茎、根和花;叶片DoPO基因的相对表达量10月份极显著高于8月和12月,12月显著高于8月。【结论】克隆了铁皮石斛DoPO基因cDNA全长,该基因在叶片中的相对表达量极显著高于其他器官。叶片DoPO基因的相对表达量10月份最高。     

亚洲玉米螟pdp1的克隆及功能分析

【目的】克隆获得亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）蛋白酶激活受体类转录因子pdp1（protease- activated receptor-domain protein1）（Ofpdp1）cDNA序列（GenBank登录号：KC857457）,明确其基因结构特征,并进一步研究该基因的表达特性及其在生长发育过程中的作用,为亚洲玉米螟的遗传控制提供潜在的靶标基因。【方法】采用RT-PCR和PCR技术,克隆Ofpdp1 cDNA序列,利用相关软件进行生物信息学分析;利用qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction）研究卵期及幼虫期Ofpdp1表达特征;在原胚期利用RNA干扰技术（RNAi）研究其生物学功能。【结果】克隆得到基因Ofpdp1,全长为960 bp,开放阅读框804 bp,编码267个氨基酸,同源比对发现OfPDP1 C-末端与其它昆虫PAR bZIP（basic leucine zipper）转录因子非常相似,含有3个高度保守的结构域,系统发育分析的分类结果与生物学上物种分类相吻合。qPCR结果显示Ofpdp1的mRNA表达量在卵发育76 h左右存在显著的表达高峰。在亚洲玉米螟原胚期,注射Ofpdp1的双链RNA（dsRNA）48 h后,Ofpdp1 mRNA表达量被沉默了71%。【结论】成功地从亚洲玉米螟中克隆得到Ofpdp1,Ofpdp1进化非常保守,属于PAR bZIP亚家族;Ofpdp1可能在幼虫定型时期胚胎生理结构的变化过程中起到重要作用。     

大刺鳅促黄体生成素基因克隆及其组织表达分析

[目的]克隆大刺鳅(Mastacembelus armatus)促黄体生成素(LH)基因及明确其表达规律,为进一步阐明LH基因在大刺鳅性腺发育过程中的生理功能及揭示大刺鳅的生殖调控机理提供参考依据.[方法]采用RACE克隆大刺鳅LH基因cDNA全长序列,从GenBank中选择硬骨鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物等物种的LH氨基酸序列,通过ClustalX 2.1进行氨基酸序列比对,以MEGA 6.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树,并应用实时荧光定量PCR检测分析大刺鳅LH基因在不同组织及不同性腺发育期的表达情况.[结果]大刺鳅LH基因cDNA序列全长799 bp,包括224 bp的5'非编码区(5'-UTR)、131 bp的3'非编码区(3'-UTR)和444 bp的开放阅读框(ORF),共编码147个氨基酸残基,第1~22位氨基酸残基组成其信号肽区域.大刺鳅LH氨基酸序列C-末端区域高度保守,但N-末端区域与其他硬骨鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物存在明显差异.大刺鳅LH氨基酸序列与其他鱼类的LH氨基酸序列同源性较高,其中与黄鳝(Monopterus albus)的亲缘关系最近.大刺鳅LH基因在其脑组织中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05);在卵巢、心脏、肝脏和精巢中的相对表达量次之;大刺鳅LH基因在不同发育期卵巢和精巢中的表达变化趋势一致,从II期开始其相对表达量随之增加,至V期时达峰值.[结论]大刺鳅LH氨基酸序列具有高度保守区域,其基因在各组织中广泛表达,尤其在脑组织和性腺中具有较高表达量,提示LH的靶基因可能在脑—垂体—性腺轴上,参与大刺鳅的性腺发育调控,主要促进卵母细胞和精子成熟并刺激排卵或排精.     

刺五加Cu/Zn SOD的克隆及内生真菌对其表达的影响

利用RACE技术从刺五加(Eleutherococcus senticosus Harms)中克隆到铜锌型超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD)的cDNA序列.获得的刺五加Cu/Zn SOD的cDNA长641 bp.基因内部含有1个长度为459 bp的开放阅读框,编码长度为152个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为15.162 ku,理论等电点为5.29.刺五加Cu/Zn SOD氨基酸序列与其它植物的Cu/Zn SOD具有很高的相似性.相对定量RT-PCR的结果表明,回接内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1后可显著提高刺五加Cu/Zn SOD基因的表达量(P＜0.05),最大表达量出现在菌株P312-1回接60d时,达对照的4.99倍.     

急性低氧胁迫对黄条鰤抗氧化酶和磷酸酶活性的影响

[目的]探讨黄条鰤(Seriola aureovittata)在急性低氧胁迫下的应激响应机制。[方法]将体质量(621.13±63.29)g的黄条鰤置于养殖水槽中,通过药物调节水体中溶解氧含量,使其控制在(2.0±0.2)mg/L内,分别急性低氧胁迫0(对照组)、2、4和6 h,分析其肝脏和肌肉中氧化应激指标的变化。[结果]急性低氧胁迫后,黄条鰤肝脏中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性降低,与胁迫前相比差异显著(P<0.05);过氧化氢酶(CAT)活性与胁迫前相比显著升高(P<0.05);总抗氧化能力(T-AOC)随着胁迫时间的变化呈现先下降后升高的趋势;酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性都呈现先升高后下降的趋势。急性低氧胁迫后,在黄条鰤肌肉中总抗氧化能力(T-AOC)显著降低(P<0.05),而总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性则显著升高(P<0.05)。[结论]急性低氧胁迫会影响鱼体肝脏和肌肉中的抗氧化酶及磷酸酶的活性,在低氧胁迫过程中黄条鰤会通过调节抗氧化酶的活性来激活体内抗氧化防御系统,从而保护机体免受缺氧导致的氧化损伤。     

CgLOX4基因在长牡蛎幼虫发育中的表达特征

为研究长牡蛎(Crassostrea gigas)LOX4基因(CgLOX4)在幼虫发育中的表达特征,采用PCR技术扩增CgLOX4的全长cDNA序列,利用荧光定量PCR和整体免疫荧光技术检测CgLOX4在幼虫不同发育时期的表达特征。结果表明：CgLOX4的cDNA全长为1 862 bp,开放阅读框为834 bp,可编码277个氨基酸,等电点为8.36,预测其氨基酸序列只含有一个保守的HOX结构域;CgLOX4在长牡蛎成体各组织中均有表达,其中在闭壳肌中的表达量显著高于肝胰腺、鳃、血淋巴、性腺和唇瓣组织(P<0.05);CgLOX4在所检测的早期胚胎中均有表达,其中在受精卵和4细胞期的表达量相对较高;CgLOX4阳性信号主要分布在担轮幼虫壳形成区、D型幼虫内脏团和壳顶幼虫消化腺中。研究表明,CgLOX4是长牡蛎早期发育过程中较早激活的转录因子之一,可能在调控幼虫壳形成和消化器官形成等方面发挥重要作用。     

豚鼠发情周期不同时期的子宫LHR mRNA差异表达研究

 【目的】克隆豚鼠子宫黄体生成素受体(LHR)基因片段并分析其进化关系,研究豚鼠子宫LHR mRNA在发情周期不同时期的表达特性。【方法】以豚鼠子宫总RNA为模板,根据小鼠、大鼠、猪LHR保守区设计引物,RT-PCR扩增LHR基因片段。筛选阳性克隆测序,采用DNAMAN软件分析比对同源性。以?-actin为分子内参,采用优化的半定量RT-PCR技术,测定豚鼠发情周期不同时期的子宫组织LHR mRNA表达量。【结果】测序得到686 bp的剪接变异体1和缺失75 bp 4号外显子的剪接变异体2。686 bp序列与人类LHR mRNA序列同源性为83.8%,与牛、猪及绵羊LHR mRNA序列同源性分别为84.6%、84.2%及83.6%,而与大鼠和小鼠LHR mRNA序列同源性则分别高达93.7%和99.4%。LHR mRNA在豚鼠整个发情周期的子宫中都有表达,发情周期第0天的表达水平为0.635 ± 0.0194,第4天为0.617 ± 0.099,均显著低于第8天的表达水平(P＜0.05),随之在第12天升至1.218 ± 0.049。【结论】克隆的片段为豚鼠LHR基因的部分序列,其mRNA存在着剪接变异体。豚鼠子宫LHR mRNA在发情周期第0、4天表达水平较低,第12天升至最高,即发情周期不同时期的LHR mRNA表达呈现明显的规律性,该结果为探究哺乳动物非性腺组织中LHR的功能及生殖内分泌调控机制提供了理论依据。     

凡纳滨对虾COPE基因序列及低温表达分析

通过对已知耐寒候选基因-COPE基因的克隆和研究,为凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理研究提供依据。运用同源克隆和RACE-PCR技术获得凡纳滨对虾COPE基因(LvCOPE)全长cDNA序列,对其进行了生物信息学分析,采用荧光定量PCR研究了LvCOPE基因的组织表达谱及其在低温胁迫下表达量的变化。结果显示,LvCOPE cDNA全长1217 bp,包含888 bp开放阅读框,编码296个氨基酸残基,具有保守的TPR结构域。各物种COPE蛋白序列构建的系统进化树能准确反映各物种间的进化关系。Lv-COPE mRNA在各组织中呈遍在表达,在肌肉组织中表达量最高。低温表达谱分析显示,LvCOPE mRNA在低温处理对虾的肝胰腺、心、鳃、肌肉等组织中均呈下调表达,随着处理温度由15℃降至11℃度,其在肝胰腺中表达量逐渐降到最低。因此,LvCOPE在结构和进化上保守,在低温胁迫时呈下调表达,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控功能。     

小菜蛾表皮蛋白基因克隆及表达分析

[目的]克隆小菜蛾表皮蛋白基因(Plutella xylostella cuticular protein,PxyICP),分析其序列特征和发育表达模式,为深入研究PxyICP在小菜蛾表皮形成中的生理功能提供科学参考.[方法]以小菜蛾为试验材料,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆PxyICP,以生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用实时荧光定量PCR研究PxyICP mRNA在小菜蛾不同发育时期中的相对表达量.[结果]克隆获得的PxyICP基因开放阅读框长531 bp,编码177个氨基酸,相对分子质量约18.90 kD,等电点为5.32.氨基酸序列分析结果表明,小菜蛾表皮蛋白第1~16位氨基酸是参与跨膜蛋白转移的信号肽,且该序列具有昆虫表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征.不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,PxyICP在小菜蛾各发育时期的表达量不同,其中PxyICP在2、3和4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的2.43、0.51、0.63、3.19和12.32倍,以在成虫的表达量最高.[结论]成功克隆获得PxyICP基因,根据其发育表达模式推测PxyICP蛋白参与小菜蛾成虫表皮的硬化和黑化等生理过程.     

玉木耳络氨酸酶基因的克隆及表达分析

克隆获得了玉木耳络氨酸酶基因的全长cDNA序列,命名为Actyr。序列分析结果表明:其cDNA序列为1113 bp,编码371个氨基酸;相对分子量为41.11 kDa,等电点为7.64。亚细胞定位分析发现其定位于细胞质。qRT-PCR分析结果表明:Actyr基因的表达量在菌丝生长时期最低;随着玉木耳的生长发育,其表达量不断上升;到子实体直径为3 cm时,Actyr基因的表达量达到最高。